蘇尼特羔羊褐色脂肪鑒定及特征研究

方勤圓，付紹印，王 標(biāo)，何小龍，何江峰，王力偉，陳 欣，張 林，王大清，張立嶺，劉永斌*

(1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031)

哺乳動(dòng)物脂肪組織主要可以分為白色脂肪組織(white adipose tissue, WAT)和褐色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT)[1]。其中，白色脂肪在哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布最為廣泛，主要功能是儲(chǔ)存能量。不同于白色脂肪組織，褐色脂肪組織是幼小哺乳動(dòng)物非顫栗性產(chǎn)熱的主要熱量來源，同時(shí)消耗機(jī)體攝取的過剩能量，維持能量平衡[2]。并且褐色脂肪細(xì)胞內(nèi)具有豐富的線粒體與細(xì)胞色素，使得細(xì)胞呈現(xiàn)褐色[3]，線粒體內(nèi)膜上有解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1, UCP1)。UCP1蛋白由305個(gè)氨基酸組成，形成6個(gè)由α-螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域，分子量為32 ku。UCP1蛋白能夠通過解偶聯(lián)作用降低膜電位，形成質(zhì)子滲漏由此介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)熱。隨著人們生活水平的提高，由飲食引發(fā)的糖尿病越來越普遍，研究人員也越來越關(guān)注這種高發(fā)疾病的治療方法。其中褐色脂肪組織與糖尿病以及肥胖的治療密切相關(guān)，因此一直備受關(guān)注。鑒于褐色脂肪的特殊性，越來越多關(guān)于褐色脂肪的研究也開始轉(zhuǎn)向大型哺乳動(dòng)物，尤其是家畜。研究人員期望通過提高家畜的褐色脂肪含量來減少白色脂肪沉積，提高瘦肉率，由此提高肉品風(fēng)味和口感。

在世界各地眾多的綿羊品種中，蒙古羊是歷史悠久、分布廣泛、種群多樣、特征明顯、品種眾多、規(guī)模最大的亞洲種群之一。其主體分布于蒙古高原及其周邊高原，其中規(guī)模最大、最有特色、綜合性能最突出的種群分布于蒙古高原東部[4]。例如生活在內(nèi)蒙古自治區(qū)的錫林郭勒半干旱草原上的蘇尼特羊。蘇尼特羊?qū)儆诿晒畔稻d羊的一種，是肉脂兼用粗毛型地方綿羊品種[5]，具有耐寒、抗旱、適應(yīng)性強(qiáng)、肉鮮嫩多汁、無膻味、胴體豐滿，肉層厚實(shí)緊湊、高蛋白、低脂肪、瘦肉率高、板皮厚等優(yōu)點(diǎn)[5]。蘇尼特羊的相關(guān)研究大多集中在肉品質(zhì)與脂肪沉積等方面，但是很少與褐色脂肪相關(guān)。利用體外培養(yǎng)技術(shù)可以充分研究和利用褐色脂肪細(xì)胞，從胚胎或羔羊的BAT中分離出褐色脂肪前體細(xì)胞，在體外研究褐色脂肪的分化和功能以及與白色脂肪之間的關(guān)系。進(jìn)而深入研究蘇尼特羊BAT在體內(nèi)的生物學(xué)功能并進(jìn)一步利用BAT選育和培育耐寒和瘦肉型的蘇尼特羊。但是對于蘇尼特羊褐色脂肪特點(diǎn)并沒有較為系統(tǒng)的研究，為彌補(bǔ)這一空白，本研究從細(xì)胞形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、基因水平和蛋白水平系統(tǒng)探究蘇尼特羊褐色脂肪的分布特點(diǎn)，初步了解蘇尼特羊的BAT分布。對進(jìn)一步研究褐色脂肪在家畜個(gè)體生長代謝方面以及優(yōu)化育種方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 蘇尼特羊來源于巴彥淖爾市烏拉特中旗蘇尼特羊種羊場，相同飼養(yǎng)條件下(母乳喂養(yǎng))，選擇出生1、7和30 d的蘇尼特羊各3只，包括2只公羊1只母羊。不同日齡蘇尼特羊平均體重分別為3.83、6.75、11.17 kg。

1.1.2 主要試劑及儀器 無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木素-伊紅染液購自武漢谷歌生物科技；脂肪專用固定液、電鏡固定液、BSA均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Master Mix、TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ均購自TaKaRa公司。Anti-UCP1 Antibody購自Abcam；Anti β-Actin Mouse Monoclonal Antibody、Goat Anti-Mouse IgG， HRP Conjugated、Goat Anti-Rabbit IgG，HRP Conjugated均購自康為世紀(jì)。脂肪組織蛋白提取試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒均購自百奧萊博。

脫水機(jī)、包埋機(jī)、凍臺(tái)購自武漢俊杰電子有限公司、病理切片機(jī)購自上海徠卡儀器有限公司、組織攤片機(jī)購自浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司、NIKON ECLIPSE CI正置光學(xué)顯微鏡廠家為日本尼康、Leica UC7切片機(jī)購自Leica公司、TECNAI G2 20 TWIN透射電子顯微鏡廠家為FEI、熒光定量PCR儀、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)印儀和高壓電泳儀購自美國BIO-RAD公司、全波長掃描式多功能讀數(shù)儀、低溫高速離心機(jī)購自美國THERMO FISHER公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 采用放血法處死羔羊后，采集皮下脂肪，包括頸部、背部、尾部、胸部和腹股溝脂肪，以及內(nèi)臟脂肪，包括腎周脂肪和心包脂肪。采集的脂肪一部分立即投入脂肪專用固定液中，一部分投入電鏡固定液中，用于切片的制作；一部分投入液氮中，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA及蛋白。

1.2.2 石蠟切片與HE染色 固定至少24 h后，將脂肪組織從固定液中取出，進(jìn)行修塊。經(jīng)過脫水浸蠟、包埋后，切成厚度為4 μm的薄片，再進(jìn)行脫蠟、染色、脫水、封片等步驟。在光學(xué)顯微鏡下鏡檢，進(jìn)行圖像采集。在200倍視野下，選取脂肪組織切片的5個(gè)視野，利用軟件Image-Pro Plus 6.0，對脂滴面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 石蠟切片脫蠟后將切片放在盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，脫色搖床上晃動(dòng)洗滌。切片放入3%雙氧水中，避光、室溫條件下孵育25 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。3% BSA室溫封閉。在切片上滴加配好的一抗，4 ℃孵育過夜。洗滌后加二抗孵育。洗滌后稍甩干后滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察控制顯色時(shí)間，顯色棕黃色為陽性位點(diǎn)，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片。

1.2.4 透射電鏡 將脂肪組織在4 ℃條件下固定2～4 h后取出，進(jìn)行漂洗、固定、脫水、滲透、包埋等步驟，切成60～80 nm的超薄切片。在進(jìn)行鈾鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.2.5 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用TRIzol法提取各部位脂肪組織的總RNA，對RNA的濃度與純度進(jìn)行檢測。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找目的基因Ucp1和內(nèi)參基因GAPDH的序列。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)。通過比對確保其特異性后交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 Ucp1和GAPDH基因引物序列

實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s；62 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s；72 ℃ 7 min；40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.6 蛋白提取以及Western blot 脂肪組織總蛋白提取：取200 mg脂肪組織樣本剪碎，加入500 μL蛋白提取液，震蕩使其充分勻漿。將組織勻漿轉(zhuǎn)移到一預(yù)冷的干凈離心管中，置于冰上1 h，每隔5～6 min用移液器吹打混勻。在4 ℃，12 000×g條件下離心15 min。將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，得到蛋白樣品。用BCA法測定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉，一抗1∶1 000稀釋后4 ℃孵育過夜，洗滌后二抗孵育，洗滌后ECL顯色。按照Western blot試驗(yàn)條件重復(fù)3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 根據(jù)2-ΔCt方法計(jì)算不同組織間基因相對表達(dá)水平，用Graphpad Prism6.0軟件進(jìn)行作圖。對不同部位以及不同日齡脂肪組織的基因表達(dá)量進(jìn)行獨(dú)立性t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 蘇尼特羊褐色脂肪組織和白色脂肪組織特點(diǎn)

2.1.1 不同類型脂肪組織的HE染色 對蘇尼特羔羊的各部位脂肪進(jìn)行HE染色，有兩種不同類型的脂肪細(xì)胞，褐色脂肪細(xì)胞和白色脂肪細(xì)胞。褐色脂肪細(xì)胞內(nèi)為多室的小脂滴。白色脂肪細(xì)胞為空泡狀的單室大脂滴，細(xì)胞核被大脂滴擠壓到細(xì)胞邊緣(圖1A、1B)。BAT的脂滴面積小于WAT的脂滴面積，且差異顯著(P<0.05，圖1C)。

*. 差異顯著(P<0.05)，下同

2.1.2 不同類型脂肪組織的透射電鏡 通過對不同類型脂肪組織進(jìn)行透射電鏡觀察，褐色脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴為多室的小脂滴，并且在脂滴之間分布著大量有嵴的線粒體，線粒體呈現(xiàn)圓形或橢圓形(圖2A、2B)。白色脂肪細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)空泡狀的大脂滴，幾乎占滿了細(xì)胞的整個(gè)空間，細(xì)胞核被大脂滴擠壓到了細(xì)胞的邊緣，細(xì)胞內(nèi)只有少量的線粒體(圖2C、2D)。

2.1.3 不同類型脂肪組織的免疫組化 對BAT和WAT切片進(jìn)行免疫組化，觀察BAT特異性蛋白UCP1在細(xì)胞中的分布。BAT中有大量顯示棕黃色的陽性位點(diǎn)(圖3A)，同時(shí)也能觀察到組織中含有小脂滴的細(xì)胞，在細(xì)胞中間或邊緣有藍(lán)紫色的細(xì)胞核。而WAT中沒有陽性位點(diǎn)(圖3B)。對免疫組化的陽性位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析表明，BAT與WAT的陽性位點(diǎn)差異極顯著(P<0.01，圖3C)。

***. 差異極顯著(P<0.01)，下同

2.2 不同日齡羊各部位脂肪形態(tài)特點(diǎn)

對不同日齡蘇尼特羊各部位脂肪進(jìn)行HE染色?？梢杂^察到出生1 d時(shí)腎周、頸部、背部、腹股溝和心包脂肪都有褐色脂肪細(xì)胞的分布。出生7 d時(shí)腎周、頸部、腹股溝和心包脂肪有褐色脂肪細(xì)胞。出生30 d時(shí)，腎周、頸部、心包脂肪依舊有少量的褐色脂肪細(xì)胞分布在白色脂肪細(xì)胞之間。而尾部脂肪和胸部脂肪都是白色脂肪細(xì)胞(圖4)。

PrF. 腎周脂肪；CF. 頸部脂肪；DF. 背部脂肪；TF. 尾部脂肪；StF. 胸部脂肪；IngF. 腹股溝脂肪；PcF. 心包脂肪;下同

2.3 不同日齡羊各部位脂肪組織Ucp1的表達(dá)

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同日齡蘇尼特羊各部位脂肪組織Ucp1基因的表達(dá)。出生1 d時(shí)，腎周脂肪的Ucp1基因表達(dá)量最高，頸部、背部、腹股溝和心包脂肪都有Ucp1基因表達(dá)。7 d時(shí)，腎周、頸部、心包脂肪基因表達(dá)量較高，與出生1 d時(shí)差異不顯著。30 d時(shí)，Ucp1基因表達(dá)量較低，下降幅度較大。尾部和胸部脂肪組織已檢測不到Ucp1基因的表達(dá)(圖5)。

圖5 不同日齡蘇尼特羊各部位脂肪組織的Ucp1基因表達(dá)

2.4 不同日齡羊各部位脂肪組織UCP1蛋白表達(dá)

通過Western blot檢測不同日齡蘇尼特羊各部位脂肪組織UCP1蛋白的表達(dá)。出生1 d時(shí)，腎周脂肪的UCP1蛋白表達(dá)量最高，頸部、背部、腹股溝和心包脂肪都有UCP1蛋白表達(dá)。7 d時(shí)，腎周、頸部、心包脂肪蛋白表達(dá)量較高，與出生1 d時(shí)差異不顯著。30 d時(shí)，除了腎周脂肪，其他部位UCP1蛋白表達(dá)量較低，下降幅度較大。尾部和胸部脂肪組織已檢測不到UCP1蛋白表達(dá)(圖6)。

圖6 不同日齡蘇尼特羊各部位脂肪組織的UCP1蛋白表達(dá)

3 討 論

3.1 蘇尼特羔羊褐色脂肪的鑒定

事實(shí)上，BAT它既不能稱為脂肪，也不能稱為肉，介于兩者之間，類似于牛乳腺，這是最早對于褐色脂肪的形態(tài)描述。通過對蘇尼特羊脂肪的組織學(xué)觀察，本研究發(fā)現(xiàn)蘇尼特羊的褐色脂肪和白色脂肪有明顯的形態(tài)學(xué)差異。類似于小鼠褐色脂肪與白色脂肪的顏色[6]，通過解剖蘇尼特羔羊，采集不同部位的脂肪，可以觀察到蘇尼特羊褐色脂肪顏色呈現(xiàn)類似肌肉的紅褐色，與白色脂肪相比顏色更深。蘇尼特羊脂肪經(jīng)過HE染色之后，褐色脂肪由于細(xì)胞內(nèi)脂滴為多室的小脂滴，而白色脂肪細(xì)胞內(nèi)單室的大脂滴占滿細(xì)胞的整個(gè)空間。白色脂肪的脂滴面積顯著大于褐色脂肪的脂滴面積。通過脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和褐色脂肪特異性標(biāo)記基因Ucp1的檢測，能夠鑒定出不同部位、日齡的脂肪類型。Basse等[7]對特克賽爾羊和哥特羊雜交的后代綿羊進(jìn)行褐色脂肪的相關(guān)研究，不同類型脂肪組織的HE染色顯示出同樣的結(jié)果。Gemmell等[8]早在1972年就通過透射電鏡對綿羊褐色脂肪線粒體進(jìn)行了系統(tǒng)地觀察，表明褐色脂肪具有較多的線粒體，并且線粒體的嵴較多且平行排列。隨著脂肪類型的變化，線粒體數(shù)量逐漸變少，線粒體嵴變得不規(guī)則。本試驗(yàn)中，蘇尼特羊褐色脂肪的透射電鏡也顯示細(xì)胞內(nèi)分布著大量的具有規(guī)則嵴的線粒體；而在白色脂肪細(xì)胞內(nèi)，線粒體數(shù)量極少，且并不是所有線粒體嵴都規(guī)則排列。通過不同類型脂肪細(xì)胞的結(jié)構(gòu)以及分子特點(diǎn)，確定了不同的脂肪組織類型。

3.2 蘇尼特羊褐色脂肪分布部位

蘇尼特羊7個(gè)部位中，腎周、頸部、背部、腹股溝和心包都有褐色脂肪細(xì)胞分布。褐色脂肪在人體內(nèi)主要分布在腎周、頸部、肩胛部、腋下和脊柱旁等部位[9]，在小鼠體內(nèi)的分布與在人體內(nèi)分布相似。2009年，Marken等[10]通過正電子發(fā)射斷層-X射線計(jì)算機(jī)斷層掃描(positron emission tomography, computer tomography，PET-CT)發(fā)現(xiàn)成人體內(nèi)，主要為肩胛部有褐色脂肪的分布。關(guān)于嚙齒類動(dòng)物褐色脂肪的研究，褐色脂肪來源部位一般為肩胛部[6,11]。綿羊褐色脂肪的研究也大多集中于腎周脂肪[12-13]，在本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)腎周脂肪中褐色脂肪細(xì)胞數(shù)量最多，UCP1表達(dá)量最高。而蘇尼特羊尾部和前胸部脂肪都是白色脂肪。綿羊尾部脂肪在胚胎時(shí)期就開始沉積，出生后脂尾已經(jīng)基本形成，但是無論在哪個(gè)時(shí)期都沒有研究表明尾脂中有褐色脂肪細(xì)胞。本試驗(yàn)得出相同的結(jié)論，說明尾部是白色脂肪的經(jīng)典部位。Thompson等[14]的研究通過褐色脂肪的特異性標(biāo)記蛋白UCP1的表達(dá)證明在綿羊體內(nèi)背部脂肪有褐色脂肪細(xì)胞。也有研究表明綿羊心包脂肪中有UCP1的表達(dá)[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)背部和心包脂肪有褐色脂肪細(xì)胞。2017年Henry等[16]研究了雌性綿羊胸骨脂肪的產(chǎn)熱作用，研究結(jié)果表明成年母羊胸部脂肪有褐色脂肪細(xì)胞存在，但是在本試驗(yàn)中沒有檢測到胸部脂肪有褐色脂肪細(xì)胞。

3.3 不同日齡蘇尼特羊褐色脂肪變化

反芻動(dòng)物常常作為研究褐色脂肪分化的動(dòng)物模型，很早就有研究發(fā)現(xiàn)綿羊在出生時(shí)UCP1表達(dá)處于峰值，隨著個(gè)體生長，WAT不斷增加，UCP1表達(dá)逐漸下降[17-20]。在140 d的胎羊中可以檢測到Ucp1的表達(dá)，說明從妊娠后期開始，胎羊開始分化出褐色脂肪[20]。隨著時(shí)間的增長，UCP1表達(dá)逐漸下降，到1個(gè)月時(shí)已完全沒有褐色脂肪細(xì)胞[15]。有研究測定了出生1、7和30 d綿羊Ucp1基因的表達(dá)，結(jié)果顯示在出生1 d時(shí)其表達(dá)達(dá)到峰值，隨后下降，到30 d時(shí)沒有表達(dá)[18]。還有研究表明，Ucp1 mRNA在綿羊所有組織和2～12個(gè)月齡各階段均有表達(dá)，但在腎周脂肪中的表達(dá)水平明顯高于其他組織，皮下脂肪的表達(dá)水平低于深部脂肪[21]。本試驗(yàn)表明，蘇尼特羊在出生1和7 d時(shí)都有褐色脂肪細(xì)胞，UCP1的表達(dá)量較高，到出生30 d時(shí)UCP1的表達(dá)降低。在出生30 d時(shí)腎周、頸部和心包等部位依舊有褐色脂肪細(xì)胞。推測蘇尼特羊褐色脂肪的這種分布特點(diǎn)可能是對環(huán)境產(chǎn)生的一種應(yīng)激，以此來彌補(bǔ)本身發(fā)育的不完善。

褐色脂肪的分布本身就具有異質(zhì)性，激活褐色脂肪活性的因素較多。包括環(huán)境以及營養(yǎng)條件等都會(huì)不同程度地影響綿羊褐色脂肪，尤其母羊妊娠后期的環(huán)境會(huì)極大地影響出生羔羊的褐色脂肪含量。例如高海拔缺氧環(huán)境[22]、寒冷環(huán)境[23]和脂肪酸攝入[24]等。因此在不同品種綿羊中褐色脂肪分布的差異性可能與外界環(huán)境有較大的關(guān)系。要研究綿羊的褐色脂肪特點(diǎn)以及這種差異產(chǎn)生的原因則需要設(shè)置更加密集的時(shí)間點(diǎn)、選擇更多品種的綿羊進(jìn)行比較以及通過轉(zhuǎn)錄組測序等方法進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié) 論

本研究通過形態(tài)學(xué)觀察和BAT標(biāo)記基因、蛋白檢測區(qū)分并鑒定了蘇尼特羔羊的褐色脂肪和白色脂肪，證明了褐色脂肪的主要來源部位是腎周，而尾部是白色脂肪的主要來源部位。出生1和7 d時(shí)褐色脂肪細(xì)胞數(shù)量較多，出生30 d時(shí)，褐色脂肪細(xì)胞數(shù)量，標(biāo)記基因、蛋白表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢。