右美托咪定抑制NOX4緩解急性應(yīng)激致大鼠腎損傷

楊昊天，陳永平，王志強，黃宇翔，馬志剛，鄒 躍，魏念冬，張 紅，李 鑫，董佳強，呂明哲，李洪彬，劉力威，楊昊軒，張國華，劉雪松，鐘 鵬，石荷葉，寇玉紅，陳志峰*

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，齊齊哈爾 161005； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，青島 266109；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)扎蘭屯市高臺子黨群服務(wù)中心，扎蘭屯 162650； 4.大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣畜牧技術(shù)服務(wù)中心，大慶 166200；5.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，哈爾濱 150086)

應(yīng)激會導(dǎo)致身體和心理疾病[1]。近年來，壓力引起人們的廣泛關(guān)注，因為它引起的疾病對公共衛(wèi)生構(gòu)成了極大的威脅[2]。目前，報道最多關(guān)注的是，急性應(yīng)激可以影響人與動物學(xué)習(xí)和工作記憶能力[3-4]。但是，急性應(yīng)激也會引起自身免疫性疾病[5]、腦部損傷[6]、心血管疾病[7]、急性心肌梗死[8]、胃潰瘍[9]和肝損傷[10]。腎是應(yīng)激反應(yīng)下最脆弱的器官之一，腎損傷可導(dǎo)致腎功能不全、高鉀血癥、水中毒、致命性心律失常、腦水腫，這往往危及生命[11-12]。因此，亟需研究急性應(yīng)激引起的腎損傷的潛在機制和有效治療目標(biāo)。目前，急性應(yīng)激性腎損傷的潛在分子機制尚不清楚。先前的研究表明，急性束縛應(yīng)激對肝和海馬的損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)[13-14]。應(yīng)激過程中，會有大量去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)、血管緊張素等激素產(chǎn)生。它們可以破壞蛋白質(zhì)，產(chǎn)生自由基，促進氧化應(yīng)激。NADPH氧化酶為膜結(jié)合蛋白，可以產(chǎn)生活性氧。作為細胞凋亡的誘導(dǎo)劑，氧化應(yīng)激可引起腎損害[15]。

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)臨床中常用的藥物，除具有鎮(zhèn)靜、止疼作用外，還具有抑制交感興奮、調(diào)節(jié)免疫、抗感染等多重作用。先前的研究表明，應(yīng)用DEX治療后，僅NE的濃度被顯著地降低了，提示DEX可能會抑制NE的釋放，從而防止大鼠急性應(yīng)激致腎損傷[16-17]。在本課題組的一些預(yù)試驗中的結(jié)果表明，DEX可降低腎組織NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)的蛋白表達水平和氧化應(yīng)激反應(yīng)，但DEX抗氧化應(yīng)激的藥理作用靶點仍有待探索。

在上述研究的基礎(chǔ)上，本課題組設(shè)計采用了“強迫游泳15 min、束縛應(yīng)激3 h”的大鼠急性應(yīng)激模型。通過進行曠場試驗驗證模型，腎功能檢查、腎組織病理學(xué)觀察、腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測和NOX4/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白(NOX4、AKT、Nrf2、HO-1和NQO1)的檢測，探討DEX對急性應(yīng)激致大鼠腎損傷的保護作用及機制，期望能為獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)臨床治療急性應(yīng)激致腎損傷提供新的研究思路和干預(yù)手段，為DEX抗應(yīng)激的臨床應(yīng)用提供必要的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 體重為180～200 g的Wistar雄性大鼠24只，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院。在試驗開始7 d前將這些大鼠進行分籠飼養(yǎng)，隨機分配3只一籠，并將大鼠置于安靜、清潔、溫度22 ℃±1 ℃、濕度為45%～55%，且有自然光照射的房間內(nèi)。大鼠進行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，期間可自由采食飲水。本試驗涉及動物均獲得黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院實驗動物倫理委員會(SRM-11)的批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 右美托咪定(美國輝瑞公司，12071234)、異氟烷(河北九派制藥有限公司，1011)，谷胱甘肽GSH(南京建成生物工程研究所，A006-1-1)，丙二醛MDA(南京建城生物工程研究所，A003-2-2)，超氧化物歧化酶SOD(南京建城生物工程研究所，A001-3-2)，甲醛(天津富宇精細化工有限公司)，Acr-Bis(北京雷根生物技術(shù)有限公司，PE0103)，抗體：NOX4、AKT、Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要儀器 GRGD-R1大鼠固定器(杭州中科生命科技股份有限公司)，BX-FM光學(xué)顯微鏡觀察(Olympus Corp，東京，日本)，組織制備儀(Bio-Xplorer International Limited)，TanonESP300通用型電泳儀(上海天能科技有限公司)，蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國BayGene公司，BG-Power 600)，全自動凝膠成像儀(上海天能科技有限公司,Tanon5200)，水浴鍋(江蘇金城國勝實驗儀器廠)，酶標(biāo)儀(美國BioTek公司，Bio-Rad 680)。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗動物分組與處理 24只Wistar大鼠，隨機均分為空白對照組(C組)、DEX對照組(C+D組)、急性應(yīng)激組(AS組)、DEX干預(yù)組(AS+D組)。

C組：本組大鼠均不做任何處理。

C+D組：即DEX對照組，對該組大鼠進行腹腔注射DEX(30 μg·kg-1)處理。

AS組：首先強迫大鼠游泳15 min(水溫18～20 ℃)，若出現(xiàn)溺水狀態(tài)則立即撈出；然后將其固定在固定器上，四肢和頭部均外露，持續(xù)3 h。

AS+D組：大鼠造模前腹腔注射DEX(30 μg·kg-1)，30 min后將其置于水中(18～20 ℃)強迫游泳15 min(出現(xiàn)溺水狀態(tài)立即撈出)，然后將大鼠固定在固定器上，四肢和頭部均外露，持續(xù)3 h。

1.2.2 曠場試驗 建立急性應(yīng)激模型后，進行曠場試驗，驗證模型是否建立成功。應(yīng)用Super Maze軟件記錄3 min內(nèi)大鼠的表現(xiàn)，包括中央格靜止時間、總路程、跨格次數(shù)、站立次數(shù)(兩前肢同時離地的頻率)[18-19]。所有大鼠均測試一次，每次結(jié)束后需要清掃場箱。

1.2.3 大鼠血液及腎組織的收集 試驗結(jié)束后，進行心取血，完整取下腎，一側(cè)冷凍保存，另一側(cè)用4%甲醛固定。

1.2.4 大鼠腎功能的檢查 采集血液后，用4 ℃離心機在3 000 r·min-1離心10 min，收集血清。用生化分析儀檢測血清中肌酐(creatinine，CREA)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的含量。

1.2.5 大鼠腎組織病理學(xué)觀察 常規(guī)制備腎組織石蠟切片(4～5 μm)，并進行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察所有切片，由不清楚本試驗分組的人員進行評估。評估標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[16-17]。

1.2.6 大鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 氧化檢測應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、GSH均使用南京建成試劑盒，使用方法均按照使用說明。

1.2.7 氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的檢測 裂解大鼠腎組織細胞，提取蛋白，使用BSA計算蛋白含量和上樣量。制膠、上樣，進行電泳。轉(zhuǎn)膜后進行一抗和二抗的孵育，時間分別為12和2 h，蛋白稀釋比例：NOX4(1∶500)，AKT(1∶500)，Nrf2(1∶1 000)，HO-1(1∶1 500)，NQO1(1∶1 000)，GAPDH(1∶2 000)。采用TImager 600全自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)進行目的蛋白化學(xué)發(fā)光的檢測，獲取并保存結(jié)果。應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠急性應(yīng)激模型的驗證

通過曠場試驗驗證急性應(yīng)激模型。曠場試驗結(jié)果表明(圖1)，AS組大鼠在中央格的靜止時間極顯著(P<0.01)高于C組，而其總路程、站立次數(shù)均極顯著(P<0.01)低于C組。根據(jù)曠場軌跡圖也可直觀看出AS組大鼠的活動量顯著少于C組，這說明大鼠對新環(huán)境的好奇度明顯降低，對周邊的事物失去興趣，不愿去探索新環(huán)境，而是縮在一處，表現(xiàn)抑郁樣行為。以上結(jié)果表明，大鼠急性應(yīng)激模型建立成功。

C. 對照組；C+D. DEX對照組；AS.急性應(yīng)激組；AS+D. DEX治療組；*和**代表與C組比較，#和##代表與AS組比較，都具有統(tǒng)計學(xué)意義(*, #.P<0.05；**，##.P<0.01)，下圖同

2.2 大鼠腎功能的檢測結(jié)果

血清CREA和BUN檢測結(jié)果表明(圖2)，AS組和AS+D組大鼠血清中BUN的濃度極顯著高于C組(P<0.01)，而AS+D組大鼠的BUN濃度與AS組相比降低到正常水平(P<0.01)。AS組大鼠的血清CREA濃度極顯著高于C組和AS+D組(P<0.01)。結(jié)果見圖2。

圖2 大鼠腎功能指標(biāo)BUN與CREA的含量(n=6)

2.3 大鼠腎組織病理學(xué)觀察結(jié)果

腎組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示(圖3)，C組大鼠腎小球、腎小管及腎間質(zhì)均未見異常。AS組大鼠腎組織觀察到空泡變性、局灶性腎出血及局灶性腎小管壞死等。然而，AS+D組大鼠腎組織未觀察到出血，僅有極少數(shù)空泡變性。

AS組引起實質(zhì)性組織損傷，可以在AS組中觀察到嚴重出血/充血(紅色箭頭指示)，局灶性腎小管壞死(黑色箭頭指示)，空泡變性(藍色箭頭指示)

腎損傷評分結(jié)果見圖4。

圖4 大鼠腎損傷評分(n=6)

2.4 大鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測結(jié)果

MDA檢測結(jié)果表明(圖5)，AS組大鼠腎組織中MDA含量極顯著高于C組(P<0.01)。AS+D組與AS組相比，大鼠腎組織中MDA含量明顯降低，差異顯著(P<0.05)。AS+D組與C組相比差異不顯著。結(jié)果表明，DEX預(yù)處理后能夠顯著降低MDA的含量。

圖5 大鼠腎組織中MDA的含量(n=6)

SOD和GSH檢測結(jié)果表明(圖6)，AS組大鼠腎組織的SOD活性和GSH含量均顯著低于C組(P<0.05)。然而，AS+D組大鼠腎組織的SOD活性和GSH含量顯著地高于AS組(P<0.01)。AS+D組與C組相比差異不顯著。這些結(jié)果表明DEX能增加SOD的活性和GSH的含量。

圖6 大鼠腎組織中SOD活性與GSH濃度(n=6)

2.5 急性應(yīng)激致大鼠腎細胞氧化應(yīng)激具體途徑的確定

Nox4介導(dǎo)氧化應(yīng)激途徑相關(guān)蛋白表達檢測結(jié)果顯示(圖7)，AS組大鼠腎組織中NOX4和AKT蛋白表達明顯高于C組。AS+D組大鼠腎組織中NOX4和AKT蛋白表達明顯低于AS組。AS組Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達明顯低于C組。AS+D組HO-1和NQO1蛋白表達明顯高于AS組。

各蛋白條帶灰度值分析結(jié)果表明(圖7)，AS組大鼠腎組織中NOX4和AKT蛋白表達量極顯著(P<0.01)或顯著高于C組(P<0.05)，Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達量極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)低于C組。AS+D組大鼠腎組織中NOX4和AKT蛋白表達量極顯著低于AS組(P<0.01)。以上結(jié)果表明急性應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠腎組織氧化應(yīng)激是通過激活NOX4/AKT途徑。

圖7 NOX4介導(dǎo)氧化應(yīng)激途徑相關(guān)蛋白的表達(n=6)

3 討 論

生物體在急性應(yīng)激狀態(tài)下，過量的NE可能會自我氧化，產(chǎn)生過剩的氧自由基，從而破壞機體氧化和抗氧化平衡，產(chǎn)生大量的ROS，引起氧化應(yīng)激[20]。氧化應(yīng)激不僅會引起腎實質(zhì)細胞和間質(zhì)細胞發(fā)生空泡樣變性、凋亡、壞死等一系列形態(tài)學(xué)的改變，還會造成腎小球濾過功能和腎小管重吸收功能的降低[21]。BUN和CREA的血清水平是評估腎功能的常用指標(biāo)[22]。急性應(yīng)激組大鼠的血清BUN的含量為其他組2倍左右，超出正常范圍。在DEX預(yù)處理后大鼠血清中BUN與CREA的含量顯著降低，恢復(fù)到正常范圍內(nèi)。

腎組織病理學(xué)檢查是用于評估腎損傷最直觀的指標(biāo)[23]。在本研究中，急性應(yīng)激后大鼠腎組織出現(xiàn)局灶性腎出血、局灶性腎小管壞死和腎小管上皮細胞空泡變性。用DEX預(yù)處理后，大鼠腎組織切片中僅發(fā)現(xiàn)少量腎小管壞死，未觀察到空泡變性和出血等腎組織病理學(xué)損傷。腎組織損傷統(tǒng)計結(jié)果表明，DEX可抑制出血現(xiàn)象，改善腎小管壞死和空泡變性。由此可以看出，急性應(yīng)激后大鼠腎組織病理學(xué)損傷嚴重，DEX可改善急性應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠腎損傷。腎小管壞死和空泡變性可能與初期血流動力學(xué)導(dǎo)致的腎缺血有關(guān)，也可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[24]。

應(yīng)激的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)主要包括交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(sympathetic adrenal medullary system，SAM)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)(hypothalamic-pituitary-adrenal cortex system，HPA)。SAM系統(tǒng)通過外周效應(yīng)分泌(catecholamine，CA)，即NE和腎上腺素(epinephrine，E)，因此SAM軸是最早參與應(yīng)激反應(yīng)的系統(tǒng)之一[25]。有研究指出，DEX會抑制NE的釋放[26]。因此DEX通過影響NE可能也會在一定程度上影響氧化應(yīng)激的強度。但是NADPH氧化酶4(NOX4)主要是腎和血管中表達[27]。因此，在腎組織中的氧化應(yīng)激的發(fā)生，可能更多地由NOX4來影響。

韓勇等[28]研究表明，NADPH氧化酶的激活可導(dǎo)致ROS生成增多。ROS大量積聚引發(fā)機體內(nèi)源性氧化應(yīng)激反應(yīng)，并進一步促進炎性因子的釋放，加劇炎癥反應(yīng)。這可以看出，氧化應(yīng)激的損傷機制可能是急性應(yīng)激誘導(dǎo)機體損傷的一個重要機制。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，DEX可影響NOX4的表達，不僅可阻止氧化應(yīng)激，還會對抑制炎癥有一定作用。

4 結(jié) 論

DEX預(yù)處理可顯著降低腎組織病理學(xué)損傷的嚴重性，DEX治療急性應(yīng)激可影響NOX4/Nrf2/HO-1/NQO1信號通路，并減輕氧化應(yīng)激治療腎損傷。