條件性敲除D1133L基因的重組非洲豬瘟病毒的構(gòu)建及增殖特性

張 婷，馮 濤，楊金柯，郝 雨，楊 行，張大俊，史喜絹，閆文倩，陳玲玲，劉湘濤，鄭海學(xué)，張克山

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點開放實驗室 國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus， ASFV)感染引起的豬的一種烈性、高度致死性的重大傳染病，目前暫無商品化的疫苗和防控藥物可用[1-4]，嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)[5]。

ASFV是Asfarviridae家族的唯一成員，屬于核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA病毒(nucleocytoplasmiclarge DNA viruses，NCLDV)[6-7]。ASFV是目前唯一報道的DNA蟲媒病毒[3]。ASFV粒子呈現(xiàn)出獨特的多層結(jié)構(gòu)，整體形態(tài)呈二十面體，直徑約250 nm[8- 9]。病毒基因組是雙鏈DNA (dsDNA)分子，長度為170～190 kbp，編碼超過150個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中大約一半ORF缺乏任何已知或可預(yù)測的功能[6]。病毒粒子包含約70種不同的多肽[10]，包括用于病毒結(jié)構(gòu)的多種成分，以及一組參與病毒轉(zhuǎn)錄和mRNA修飾以及維持病毒基因組完整性的酶。ASFV主要在豬單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中復(fù)制[11-14]。ASFV編碼的D1133L基因在ASFV中高度保守[15]，與牛痘病毒(vaccinia virus，VACV)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白D6R相似[16]，具有SF2解旋酶家族相似的基序，值得注意的是，D1133L在病毒感染晚期表達(dá)，屬于晚期表達(dá)基因，D1133L定位于胞質(zhì)[17]，可能參與病毒轉(zhuǎn)錄過程[6, 11-12]。目前對D1133L在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮的作用及其機(jī)制知之甚少。

ASFV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制不同階段發(fā)揮相關(guān)的功能，為了探究病毒蛋白在復(fù)制階段發(fā)揮的功能，乳糖操縱子中編碼的酶在阻遏物——乳糖操縱子阻遏蛋白(lac repressor Lac I，Lac I)負(fù)調(diào)控下，可特異性地與乳糖操縱基因(lac operator LacO，Lac O)結(jié)合并以高親和力與其21 bp序列結(jié)合，阻遏酶表達(dá)。Lac I也可以與異乳糖或異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)結(jié)合，從而降低阻遏物對操縱子的親和力，通過這種方式，IPTG可以減少Lac操縱子轉(zhuǎn)錄的抑制，從而誘導(dǎo)表達(dá)。該系統(tǒng)可調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染和整合基因的表達(dá)，在VACV中已使用該系統(tǒng)可以用來研究病毒形態(tài)，成為調(diào)控病毒蛋白與宿主互作的有力工具[18]?；谌樘荓ac操縱阻遏系統(tǒng)的ASFV誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[19]。例如p72蛋白誘導(dǎo)重組的ASFV，利用該策略對ASFV其他蛋白在病毒復(fù)制中發(fā)揮的功能進(jìn)行探究，比如pE120R[20]和 pE199L[21]構(gòu)建誘導(dǎo)表達(dá)pE120R和pE199L基因的ASFV重組病毒，探究這兩種病毒蛋白在病毒入侵和出芽過程發(fā)揮作用。因此ASFV感染與致病功能與其編碼的病毒蛋白息息相關(guān)，構(gòu)建缺失病毒相關(guān)蛋白的ASFV重組病毒是研究病毒編碼致病基因及其機(jī)制的重要手段。本研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)缺失D1133L基因ASFV無法復(fù)制，利用大腸桿菌阻遏系統(tǒng)條件性敲除D1133L基因，探究了D1133L在ASFV病毒復(fù)制過程中發(fā)揮的功能，獲得ASFV條件性敲除D1133L基因的重組病毒vD1133Li，比較了重組病毒和親本毒株的復(fù)制能力，本研究結(jié)果為D1133L基因功能研究和機(jī)制的探究提供了基礎(chǔ)，為條件性基因缺失ASFV弱毒疫苗的研發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 MA-104細(xì)胞和MA-104/D1133L細(xì)胞系由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫流行病實驗室保存；ASFV CN/GS/2018分離株、由蘭州獸醫(yī)研究所非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇覙?gòu)建并保存。豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages, PAM) 和骨髓源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)的分離、鑒定和培養(yǎng)參照European Union Reference Laboratory for ASF, SOP/CISA/ASF中的操作程序。

1.1.2 試劑和抗體 ASFV p30單克隆抗體，兔抗ASFV p72多克隆抗體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供；peGFP-N1載體、pUC118載體均購于蘭州瑞博萊生物科技有限公司；無內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒，購于OMEGA公司；胎牛血清(FBS)和0.25%EDTA-Trypsin(Gibco)購自博鑫生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液(三抗)和PBS緩沖液購自北京索萊寶公司；大腸桿菌Trans5a感受態(tài)、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、Trizol 試劑購自SYBR Permix Ex Taq II均購于寶生物工程大連有限公司；RPIM1640培養(yǎng)基(Gibco)和高糖DMEM(Gibco)培養(yǎng)基購自購自Thermo Fisher Scientific公司；鼠抗β-actin單克隆抗體購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，Goat Anti-Mouse，蛋白預(yù)染marker購自proteintech公司。

1.2 不同轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

本研究中使用的表達(dá)盒參考相關(guān)報道由三部分組成[22]，通過PCR擴(kuò)增得到p72啟動子序列，即從p72基因上游的-97 nt到ATG起始密碼子之前序列，以peGFP-N1載體為模板，擴(kuò)增得到綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)基因，合成以u104L為啟動子的Lac I系統(tǒng)，最后合成以p72啟動子的Lac O系統(tǒng)。將這幾個部分部分連接，獲得eGFP篩選表達(dá)盒基因片段，命名p72-eGFP-U104L-Lac I-p72-Lac O。為便于后續(xù)純化病毒，在合成調(diào)控序列的同時，合成p72啟動子啟動表達(dá)的eGFP 基因篩選標(biāo)記元件。

1.3 重組載體的構(gòu)建與鑒定

利用pU118載體作為骨架載體，構(gòu)建D1133L基因敲除同源重組轉(zhuǎn)移載體。步驟如下：分別設(shè)計D1133L基因起始密碼子的上下游序列1.0 kb作為同源重組臂，分別克隆入骨架載體中，兩個同源臂中插入p72-eGFP-U104L-Lac I-p72-Lac O表達(dá)盒基因片段。得到用于條件性敲除D1133L基因的同源重組轉(zhuǎn)移載體，經(jīng)測序正確后，將該同源重組轉(zhuǎn)移載體命名為ASFVΔi130；用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，測定濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和重組病毒篩選與鑒定

1.4.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將同源重組轉(zhuǎn)移載體pUC-p72-eGFP-U104L-LacI-p72-LacO用4 μL JetPER-Macrophage DNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至豬BMDM細(xì)胞中(細(xì)胞數(shù)約為106個·孔-1)，6 h后，感染ASFVCN/GS2018，至感染48 h，熒光顯微鏡觀察熒光細(xì)胞數(shù)，挑取所有單孔中的熒光細(xì)胞，在新的培養(yǎng)皿中小心吹散，沉降1 h，挑取所有單個熒光細(xì)胞，反復(fù)凍融后，接種預(yù)先鋪好的96孔板BMDM細(xì)胞，每12 h觀察一次，連續(xù)觀察至72 h；在熒光顯微鏡下可見有零星綠色熒光，即視為可疑重組毒感染的細(xì)胞。挑取熒光細(xì)胞，在新的培養(yǎng)皿中小心吹散，沉降1 h，挑取單個熒光細(xì)胞，收集后反復(fù)凍融3次，接種預(yù)先鋪好的96孔板PAMs，每12 h觀察一次，連續(xù)觀察至72 h。熒光細(xì)胞數(shù)量比例達(dá)100%的為全陽性孔，表明重組毒構(gòu)建基本成功。

1.4.2 重組病毒鑒定 在1.5 mmol·L-1IPTG的情況下，對陽性孔進(jìn)行有限稀釋擴(kuò)大培養(yǎng)，挑取第11代重組病毒孔消化成單個細(xì)胞，吸取10個熒光細(xì)胞，分別接種于預(yù)先鋪好的96孔板PAMs，生長72 h。挑取GFP熒光較多的細(xì)胞，用病毒基因組提取試劑盒提取ASFV野毒和基因缺失ASFV的基因組，用針對D1133L的引物進(jìn)行PCR鑒定，確認(rèn)是否缺失成功。通過加入IPTG，擴(kuò)大培養(yǎng)，純凈性檢驗、目的基因通過Western blot測定，以確定純化的ASFV vD1133Li在沒有IPTG情況下，D1133L蛋白的表達(dá)被阻止。檢測引物序列表見表1。

表1 重組病毒檢測引物序列表

1.5 病毒生長曲線

將PAM細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，ASFV重組毒株vD1133Li和親本毒株感染(MOI=0.1)PAMs，吸附2 h后，親本毒株沒有IPTG及重組毒株vD1133Li更換培養(yǎng)基IPTG(1.5 mmol·L-1)和沒有IPTG的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在感染后指定時間將感染細(xì)胞與培養(yǎng)上清一起收集，反復(fù)凍融三次后，用qPCR測定病毒拷貝數(shù)。反應(yīng)體系25 μL，用Qiagen公司的QIAamp DNA Mini試劑盒提取樣本DNA，設(shè)計以ASFVp72基因為靶點的定量引物來分析病毒增殖的拷貝數(shù)，引物序列如下，上游引物序列f：5′-CAGGCAAAACAAGTGAAACA-3′，下游引物序列r：5′-GCAAACTGCTCATCCAATAT-3′；探針(probe)：TGTTCTTCACGCGTAGCGAATGGGC，探針的5′端標(biāo)記fam熒光報告基團(tuán)，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)bhq1，擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)熱30 s， 95 ℃預(yù)熱5 s，58 ℃預(yù)熱30 s， 40次循環(huán)。計算ASFV基因組的數(shù)量，并以每微升含有病毒基因組拷貝數(shù)表示。

1.6 熒光觀察

利用熒光顯微鏡觀條件性缺失D1133L重組病毒(vD1133Li)感染PAM細(xì)胞的熒光值，將PAM細(xì)胞按1×105密度接種于六孔板中，感染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察并在綠色和白光通道并拍照記錄，細(xì)胞放大倍數(shù)為20×。

1.7 實時定量 PCR(RT-qPCR)

采用 Trizol 裂解法提取細(xì)胞的總 RNA，并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，用于實時定量 PCR，反轉(zhuǎn)錄體系 20 μL：10 μL反轉(zhuǎn)錄酶，5 μL DEPC 水，5 μL RNA。反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，82 ℃ 5 s。RT-qPCR的反應(yīng)體系(10 μL)：5 μL SYBR Permix Ex TaqⅡ，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，3 μL DEPC 水和1 μL cDNA。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃變性 10 s，60 ℃退火和延伸 34 s，共 40 個循環(huán)，同時進(jìn)行熔解曲線分析，采用 2-ΔΔCt方法，計算目的基因的相對表達(dá)量并進(jìn)行分析。引物序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列

1.8 Western blot

MA-104/D1133L和MA-104細(xì)胞以每孔1×105細(xì)胞量接種于12孔板，感染ASFV(MOI=1.5)，不同時間點收取蛋白，用PBS洗滌后加入100 μL 1×loading蛋白上樣緩沖液裂解細(xì)胞，取20 μL蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后用100 V恒壓轉(zhuǎn)膜1.5 h，用5%的脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，加入對應(yīng)D1133L單克隆抗體和p72多克隆抗體，4 ℃過夜孵育，加入山羊抗鼠和山羊抗兔(1∶5 000)室溫孵育2 h，用ECL顯色液全自動化學(xué)發(fā)光成像分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并作圖，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行顯著性分析，*.P<0.05 說明數(shù)據(jù)間有顯著差異，**.P<0.01 說明數(shù)據(jù)間有極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 重組病毒ASFV vD1133Li的構(gòu)建及鑒定

為研究D1133L基因在病毒復(fù)制中的作用。首先構(gòu)建了條件性缺失D1133L的重組病毒，構(gòu)建策略如圖1A所示，同時針對該基因表達(dá)元件設(shè)計了內(nèi)源性檢測引物和外源性檢測引物，病毒純凈性檢測結(jié)果如圖1B所示，結(jié)果表明在無IPTG的條件下，利用內(nèi)源性檢測引物L(fēng)P3056/3057檢測基因組，i130#1和i130#2無法檢測到D1133L相關(guān)條帶；利用外源性檢測引物L(fēng)P2918/3057檢測大腸桿菌阻遏元件，WT檢測不到相關(guān)條帶，說明成功構(gòu)建條件性誘導(dǎo)D1133L缺失的重組病毒，該重組病毒命名為ASFV vD1133Li。

A.重組病毒vD1133Li基因組構(gòu)建策略圖；B.重組病毒vD1133Li基因組核酸檢測圖

2.2 重組病毒ASFV vD1133Li感染細(xì)胞狀態(tài)

為進(jìn)一步明確重組病毒vD1133Li感染PAM細(xì)胞后病毒的復(fù)制差別。條件性缺失重組病毒vD1133Li感染PAM細(xì)胞，48 hpi后熒光顯微鏡觀察，結(jié)果表明在IPTG(1.5 mmol·L-1)存在時熒光數(shù)量明顯增多，當(dāng)D1133L基因缺失后，ASFV復(fù)制能力明顯減弱。

2.3 重組病毒ASFV vD1133Li的生長特性

為明確探究D1133L缺失對ASFV復(fù)制的影響，在存在或不存在IPTG的情況下，分析了重組病毒vD1133Li的生長曲線，如圖3C所示，在添加IPTG(1.5 mmol·L-1)誘導(dǎo)表達(dá)D1133L蛋白，重組病毒vD1133Li(+)和親本毒株的生長曲線相似，而在IPTG不存在，即D1133L不表達(dá)，重組病毒vD1133Li(-)在48 hpi后復(fù)制明顯低于親本毒株。以上結(jié)果表明D1133L基因?qū)SFV復(fù)制至關(guān)重要。

2.4 條件誘導(dǎo)下的D1133L基因功能

為檢測D1133L蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)， Western blot分析了感染親本ASFV或重組vD1133Li的MA-104細(xì)胞在存在和不存在IPTG(1.5 mmol·L-1)情況下的細(xì)胞裂解液。如圖4A所示，D1133L在親本病毒感染和在誘導(dǎo)劑IPTG存在下生長的重組病毒vD1133Li，表達(dá)水平相似。在沒有IPTG誘導(dǎo)的情況下，重組vD1133Li幾乎檢測不到D1133L蛋白表達(dá)。作為對照組， p72的表達(dá)水平在所有感染條件下是一致的。為進(jìn)一步證明D1133L對病毒復(fù)制的作用，將重組毒株vD1133Li在IPTG不存在(D1133L不表達(dá))的情況下，感染穩(wěn)定表達(dá)D1133L的MA-104細(xì)胞系MA-104/D1133L，在不同時間點收取樣品，利用RT-qPCR、Western blot檢測了ASFV p30、p72的轉(zhuǎn)錄水平(圖4B和4C)和蛋白水平(圖4D)，結(jié)果表明在不存在IPTG的條件下，重組病毒在MA-104/D1133L細(xì)胞的復(fù)制能力顯著高于野生型MA-104細(xì)胞。綜上所述，重組vD1133Li的病毒復(fù)制能力與D1133L相關(guān)，進(jìn)一步證明D1133L對病毒復(fù)制是必須基因。

存在IPTG[(vD1133Li(+)]或不存在IPTG[vD1133Li(-)]的情況下，重組病毒vD1133Li感染PAMs，感染48 h后，熒光顯微鏡觀察

存在IPTG[vD1133Li(+)]或不存在IPTG[vD1133Li(-)]的情況，用vD1133Li病毒感染PAMs。在指定的感染時間內(nèi)，測定每個樣品的病毒拷貝數(shù)，親代GS/CN2018 (WT)感染作為對照

A.D1133L蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，在IPTG存在或不存在的條件下，用親本GN/CS2018株(WT)和重組毒株vD1133Li病毒(MOI=1.5)感染MA-104細(xì)胞，在36 hpi時，用抗病毒蛋白D1133L和p72的抗體進(jìn)行免疫印跡分析；B、C. vD1133Li病毒感染MA-104/D1133L細(xì)胞和MA-104細(xì)胞ASFV p30和p72轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)；D. vD1133Li病毒感染MA-104/D1133L細(xì)胞ASFV p30、p72和D1133L蛋白水平表達(dá)

3 討 論

ASFV編碼的病毒蛋白較多，為驗證基因功能，采用CRISPR/Cas9技術(shù)或者同源重組技術(shù)缺失單個和多個病毒毒力基因，在取得毒力減弱的同時，也可驗證基因功能；而對于病毒存活的必需基因，用上述方法無法獲得敲除毒株。研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建缺失毒力基因的重組毒株在豬體內(nèi)的評價研究為疫苗的研發(fā)提供有利的基礎(chǔ)[23-24]，本文利用大腸桿菌Lac阻遏操作系統(tǒng)實現(xiàn)目的基因的條件性敲除[21, 25]，探究病毒編碼的基因功能，為ASFV致病機(jī)制的研究和相關(guān)防控產(chǎn)品研發(fā)提供依據(jù)[26-27]。

本文利用乳糖阻遏操作系統(tǒng)實現(xiàn)目的基因的條件性敲除，構(gòu)建了條件性敲除D1133L蛋白的ASFV重組毒株vD1133Li，在PAM細(xì)胞，觀察了重組病毒vD1133Li的感染狀態(tài)，測定了重組毒株vD1133Li在IPTG存在的條件下和親本毒株CN/GS2018在PAM細(xì)胞中的生長特性。利用穩(wěn)定表達(dá)D1133L的MA-104細(xì)胞系MA-104/D1133L感染vD1133Li，與野生型MA-104細(xì)胞相比，在沒有IPTG的條件下，穩(wěn)定表達(dá)D1133L的MA-104細(xì)胞中ASFV p30和p72的表達(dá)量顯著高于野生型MA-104，證實D1133L蛋白對病毒復(fù)制是至關(guān)重要的。針對ASFV復(fù)制過程中利用病毒蛋白靶點來設(shè)計抗病毒藥物引起大家關(guān)注，比如DNA結(jié)合蛋白pA104R在ASFV基因組包裝中的作用及作為疫苗和藥物開發(fā)的新靶點[28-29]；ASFV編碼的基因S273R具有sumo-1特異性蛋白酶和腺病毒蛋白酶的保守催化殘基特征，針對ASFV pS273R蛋白酶的小分子化合物靶向抑制劑，通過用一種小分子抑制劑阻斷pS273R蛋白酶的活性來潛在抑制ASFV復(fù)制[30]。因此本研究證實的D1133L基因功能，為針對D1133L設(shè)計與之結(jié)合的小分子化合物來抑制ASFV復(fù)制的抗病毒藥物研發(fā)提供了新的研究策略。

4 結(jié) 論

本次研究首次成功構(gòu)建了條件性誘導(dǎo)缺失D1133L的 ASFV重組病毒vD1133Li，利用ASFV重組病毒vD1133Li感染PAM細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)D1133L的MA-104細(xì)胞，研究了重組病毒增殖特性，明確了D1133L對ASFV復(fù)制至關(guān)重要，此研究結(jié)果為探究D1133L作用的分子機(jī)制和基因缺失ASFV疫苗株的研發(fā)提供關(guān)鍵的生物學(xué)材料和新的研發(fā)思路。