仔鼠哺乳期補(bǔ)充參苓白術(shù)散改善抗生素誘導(dǎo)的腸道穩(wěn)態(tài)失衡

張文嫦，王志華，練家樂(lè)，屈 倩，呂偉杰，陳淑愛(ài)，郭世寧*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642； 2.山東莒縣畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心，莒縣 276500)

生命早期，腸道菌群的建立是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程，而母體的營(yíng)養(yǎng)健康狀況、分娩方式和飲食的變化等[1-3]能顯著影響其仔代腸道菌群的發(fā)育及成熟。此外，從母乳轉(zhuǎn)換到固體食物(或?qū)嵤嗄?[4]及抗生素的使用[5-7]，能導(dǎo)致腸道微生物的組成發(fā)生顯著變化，特別是在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)中，仔豬、犢牛、羔羊等在早期斷奶時(shí)容易出現(xiàn)腹瀉、免疫力下降、攝食減少、生長(zhǎng)緩慢等一系列應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[8-9]；研究表明，仔畜斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的腹瀉與腸道屏障結(jié)構(gòu)破壞及功能受損有關(guān)[9]。胃腸道作為體內(nèi)最大的免疫器官，其屏障功能的正常運(yùn)行在維持機(jī)體免疫平衡中發(fā)揮重要作用。其中，腸上皮細(xì)胞中的緊密連接蛋白是構(gòu)成腸道物理屏障的主要成分，包括緊密連接蛋白Claudin、Occludin、ZO-1(Zonula occludens 1)等[10]。已有研究表明，腸道微生物可以影響腸道屏障功能[11]，如乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)以及Bacteroidesthetaiotaomicron、Akkermansiamuciniphila等新一代益生菌，這些菌屬可以通過(guò)分泌細(xì)胞外蛋白有效減弱病原體的黏附，或增加JAM-1(Junctional adhesion molecule 1)、Occludin、Claudin-1和ZO-1在內(nèi)的緊密連接蛋白的表達(dá)來(lái)保護(hù)腸道屏障，維持腸上皮穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)腸道健康[12-14]。

參苓白術(shù)散出自宋代《太平惠民和劑局方》，具有健脾益氣、滲濕止瀉之功。臨床上，參苓白術(shù)散既可以單獨(dú)使用以治療潰瘍性結(jié)腸炎，又可以與中藥復(fù)方如附子理中丸[15]、桃花湯[16]、理中湯[17]等聯(lián)合使用治療克羅恩病等腸道疾病。本研究主要目的是探討哺乳期母鼠使用抗生素對(duì)仔代腸道菌群、斷奶應(yīng)激的影響，同時(shí)觀察應(yīng)用參苓白術(shù)散能否通過(guò)改善仔鼠腸道健康而減輕早期斷奶應(yīng)激，以期為畜牧養(yǎng)殖業(yè)中調(diào)節(jié)母畜腸道穩(wěn)態(tài)，提高仔畜腸道健康提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 參苓白術(shù)散中藥飲片購(gòu)自北京同仁堂有限公司；鹽酸萬(wàn)古霉素、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、甲硝唑、硫酸新霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；ZO-1、Occludin抗體購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 妊娠SD大鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 儀器設(shè)備 MK3型酶標(biāo)儀，賽默飛(上海)儀器有限公司； EPS600電泳儀，上海天能科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分組 9只妊娠17～18 d雌性SD大鼠，隨機(jī)均分成3組，分組及處理見(jiàn)圖1，抗生素的使用劑量參考文獻(xiàn)[18]方法。

圖1 試驗(yàn)過(guò)程流程圖

1.2.2 樣品采集 分娩后第7、14和21天記錄每組仔鼠體重，第14和21天采集糞便于-80 ℃保存；仔鼠安樂(lè)死后記錄心、肝、脾、肺、腎重量；分離結(jié)腸于-80 ℃保存，同時(shí)另取0.5 cm近盲腸端結(jié)腸固定于4%甲醛溶液中，用于HE染色。

1.2.3 微生物群落多樣性組成譜研究 采用DNeasy PowerSoilKit對(duì)仔鼠糞便樣本進(jìn)行DNA抽提，并通過(guò)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量；采用F:ACTCCTACGGGAGGCAGCA、R:CGGACTACHVGGGTWTCTAAT序列對(duì)16S rRNA V3-V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)群落微生物DNA片段進(jìn)行雙端測(cè)序，使用DADA2插件對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行去引物、質(zhì)量過(guò)濾、去噪、拼接和去嵌合體等優(yōu)化，經(jīng)DADA2方法處理后的序列稱(chēng)為ASVs(amplicon sequence variants)；基于細(xì)菌16S rRNA Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)(gg_13)進(jìn)行物種注釋?zhuān)谀J(rèn)參數(shù)使用QIIME2中的Naive bayes分類(lèi)器對(duì)ASVs進(jìn)行物種分類(lèi)學(xué)分析。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)腸組織中ZO-1和Occludin的表達(dá)量 將結(jié)腸組織加入適量裂解液低溫勻漿后，12 000×g離心5 min，取上清；BCA法測(cè)定蛋白濃度，按蛋白總量10 μg每孔等體積上樣；電泳時(shí)間為70 v，30 min； 100 v，2 h；轉(zhuǎn)膜：150 mA，90 min；TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min，用5%牛血清蛋白于搖床上室溫封閉1.5 h；封閉結(jié)束后TBST洗滌3次，每次5 min；4 ℃過(guò)夜孵育一抗ZO-1(1∶1 000)、Occludin(1∶1 000)；TBST清洗3次，每次5 min，室溫孵育二抗(1∶10 000)1 h；TBST清洗3次，每次5 min，加入發(fā)光液顯影，掃描拍照。

2 結(jié) 果

2.1 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠體重的影響

對(duì)不同天數(shù)不同組別的仔鼠進(jìn)行稱(chēng)重，結(jié)果如表2所示，在第7、14和21天，與CON組相比，ABX組的仔鼠體重顯著降低(P<0.05)。第21天時(shí)，與ABX組相比，SLBZS組仔鼠的體重顯著增加(P<0.05)。

表2 各組仔鼠的體重情況

2.2 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠臟器指數(shù)的影響

如表3所示，在第21天時(shí)，與CON組仔鼠比，ABX組及SLBZS組仔鼠的肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，ABX組仔鼠的脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與ABX組仔鼠比，SLBZS組仔鼠的脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)。

表3 第21天各組仔鼠的臟器指數(shù)

2.3 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠腸道微生物區(qū)系組成的影響

根據(jù)16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果分析，使用韋恩圖展示各組ASVs數(shù)目，在第14天時(shí)，CON組和ABX組之間共有的ASVs數(shù)目為143個(gè)，而CON組中獨(dú)有的ASVs數(shù)目為3 921個(gè)，ABX組中獨(dú)有的ASVs數(shù)目為656個(gè)(圖2a)；在第21天時(shí)，三組共有的ASVs數(shù)目為84個(gè)，CON組與ABX組之間共有的ASVs數(shù)目為38個(gè)，CON組與SLBZS組之間共有的ASVs數(shù)目為122個(gè)，ABX組與SLBZS組之間共有的ASVs數(shù)目為1 004個(gè)(圖2b)。樣品的稀疏曲線(Rarefaction Curve)趨于平緩(圖2c)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，滿(mǎn)足測(cè)序要求，物種的豐富度較高，物種分布均勻。在第14天時(shí)，與CON組相比，ABX組的微生物群落在綱、目、科、屬、種五種分類(lèi)水平上的單元數(shù)均顯著降低(P<0.05，表4)。在第21天時(shí)，與CON組相比，ABX組與SLBZS組的微生物群落在門(mén)、綱、目、科、屬五種分類(lèi)水平中的單元數(shù)均顯著降低(P<0.05)，而SLBZS組的微生物群落在種分類(lèi)水平中的單元數(shù)有所增加(表5)。

表4 第14天各水平微生物分類(lèi)單元數(shù)統(tǒng)計(jì)表

表5 第21天各水平微生物分類(lèi)單元數(shù)統(tǒng)計(jì)表

a、b. 第14和第21天ASVs韋恩圖；c. 第14和第21天稀疏曲線

2.4 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠腸道微生物區(qū)系多樣性的影響

選取Chao1、Observed species、Shannon、Simpson等指數(shù)評(píng)估微生物群落的α多樣性。結(jié)果顯示，在第14天時(shí)，ABX組微生物群落的Chao1、Observed species、Shannon、Simpson指數(shù)顯著低于CON組(P<0.05，圖3a)。第21天時(shí)，ABX組微生物群落的Chao1、Observed species指數(shù)顯著低于CON組(P<0.05)，Shannon、Simpson指數(shù)差異不顯著(圖3b)。此外，與ABX組比，SLBZS組Chao1、Observed species指數(shù)顯著升高(P<0.05)，Shannon、Simpson指數(shù)差異不顯著(圖3c)。通過(guò)主坐標(biāo)分析(Principal coordinate analysis，PCoA)對(duì)多維的微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行β多樣性分析，結(jié)果顯示，在第14天時(shí)，距離矩陣的比例為51.2%時(shí)能將CON組與ABX組樣本分開(kāi)(圖3 d)；在第21天時(shí)，距離矩陣的比例為30.5%時(shí)能將CON組與其余兩組分開(kāi)，距離矩陣的比例為16.5%時(shí)能將ABX組和SLBZS組分開(kāi)。以上結(jié)果說(shuō)明CON組、ABX組與SLBZS組樣品中的微生物的多樣性存在差異(圖3e)。

a、b、c: 第14和21天Alpha多樣性指數(shù)的分組箱線圖；d、e: 第14和21天PCoA分析二維排序圖；* 表示 P <0.05，** 表示 P<0.01

2.5 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠腸道微生物物種在門(mén)、屬水平顯著差異性的影響

第14天時(shí)，在門(mén)水平上，ABX組仔鼠糞便樣本中Firmicutes和Bacteroidetes的相對(duì)豐度低于CON組，而Proteobacteria的相對(duì)豐度高于CON組(圖4a)；在屬水平上，ABX組中Lactobacillus、Shigella的相對(duì)豐度高于CON組，而B(niǎo)acteroides、Blautia等菌屬的相對(duì)豐度低于CON組(圖4b)。第21天時(shí)，在門(mén)水平上，ABX組仔鼠糞便樣本中Firmicutes和Bacteroidetes的相對(duì)豐度低于CON組，而Proteobacteria的相對(duì)豐度高于CON組(圖4c)；與ABX組仔鼠比，SLBZS組仔鼠糞便樣本中Firmicutes的相對(duì)豐度明顯升高，Proteobacteria的相對(duì)豐度明顯降低(圖4c)；此外，在SLBZS組仔鼠糞便樣本中Verrucomicrobia的相對(duì)豐度明顯高于CON組與ABX組(圖4c)。在屬水平上，ABX組仔鼠糞便樣本中Shigella、Sutterella、Enterococcus等菌屬的相對(duì)豐度高于CON組，而Lactobacillus、Prevotella、Blautia等菌屬的相對(duì)豐度低于CON組(圖4 d)；與ABX組仔鼠比，SLBZS組仔鼠糞便樣本中Shigella、Sutterella、Enterococcus等菌屬的相對(duì)豐度降低，Lactobacillus、Clostridiaceae_Clostridium、Blautia等菌屬的相對(duì)豐度升高，且在SLBZS組中觀察到Akkermansia的相對(duì)豐度明顯升高(圖4 d)。

采用LEfSe(LDA Effect Size)分析方法對(duì)不同組樣本間在所有分類(lèi)水平上進(jìn)行差異性比較分析，并以LDA score柱狀圖展示每個(gè)組內(nèi)顯著富集的物種。結(jié)果顯示，第14天時(shí)，在CON組與ABX組間(LDA閾值為3時(shí))共有45個(gè)差異項(xiàng)，其中在ABX組中富集的有g(shù)_Aggregatibacter、f_Enterobacteriaceae_g_Pseudomonas等8個(gè)；在CON組中富集的有p_Bacteroidetes、g_Bacteroides、g_Blautia,g_Bifdobacterium、g_Akkermansia等37個(gè)(圖4e)。第21天時(shí)，在CON組、ABX組及SLBZS組中(LDA閾值為4時(shí))共有37個(gè)差異項(xiàng)，其中在ABX組中富集的有p_Proteobacteria、c_Gammaproteobacteria、c_Betaproteobacteria、g_Enterococcus、g_Shigella、g_Sutterella等14個(gè)；在CON組中富集的有p_Bacteroidetes、g_Prevotella、g_Paraprevotella、g_Bacteroides等11個(gè)；在SLBZS組中富集的有p_Verrucomicrobia、g_Eubacterium、g_Akkermansia、g_Clostridium等14個(gè)(圖4f)。

a.第14天各組門(mén)水平相對(duì)豐度柱狀圖；b. 第14天各組屬水平相對(duì)豐度柱狀圖；c. 第21天各組門(mén)水平相對(duì)豐度柱狀圖；d. 第21天各組屬水平相對(duì)豐度柱狀圖；e. 第14天LDA score柱狀圖；f. 第21天LDA score柱狀圖

2.6 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠結(jié)腸中Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)的影響

第14天ABX組仔鼠結(jié)腸中Occludin蛋白表達(dá)量顯著低于CON組(P<0.05，圖5a)，ZO-1蛋白表達(dá)情況無(wú)顯著差異(P>0.05，圖5c)。第21天ABX組中的仔鼠結(jié)腸中ZO-1、Occludin的表達(dá)量顯著低于CON組(P<0.05)，SLBZS組中的仔鼠結(jié)腸中ZO-1、Occludin的表達(dá)量顯著高于ABX組(P<0.05，圖5b、5d)。

a.第14天仔鼠結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin表達(dá)量；b.第21天Occludin蛋白表達(dá)量；c.第14天ZO-1蛋白表達(dá)量；d.第21天ZO-1蛋白表達(dá)量。左邊為蛋白表達(dá)灰度圖，右邊為灰度分析柱狀圖。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.7 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

結(jié)腸組織切片結(jié)果顯示，CON組仔鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，且排列整齊、連續(xù)性好，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；ABX組仔鼠結(jié)腸組織有明顯的炎性細(xì)胞增生浸潤(rùn)(圖中紅色圈所指)；給仔鼠灌胃參苓白術(shù)散后炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕(圖6)。

圖中紅色圈中提示出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

3 討 論

在生命早期，幼崽出現(xiàn)腸道感染的幾率較高，而其中一個(gè)重要的原因是幼崽腸道菌群發(fā)育的不成熟，不能有效地防止病原體在腸道中的定植。此外，仔代腸道菌群的早期建立在很大程度上受到母體菌群的影響，研究發(fā)現(xiàn)，哺乳期給母鼠連續(xù)使用萬(wàn)古霉素能顯著降低母乳菌群的α多樣性，同時(shí)其后代仔鼠腸道菌群的α多樣性也顯著下降，并伴隨著脾中B細(xì)胞數(shù)量顯著下降[19]，這可能降低新生仔鼠對(duì)病毒的抵抗力[20]。與此相似，在本試驗(yàn)結(jié)果中，對(duì)哺乳期的母鼠使用抗生素，顯著降低其仔代腸道微生物的α多樣性及各分類(lèi)水平上的物種單元數(shù)，增加Shigella、Sutterella、Enterococcus等有害菌屬的相對(duì)豐度，并下調(diào)仔鼠結(jié)腸緊密連接蛋白的表達(dá)，這可能導(dǎo)致結(jié)腸上皮中有害菌的易位從而增加其仔代患腸道炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，參苓白術(shù)散可以恢復(fù)脾虛模型小鼠的黏膜層厚度及增加腸腺數(shù)目[21]，上調(diào)CD(Crohn’s disease)模型大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白中Claudin-1蛋白的表達(dá)[22]，還可以調(diào)節(jié)腸道菌群，增加有益菌如雙歧桿菌的豐度并降低病原菌如腸球菌的豐度，提高宿主腸道黏膜對(duì)致病菌定植的抵抗能力[23]。與他人研究結(jié)果相似，本研究也發(fā)現(xiàn)給仔鼠灌胃參苓白術(shù)散水煎液后，仔鼠腸道微生物中乳桿菌屬(Lactobacillus)和嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)等有益菌屬的相對(duì)豐度升高，腸道屏障功能得到改善。

3.1 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠體重及臟器指數(shù)的影響

在腸道菌群正常的發(fā)育過(guò)程中，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)始終作為優(yōu)勢(shì)菌群，厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比例失衡能引起仔鼠糖代謝與脂代謝的失調(diào)，從而影響仔鼠的正常發(fā)育與體重的變化[24-26]，本研究中，ABX組仔鼠體重的顯著降低可能與其厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低有關(guān)，而對(duì)仔鼠灌胃參苓白術(shù)散后其體重得以恢復(fù)則可能與其厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度升高有關(guān)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)不良兒童腸道微生物中變形菌門(mén)顯著富集，而擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度則顯著降低[27]，本試驗(yàn)中，仔鼠在接受參苓白術(shù)散治療后厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度升高，與此相對(duì)應(yīng)，SLBZS組仔鼠的體重恢復(fù)至正常水平，此外，參苓白術(shù)散灌胃后還降低了變形菌門(mén)的的相對(duì)豐度，但沒(méi)有恢復(fù)擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，分析原因可能是在斷奶前后，由于變形菌門(mén)豐度的增多改變了仔鼠的腸道環(huán)境，如pH和氧氣濃度等，而腸道免疫系統(tǒng)尚未完善，無(wú)法調(diào)節(jié)腸道的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致擬桿菌門(mén)中的微生物無(wú)法在腸道定植[28]。脾是一個(gè)由結(jié)締組織和淋巴組織組成的復(fù)雜的外周淋巴器官，是多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生、定殖和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所[29]。作為動(dòng)物體內(nèi)重要的免疫器官，脾臟指數(shù)的高低可以衡量動(dòng)物機(jī)體免疫能力的強(qiáng)弱[30]。本研究中，ABX組仔鼠脾臟指數(shù)顯著低于CON組仔鼠，說(shuō)明母鼠使用抗生素可能會(huì)降低其仔代的免疫力，而使用參苓白術(shù)散治療后，脾臟指數(shù)恢復(fù)至CON組水平，說(shuō)明參苓白術(shù)散有助于促進(jìn)脾的發(fā)育并可能提高仔鼠機(jī)體的免疫力。

3.2 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠腸道微生物物種組成差異的影響

抗生素的使用能夠破壞腸道微生物群的正常定植，改變宿主腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成及生物多樣性，甚至可以在出生前損害仔代的腸道微生物群[31-32]；而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)散可治療抗生素相關(guān)性腹瀉，并對(duì)抗生素誘導(dǎo)的腸道微生物結(jié)構(gòu)變化有一定的恢復(fù)作用[33]。在本研究LEfSe分析結(jié)果中，可觀察到ABX組仔鼠糞便中出現(xiàn)有害菌屬明顯富集，如巴斯德氏菌科(f_Pasteurellaceae)、假單胞菌屬(g_Pseudomonas)、放線桿菌屬(g_Aggregatibacter)、γ變形菌綱(c_Gammaproteobacteria)、志賀氏菌屬(g_Shigella)、薩特氏菌屬(g_Sutterella)和腸球菌屬(g_Enterococcus)等，其中志賀氏菌屬、薩特氏菌屬、腸球菌屬等為已知的有害菌屬，均可引起腸道炎[34]，甚至可以破壞結(jié)腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接進(jìn)而導(dǎo)致腸上皮完整性的缺失，加重炎癥感染程度[35-36]；Pasteurellaceae和Gammaproteobacteria則與細(xì)菌耐藥性升高相關(guān)，且Gammaproteobacteria相對(duì)豐度的升高還被認(rèn)為是腸道菌群結(jié)構(gòu)被破壞的表現(xiàn)[37-38]，這表明母鼠在哺乳期使用抗生素，會(huì)導(dǎo)致其仔鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)被破壞，增加有害菌屬的定植，并可能破壞結(jié)腸上皮的完整性，從而誘發(fā)腸道炎癥。但在接受參苓白術(shù)散灌胃后，仔鼠糞便中Shigella、Sutterella、Enterococcus等腸道致病菌的相對(duì)豐度明顯降低，而乳桿菌屬(Lactobacillus)、布勞特氏菌屬(Blautia)、阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、真桿菌屬(Eubacterium)等有益菌屬的相對(duì)豐度升高，有研究表明，嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)不僅可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)黏液厚度和維持腸道屏障的完整性發(fā)揮益生作用[39]，其還可通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠腸道中的免疫細(xì)胞及免疫因子發(fā)揮抗炎功能[40]；Lactobacillus和Blautia則有助于增加糞便中丁酸的濃度，而丁酸鹽能修復(fù)高脂飲食導(dǎo)致的腸黏膜損傷，并增加腸組織中ZO-1的表達(dá)，改善腸道健康[41]；而Eubacterium則被證明參與腸道中多種重要物質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)化，如短鏈脂肪酸、膽固醇和膽汁酸等[42]。所以參苓白術(shù)散可能通過(guò)抑制有害菌屬的增殖，并通過(guò)增加產(chǎn)短鏈脂肪酸菌屬的數(shù)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，降低仔鼠患炎癥腸病的風(fēng)險(xiǎn)，達(dá)到改善仔鼠腸道健康的效果。

3.3 參苓白術(shù)散對(duì)仔鼠結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1的影響

在健康動(dòng)物腸腔表面，腸道共生菌與腸上皮細(xì)胞分泌物(如緊密連接蛋白，黏蛋白等)互作，形成一層生物保護(hù)屏障，有助于維持宿主腸道健康。然而，腸上皮緊密連接功能的破壞，可增加腸道的通透性并促進(jìn)腸道菌群易位，從而引起腸道炎癥如IBD等[43]，而腸道菌群也能影響結(jié)腸屏障的結(jié)構(gòu)和功能，如Akkermansiamuciniphila、Lactobacillus、Blautia、Bifidobacterium和Bacteroides等可以增加腸道中緊密連接蛋白的表達(dá)[44-46]。此外，Lactobacillus和Blautia在腸道中還可以通過(guò)發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸，目前短鏈脂肪酸已被證明可以通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體，抑制組蛋白去乙?；富钚裕⑾抡{(diào)促炎因子基因的表達(dá)，其中丁酸鹽還可以通過(guò)改變腸道中Claudin-2的水平來(lái)緩解TNF-α/IFN-γ等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的屏障功能障礙[47-48]。在本試驗(yàn)中，仔鼠在使用參苓白術(shù)散之后，結(jié)腸中ZO-1和Occludin的表達(dá)量顯著上升，這可能是由于灌胃參苓白術(shù)散升高了Akkermansiamuciniphila、Lactobacillus、Blautia和Eubacterium等菌群的豐度，這些微生物通過(guò)代謝使腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的含量升高，從而上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)量，改善仔鼠腸道屏障結(jié)構(gòu)的完整性。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在母鼠哺乳期使用抗生素能導(dǎo)致仔鼠腸道穩(wěn)態(tài)的失調(diào)，腸道菌群豐富度及多樣性顯著下降進(jìn)而抑制仔鼠腸道菌群的定植與成熟，影響仔鼠的腸道屏障功能，而給予仔鼠參苓白術(shù)散可改善腸道菌群紊亂，促進(jìn)仔鼠腸道菌群的定植與成熟，增強(qiáng)仔鼠腸道上皮屏障功能。這表明，參苓白術(shù)散具有改善腸道健康、緩解幼仔早期斷奶應(yīng)激的作用。