表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2基因的重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析

李曉涵，楊伏春，劉 芮，高 立，崔紅玉，張艷萍，劉長軍，祁小樂，王笑梅，高玉龍，李 凱

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 禽免疫抑制病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，哈爾濱 150069)

雞傳染性法氏囊病(IBD)是由雞傳染性法囊病病毒(IBDV)引起的主要感染雛雞的一種急性、高度接觸性和免疫抑制性傳染病[1-3]。該病于1957年首發(fā)于美國甘布羅地區(qū)，又被稱為“甘布羅病”。60多年來，該病一直威脅著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，世界動物衛(wèi)生組織認(rèn)為IBD已成為影響社會經(jīng)濟(jì)的重要疾病[4-6]?？乖儺?、免疫抑制，特別是超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的出現(xiàn)，使得該病的防控形勢更加嚴(yán)峻[7-9]。IBDV基因組由兩個雙股RNA節(jié)段組成，分別為A節(jié)段和B節(jié)段。A節(jié)段編碼的VP2蛋白構(gòu)成病毒的外衣殼，是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白。VP2可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是IBDV主要的宿主保護(hù)性抗原[10]。目前，IBD主要通過傳統(tǒng)活疫苗和滅活疫苗進(jìn)行防控，但活疫苗免疫效果易于受到母源抗體干擾，中毒力活疫苗會造成接種雞法氏囊損傷，引起免疫抑制；滅活疫苗免疫持續(xù)期較短，需多次加強(qiáng)免疫[11]。因此研制安全性好、不受母源抗體干擾、免疫持續(xù)期長的新型基因工程疫苗對IBD的防控具有重要意義。

雞馬立克病(MD)是由馬立克病病毒引起的一種雞的傳染性腫瘤病，以淋巴組織增生和腫瘤形成為特征，該病是雞的主要疾病之一，也是國內(nèi)外20世紀(jì)50年代以來最受重視的雞病[12-14]?；痣u皰疹病毒(HVT)在國內(nèi)外被廣泛用于MD的防控。HVT基因組較大，可供外源基因插入的復(fù)制非必需區(qū)多，是構(gòu)建重組活載體疫苗的理想載體[15-18]。本研究利用HVT多片段黏粒拯救系統(tǒng)和LR重組技術(shù)，將IBDVVP2基因表達(dá)框架插入HVT基因組，構(gòu)建了表達(dá)VP2基因的重組病毒rHVT-VP2，并對其體外生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，為研制IBD重組HVT活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和病毒

pCI載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；pENTR入門載體、克隆有Kan/ccdB基因的重組黏粒H3-Kan/ccdB、克隆有HVT-FC126株基因組片段的5個重組黏粒H1、H2、H3、H4、H5由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所構(gòu)建并保存。大腸桿菌EPI300株購自EPICENTRE公司；IBDV超強(qiáng)毒株HLJ0504株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定并保存。

1.2 主要試劑

常規(guī)PCR反應(yīng)酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶購自TaKaRa公司；Gateway?LR ClonaseTMII Enzyme Mix和磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒均購自Invitrogen公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自QIAGEN公司；細(xì)胞裂解液，購自碧云天公司；細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自BioFroxx公司；鼠抗兔IgG-FITC、IRDye-800標(biāo)記的羊抗兔IgG，購自Licor公司；VP2單克隆抗體(MAb)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所制備并保存。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)IBDV超強(qiáng)毒HLJ0504株VP2基因序列，利用Oligo 7.0軟件設(shè)計擴(kuò)增VP2基因的引物VP2F：5′- GAA TTC GCC ACC ATG ACA AAC CTG CAA GAT CAA ACC -3′和VP2R：5′- ATC GAT TCA CCT CCT TAA GGC CCG AAT TAT GTC -3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為1.4 kb。根據(jù)HVT FC126株基因組序列設(shè)計1條引物H45R：5′- ATA AAT AAA ACA CAG TAA CCG TTA-3′，VP2F和H45R組成1對引物，用于鑒定重組黏粒及重組病毒，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為1.6 kb。引物均由吉林省庫美生物公司合成。

1.4 表達(dá)VP2基因的重組粘粒的構(gòu)建及鑒定

以IBDV HLJ0504株基因組為模板，利用引物VP2F、VP2R經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得VP2基因。將純化后的VP2基因經(jīng)EcoRⅠ、KpnⅠ酶切后克隆入pCI載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCI-VP2。將該重組質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ、BamHⅠ酶切后獲得VP2表達(dá)框架，將其克隆入pENTR入門載體的BglⅡ、BamH1位點(diǎn)，獲得含有VP2表達(dá)框架的重組入門質(zhì)粒pENTR-VP2。將pENTR1-VP2與重組黏粒H3-Kan/ccdB均稀釋至300 ng·μL-1，各取1與2 μL的Gateway LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix混合，置于室溫作用1 h。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌EPI300并涂布在氯霉素抗性LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取平板上的單個菌落加入氯霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，提取黏粒，用引物VP2F、H45R經(jīng)PCR鑒定重組黏粒是否插入VP2表達(dá)框架，并對PCR產(chǎn)物測序鑒定，鑒定正確的重組黏粒命名為H3-VP2。

1.5 表達(dá)VP2基因的重組HVT的拯救及鑒定

利用質(zhì)粒提取試劑盒提取VP2重組黏粒H3-VP2以及其他4個克隆有HVT基因組片段的親本黏粒H1、H2、H4、H5，通過磷酸鈣法將5個經(jīng)SbfⅠ酶切線性化的黏粒共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，4 ～5 d后，觀察轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是否出現(xiàn)HVT特異性蝕斑病變。出現(xiàn)蝕斑后收獲病毒，并在CEF細(xì)胞中連續(xù)傳20代。利用試劑盒提取第5、10、15、20代重組病毒的基因組DNA，同時設(shè)親本病毒基因組DNA對照，利用引物VP2F/H45R經(jīng)PCR鑒定，并測序鑒定，鑒定正確的重組病毒命名為rHVT-VP2。

1.6 重組病毒rHVT-VP2表達(dá)VP2蛋白的檢測

將第20代重組病毒rHVT-VP2與親本病毒分別接種CEF，培養(yǎng)3～4 d出現(xiàn)蝕斑病變后，用無水乙醇固定細(xì)胞，并以VP2蛋白MAb(1∶400)作為一抗，以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶200)作為二抗，采用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定VP2蛋白的表達(dá)。同時，以VP2蛋白MAb(1∶500)作為一抗，以IRDye-800標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶10 000)作為二抗，采用蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)(Western blot)鑒定VP2蛋白的表達(dá)。以上試驗(yàn)均以親本病毒接毒的CEF作陰性對照。

1.7 重組病毒rHVT-VP2體外生長曲線的測定

將重組病毒rHVT-VP2和親本病毒HVT-FC126株以100個蝕斑形成單位(PFU)的劑量接種于48孔板中的CEF上，感染后每隔24 h收集含毒細(xì)胞，持續(xù)至感染后144 h。將各個時間點(diǎn)所收集病毒接種CEF，測定各時間點(diǎn)病毒液的蝕斑數(shù)目，繪制生長曲線，分析重組病毒rHVT-VP2和親本病毒在CEF中的體外復(fù)制特性。

1.8 重組病毒rHVT-VP2免疫原性檢測

取1日齡SPF雞40只，分成4組，每組10只。組1和組2分別以4 000 PFU·只-1劑量頸部皮下接種重組病毒rHVT-VP2和親本病毒HVT-FC126；組3和組4不接種，作為對照組。免疫后28 d，組1～組3試驗(yàn)雞分別采血，分離血清，檢測IBDV中和抗體[11]；組1～組3試驗(yàn)雞經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼途徑接種IBDV超強(qiáng)毒HLJ0504株(0.1 mL·只-1)，組4不攻毒作為健康對照。攻毒后觀察7 d，統(tǒng)計各組雞存活情況。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)VP2基因的重組黏粒的構(gòu)建及鑒定

將RT-PCR擴(kuò)增獲得的VP2基因插入到pCI載體，構(gòu)建獲得重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-VP2。通過酶切獲得VP2基因表達(dá)框架并將其克隆至pENTR入門載體，構(gòu)建獲得重組入門質(zhì)粒pENTR-VP2。通過LR重組反應(yīng)，使VP2表達(dá)框架替換H3-Kan/ccdB中的Kan/ccdB篩選基因并克隆至HVT重組黏粒H3中，構(gòu)建獲得在HVT基因組UL45和UL46基因之間插入VP2基因表達(dá)框架的重組黏粒H3-VP2。用VP2F、H45R對重組黏粒進(jìn)行PCR及測序鑒定，結(jié)果顯示，獲得的PCR產(chǎn)物長度為1.6 kb(圖1)，測序結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物包含VP2基因和VP2表達(dá)盒下游polyA序列。而陰性對照樣品(親本黏粒H3)無VP2基因插入序列，PCR結(jié)果為陰性。以上結(jié)果表明，重組黏粒H3-VP2構(gòu)建正確。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.H3-VP2; 2.H3; 3.ddH2O

2.2 重組病毒rHVT-VP2的拯救及PCR鑒定

將重組黏粒H3-VP2與其他4個克隆有HVT基因組片段的重組黏粒H1、H2、H4、H5共轉(zhuǎn)染CEF，轉(zhuǎn)染后4 d出現(xiàn)HVT特異性蝕斑病變，拯救獲得重組病毒rHVT-VP2。將重組病毒在CEF上進(jìn)行連續(xù)傳代，每隔5代提取病毒基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定及測序。結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物長度均為1.6 kb，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)，測序結(jié)果顯示，插入序列與預(yù)期一致。親本病毒HVT-FC126株基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果為陰性。以上結(jié)果表明，VP2基因正確插入HVT基因組中且能夠穩(wěn)定存在，重組病毒rHVT-VP2構(gòu)建正確。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.rHVT-VP2_F05; 2.rHVT-VP2_F10; 3.rHVT-VP2_F15; 4.rHVT-VP2_F20; 5.HVT-FC126; 6.ddH2O

2.3 重組病毒rHVT-VP2表達(dá)VP2蛋白的鑒定

將第20代重組病毒rHVT-VP2與親本病毒分別接種CEF，培養(yǎng)3～4 d出現(xiàn)蝕斑病變后進(jìn)行IFA和Western blot，檢測VP2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，重組病毒rHVT-VP2感染的細(xì)胞與VP2單克隆抗體反應(yīng)，可見綠色熒光信號；HVT親本病毒以及沒有接毒的對照細(xì)胞未見熒光(圖3)。Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組病毒rHVT-VP2感染的細(xì)胞中可以檢測到VP2蛋白的表達(dá)，表達(dá)蛋白大小約50 ku，大小與預(yù)期相符(圖4)。HVT親本病毒以及沒有接毒的對照細(xì)胞未檢測到VP2蛋白表達(dá)，對照蛋白β-actin在重組病毒rHVT-VP2、親本病毒以及未接毒對照中均檢測到表達(dá)。以上結(jié)果表明重組病毒rHVT-VP2可在感染細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)VP2蛋白。

圖3 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測重組病毒(rHVT-VP2)和親本病毒(HVT-FC126)感染CEF中VP2蛋白表達(dá)情況

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.HVT-FC126;2.rHVT-VP2;3.細(xì)胞對照

2.4 重組病毒rHVT-VP2體外復(fù)制動力學(xué)分析

將重組病毒rHVT-VP2和親本病毒HVT-FC126以100 PFU接種CEF，每隔24 h收集細(xì)胞，滴定病毒的體外復(fù)制動力學(xué)曲線。結(jié)果顯示，重組病毒rHVT-VP2與親本病毒HVT-FC126均在感染后120 h復(fù)制滴度達(dá)到最高峰，分別為1.96×106PFU·mL-1和2.10×106PFU·mL-1，感染CEF后各個時間點(diǎn)重組病毒的滴度與親本病毒均無明顯差異(P>0.05)(圖5)。以上結(jié)果表明重組病毒rHVT-VP2株在CEF中的復(fù)制特性與親本病毒一致。

圖5 重組病毒(rHVT-VP2)和親本病毒(HVT-FC126)在CEF上的復(fù)制動力學(xué)曲線

2.5 重組病毒rHVT-VP2免疫原性分析

將重組病毒rHVT-VP2以4 000 PFU·只-1劑量接種1日齡SPF雞，免疫后28 d采血，分離血清，檢測IBDV中和抗體。結(jié)果如圖6所示，重組病毒rHVT-VP2免疫雞血清中IBDV中和抗體平均滴度可以達(dá)到26.4，免疫親本病毒HVT-FC126的雞以及不免疫對照雞IBDV中和抗體為陰性。以上結(jié)果表明，重組病毒rHVT-VP2免疫雛雞后誘導(dǎo)產(chǎn)生了良好的免疫反應(yīng)。免疫后28 d，對免疫組和對照組分別攻毒，結(jié)果顯示免疫重組病毒rHVT-VP2的10只雞攻毒IBDV后有9只雞健康存活，親本病毒HVT-FC126免疫組和對照組攻毒IBDV后均表現(xiàn)出明顯臨床癥狀，10只雞死亡8只(圖7)。以上結(jié)果表明，重組病毒rHVT-VP2免疫后對IBDV強(qiáng)毒攻擊能夠提供90%的免疫保護(hù)。

圖6 重組病毒rHVT-VP2免疫后IBDV中和抗體檢測

圖7 重組病毒rHVT-VP2免疫雞攻毒IBDV強(qiáng)毒的存活率

3 討 論

IBD是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的高致死性和免疫抑制性傳染病，自1957年發(fā)現(xiàn)以來，已有60多年歷史[1-3]。目前，用于預(yù)防IBD的疫苗主要是傳統(tǒng)活疫苗和滅活疫苗，其中弱毒活疫苗免疫效果易于受到母源抗體干擾，中毒力活疫苗副作用大，能夠引起接種雞法氏囊損傷和免疫抑制，影響其他疫苗免疫保護(hù)效果[19]。全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗不適于早期免疫且免疫持續(xù)期短，需要多次加強(qiáng)免疫，造成養(yǎng)殖環(huán)節(jié)免疫負(fù)擔(dān)過重[20]。因此，研制安全性好、適于孵化場出殼免疫且免疫持續(xù)期長的新型疫苗對我國IBD的防控意義重大。活載體疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫比較廣泛，可以同時表達(dá)多種抗原，制成多價或多聯(lián)疫苗，是當(dāng)今和未來疫苗研發(fā)的主要方向之一[16]。HVT作為一種皰疹病毒，具有基因組大、復(fù)制非必需區(qū)多且能容納較大外源片段的優(yōu)勢，是研制活載體疫苗的理想載體。然而，目前我國還沒有自主知識產(chǎn)權(quán)的IBD重組HVT活載體疫苗。

以往構(gòu)建重組HVT大多采用同源重組法或細(xì)菌人工染色體(BAC)法[21]。同源重組法以及近年來新興的CRISPR/Cas9方法在構(gòu)建重組病毒過程中均需要引入篩選標(biāo)記基因，且需要蝕斑純化，難以短時間內(nèi)獲得純凈的重組病毒，多次細(xì)胞傳代純化蝕斑也會影響重組病毒免疫原性。BAC技術(shù)雖然能夠在細(xì)菌中利用Red/ET重組技術(shù)對病毒基因組進(jìn)行改造，進(jìn)而拯救重組病毒，但后期需要采取一定的手段去除殘留的BAC序列[13]。本研究在拯救表達(dá)VP2基因的重組HVT時采用了新型Fosmid黏粒拯救系統(tǒng)，該系統(tǒng)與BAC相比，具有穩(wěn)定性好、無偏向性、構(gòu)建周期短等諸多優(yōu)點(diǎn)。由于HVT基因組分為不同節(jié)段克隆入黏粒中，在構(gòu)建重組病毒時便于對不同的基因組片段分別進(jìn)行操作，因此該系統(tǒng)更加適于插入多個外源基因的重組病毒的構(gòu)建。

本研究將IBDV保護(hù)性抗原VP2基因表達(dá)框架插入HVT基因組UL45、UL46基因之間，構(gòu)建獲得重組病毒rHVT-VP2。rHVT-VP2在CEF傳代20代后仍然能夠高效表達(dá)VP2蛋白，且插入序列未見突變發(fā)生，表明該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。體外復(fù)制動力學(xué)曲線顯示，rHVT-VP2在CEF上具有良好的復(fù)制能力，復(fù)制特性與親本病毒無顯著差異，表明VP2基因的插入不會對親本病毒的復(fù)制造成顯著影響。將重組病毒rHVT-VP2免疫雛雞后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生IBDV中和抗體，且能夠?qū)BDV超強(qiáng)毒株攻毒造成的死亡提供90%免疫保護(hù)，表明該重組病毒具有良好的免疫原性。以上研究表明，重組病毒rHVT-VP2有望開發(fā)為一種預(yù)防IBD的新型疫苗。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用HVT新型Fosmid黏粒拯救系統(tǒng)，構(gòu)建獲得表達(dá)IBDV保護(hù)性抗原VP2的重組病毒rHVT-VP2。rHVT-VP2插入序列正確，能夠穩(wěn)定表達(dá)VP2蛋白，在CEF上具有良好的復(fù)制能力，免疫雞后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IBDV中和抗體，并對IBDV強(qiáng)毒攻擊提供良好免疫保護(hù)。重組病毒rHVT-VP2的成功構(gòu)建為IBD重組HVT活載體疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。