可轉(zhuǎn)移黏菌素耐藥基因mcr:控制革蘭陰性菌感染“最后一道防線”的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)

胡 俊，丁帥帥，魏述永

(西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶 402460)

隨著動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性不斷加劇，一度因腎毒性及神經(jīng)毒性而使用受限的黏菌素重新引起重視，并被認(rèn)為是獸醫(yī)臨床控制多藥耐藥革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”。然而，近年來，可轉(zhuǎn)移黏菌素耐藥基因mcr的快速擴(kuò)散，使得黏菌素的防線意義面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。mcr是磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族編碼基因的成員，可在不同細(xì)菌和宿主物種間水平傳播并導(dǎo)致受體細(xì)菌低水平黏菌素耐藥，給公共衛(wèi)生安全帶來了潛在威脅[1-4]。

黏菌素是一種陽(yáng)離子多肽類抗生素，具有親脂性脂肪酰側(cè)鏈，作用于許多革蘭陰性菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)中的脂質(zhì)A，其帶正電荷的α、γ-二氨基丁酸可與脂質(zhì)A的負(fù)電荷磷酸基團(tuán)產(chǎn)生靜電作用，引起Ca2+、Mg2+等二價(jià)陽(yáng)離子取代，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞質(zhì)滲漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。MCR蛋白與各種細(xì)菌中的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶有約60%的相似性，可由5個(gè)跨膜螺旋將自身錨定在細(xì)胞膜的周質(zhì)中，然后通過磷酸乙醇胺共價(jià)修飾脂多糖的脂質(zhì)A，導(dǎo)致脂質(zhì)A和黏菌素之間的親和力降低并耐藥[1,6]。

自2016年首次報(bào)道以來，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了mcr-1～mcr-10共10類43個(gè)mcr的突變體[7-9]，本文對(duì)其發(fā)現(xiàn)、流行規(guī)律、同源性、進(jìn)化分析、分子特征、陽(yáng)性質(zhì)粒類型等研究進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 mcrs的發(fā)現(xiàn)及流行情況

1.1 mcrs的發(fā)現(xiàn)及宿主細(xì)菌

mcr-1[1]、mcr-1.3[10]、mcr-1.4[11]、mcr-1.5[12]、mcr-1.7[11]、mcr-1.8(直接提交到NCBI)，mcr-1.9[13]、mcr-1.11～mcr-1.13[14]首檢于大腸桿菌，其余突變體mcr-1.2[15]、mcr-1.6[16]和mcr-1.10[17]分別在肺炎克雷伯菌、沙門菌和莫拉菌中首次檢出。在已發(fā)現(xiàn)的mcr-3的11個(gè)突變體中，mcr-3[18]、mcr-3.2[19]、mcr-3.5[20]、mcr-3.11[21]和mcr-3.12[22]分別在大腸桿菌中首次檢出，mcr-3.3[23]、mcr-3.6～mcr-3.9[24]和mcr-3.10[25]分別在維氏氣單胞菌、異常嗜糖氣單胞菌、中間氣單胞菌、嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌中首次檢出。其他mcrs的發(fā)現(xiàn)信息[26-43]如表1所示。

表1 mcrs的首檢信息

(續(xù)表1 Continued)

現(xiàn)已報(bào)道的mcrs的宿主細(xì)菌有20多種，多數(shù)屬于腸桿菌科(大腸桿菌、沙門菌、肺炎克雷伯菌等)、氣單胞菌科(維氏氣單胞菌、異常嗜糖氣單胞菌、中間氣單胞菌等)及莫拉菌科(莫拉菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等)。從檢出率、分布范圍及陽(yáng)性mcr類型分析，腸桿菌科細(xì)菌是其最重要的宿主細(xì)菌。另外，多數(shù)宿主細(xì)菌在自然界中廣泛分布，且可達(dá)成mcr種間水平轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致該耐藥基因全球流行。需要注意的是，mcr宿主細(xì)菌包括一些臨床重要的人畜共患病原菌，這可能會(huì)給公共衛(wèi)生安全帶來潛在風(fēng)險(xiǎn)。例如，莫拉菌已被證實(shí)為mcr基因的宿主細(xì)菌，其主要感染動(dòng)物，但也可以感染人類[28-29]。其他人畜共患的mcrs宿主細(xì)菌還包括大腸桿菌[28-29]、沙門菌[28-29]、嗜水氣單胞菌[29]、豚鼠氣單胞菌[24-25]等。mcr的宿主細(xì)菌[44-83]見表2。

表2 mcr基因的宿主細(xì)菌

1.2 mcrs流行規(guī)律及影響因素

mcrs已在全世界50多個(gè)國(guó)家廣泛傳播，并覆蓋除南極洲以外的所有大陸。根據(jù)PubMed、Google scholar以mcr作為關(guān)鍵詞的檢索結(jié)果，篩選出相關(guān)研究論文發(fā)表數(shù)量最高的10個(gè)國(guó)家及其主要流行的mcrs突變體類型，如表3所示。

表3 mcr檢出率最高的國(guó)家及其流行的突變體種類

在mcrs中，mcr-1的檢出率最高、突變體最多，mcr-9也在六大洲廣泛分布，并與mcr-1共同成為全球傳播的黏菌素耐藥決定因素[96]。mcr-3和mcr-5也是廣泛傳播的mcr基因，而其他mcr家族基因分布在較小的區(qū)域(mcr-4、mcr-2、mcr-8)或分散分布(mcr-7)。到目前為止，只在英國(guó)發(fā)現(xiàn)過一例關(guān)于mcr-6基因的報(bào)道。就區(qū)域來看，亞洲是報(bào)道m(xù)cr最多的大洲。同樣，歐洲和美洲——如西班牙、意大利、德國(guó)、美國(guó)、巴西和阿根廷等相關(guān)報(bào)道也在增加[97]。

mcr的快速傳播歸因于其通過質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子水平轉(zhuǎn)移的能力，低濃度黏菌素的持續(xù)壓力加速了這種傳播[97]，而這種壓力來源于獸醫(yī)治療或預(yù)防感染中使用的以及飼料中添加的黏菌素[98]。此外，mcr的廣泛傳播也與跨國(guó)旅行、世界貿(mào)易、食物鏈控制或預(yù)防不足等相關(guān)，并可能增加mcr的人畜共患傳播風(fēng)險(xiǎn)[99-100]。

2 mcrs同源性及進(jìn)化關(guān)系

2.1 相似性

同類mcr突變體間的相似性十分相近。以mcr-1為例，除了mcr-1.10之外，mcr-1及其大多數(shù)突變體間只有1～2個(gè)核苷酸突變。然而，mcr-1.10與mcr-1之間存在較大的差異，包括36個(gè)核苷酸突變引起的7個(gè)氨基酸替換，其中，3個(gè)氨基酸變化發(fā)生在N端蛋白區(qū)域，mcr-1與mcr-1.10之間的蛋白相似性為98.7%[17](表4)。但MCR間相似度差異較大，除MCR-2與MCR-1 (80%)、MCR-7與MCR-3(70%)、MCR-9與MCR-8(65%)、MCR-10和MCR-9(82.93%)相似性較高外，其余MCR間的相似性僅為40%左右，甚至更低?？梢婋m然具有相近的催化活性并導(dǎo)致黏菌素耐藥，但MCR間相似性差異較大，這可能與其不同的菌種起源有關(guān)。

表4 mcr基因的序列差異

2.2 進(jìn)化關(guān)系

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，MCR-1和MCR-2可能起源于莫拉菌，其序列與卡他莫拉菌染色體基因編碼的mcr樣蛋白的氨基酸相似性分別為59%和60%[29]。通過僅在殺鮭氣單胞菌中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子TnAs2的分析，腸桿菌科細(xì)菌的mcr-3基因可能起源于氣單胞菌[18]。mcr-4家族可能起源于冷海希瓦菌，由質(zhì)粒攜帶的mcr-4.3與冷海希瓦菌NCIMB 400的染色體DNA片段(約1.7 kb)100%匹配(登錄號(hào): CP000447)[101]。MCR-5.1及其變異體MCR-5.2與MCR-3和MCR-4家族有共同的祖先[79]。MCR-6可能起源于莫拉菌。MCR-7.1與MCR-3和MCR-3樣序列具有相近的遺傳距離，同樣來源于氣單胞菌。MCR-8的起源仍不清楚[83]。MCR-9和MCR-10蛋白共同起源于一個(gè)尚未確定的物種，與已知的布丘菌密切相關(guān)[43]。

(續(xù)表4 Continued)

3 MCR的分子特征

3.1 MCR蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)

所有預(yù)測(cè)的MCR-1～MCR-10的結(jié)構(gòu)均具有兩個(gè)高度保守的EptA結(jié)構(gòu)域：一個(gè)N端含有5個(gè)跨膜α-螺旋的膜錨定結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)C端可溶性催化結(jié)構(gòu)域[42-43]。三維模型顯示，MCR-1～MCR-10膜錨定結(jié)構(gòu)域和可溶性催化域具有高度的保守性[43]。MCR的關(guān)鍵殘基可能對(duì)LptA和EptC的催化活性很重要[1]，這些結(jié)構(gòu)域可以錨定MCR并完成細(xì)胞膜質(zhì)周表面脂質(zhì)A的共價(jià)修飾[6]。此外，MCR-1和MCR-2的跨膜和催化結(jié)構(gòu)域是可互換的，但MCR-1和MCR-4的跨膜和催化結(jié)構(gòu)域在功能上是不可互換的。交換MCR-4和MCR-1或MCR-3的跨膜結(jié)構(gòu)域可使酶失活，并且不能賦予敏感大腸桿菌黏菌素耐藥性[101]。

3.2 MCRs的催化活性

底物和金屬原子是MCR維持其催化活性所必需的，半胱氨酸形成的二硫鍵對(duì)催化結(jié)構(gòu)域起到了穩(wěn)定作用[102]。MCR-1活性維持的必需殘基(Glu246、His395和磷酸化位點(diǎn)Thr285)及重要?dú)埢?Lys333、Glu468和His478)在MCR-2中是嚴(yán)格保守的[103]。MCR-1的催化結(jié)構(gòu)域Thr285和MCR-3的催化結(jié)構(gòu)域Thr277在介導(dǎo)黏菌素抗性中發(fā)揮了重要作用。在MCR-1將PEA轉(zhuǎn)移到脂類A的過程中，催化結(jié)構(gòu)域的保守殘基Thr285被認(rèn)為是PEA基團(tuán)的受體，而在MCR-3中，Thr277起到親核基團(tuán)的作用，是負(fù)責(zé)催化反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸[102]。

在許多MCR中，類似鋅結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域具有明顯的進(jìn)化保守性且對(duì)酶的功能非常重要[68,104-106]。Zn2+在MCR-1和MCR-2中均與Glu246、Thr285和Asp465進(jìn)行四面體幾何配位[107]，并與MCR-3中的Glu238、Thr277、Asp450和His451結(jié)合形成四面體配位結(jié)構(gòu)[105]。而在MCR-4中，單個(gè)鋅原子與E240、T278、H377、D452和H453結(jié)合，五個(gè)鋅結(jié)合殘基中的任何一個(gè)突變都完全使MCR-4失去功能[101]。與MCR-1相比，MCR-5.3的鋅離子和殘基更加保守且親和性更高[37]。

4 mcrs遺傳背景

4.1 可移動(dòng)元件

插入序列、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)遺傳元件(mobile genetic elements，MGEs)在mcrs傳播中起著至關(guān)重要的作用[13]。例如：ISApl1(IS30家族的一個(gè)插入序列(insertion sequence，IS)對(duì)于mcr-1水平轉(zhuǎn)移具有重要意義[108]。然而，mcr-1的傳播并非必定與ISApl1有關(guān)，mcr-1.9基因可以在mcr-pap2元件中的上游IS26元件缺失的情況下轉(zhuǎn)移，以及沒有ISApl1或只有一個(gè)拷貝的情況水平轉(zhuǎn)移，且ISApl1對(duì)于mcr-1在質(zhì)粒上的穩(wěn)定性是非必須的[109-110]。此外，在mcr-3陽(yáng)性質(zhì)粒上游發(fā)現(xiàn)了缺失的ISKpn40，mcr-3與ISKpn40的結(jié)合可能促進(jìn)了它的易位[21]。mcr-8的傳播與IS元件IS903B和ISEcl1相關(guān)，IS903B的2個(gè)完整的ISs位于pkp91中mcr-8的上游或下游，而在WCHKP1845中，起源于陰溝腸桿菌的ISEcl1存在于mcr-8的下游[39]。

Tn3家族參與了mcr-3和mcr-5的水平轉(zhuǎn)移。在mcr-3陽(yáng)性大腸桿菌質(zhì)粒pWJ1中， Tn3家族轉(zhuǎn)座子TnAs2位于mcr-3的上游[18]。在銅綠假單胞菌MRSN 12280的染色體中，mcr-5基因嵌入在一個(gè)具有38 bp反向重復(fù)序列的Tn3家族轉(zhuǎn)座子中，插入后產(chǎn)生一個(gè)5 bp的靶位點(diǎn)重復(fù)(TCCAT)[78]。同樣，mcr-5.2插入到一個(gè)ColE質(zhì)粒的Tn3家族轉(zhuǎn)座子中而水平轉(zhuǎn)移[36]。

4.2 陽(yáng)性質(zhì)粒

14種質(zhì)粒與mcr-1的傳播有關(guān)，包括IncI2[27,111-112]、IncX4[93,113-114]、IncHI2[44, 52, 88]、IncHI1[115]、IncP[11]、IncF[116]、IncFI[55]、IncFⅡ[94]、IncY[117]、IncK2[118]、IncN[119]和IncFIB[120]等，見圖1。驅(qū)動(dòng)mcr-1傳播的三種主要質(zhì)粒是IncI2、IncX4和IncHI2[1,121-123]，它們是mcr-1陽(yáng)性質(zhì)粒的主要類別[123]。mcr-1陽(yáng)性IncX4質(zhì)粒比IncI2和IncHI2質(zhì)粒具有更廣泛的傳播能力。mcr-1陽(yáng)性的IncI2和IncHI2質(zhì)粒的傳播是區(qū)域性的。對(duì)來自7個(gè)不同物種腸桿菌科的219個(gè)攜帶mcr-1的質(zhì)粒進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示75%的IncHI2質(zhì)粒來自歐洲，65.8%的IncI2質(zhì)粒來自亞洲[123]。IncI2質(zhì)粒攜帶的mcrs有mcr-1[116]、mcr-1.3[10]、mcr-1.5[12]、mcr-1.7[11]、mcr-1.11[60]、mcr-3.10[25]、mcr-7.1[38]，IncX4質(zhì)粒攜帶的有mcr-1[93]、mcr-1.2[89]、mcr-1.4[11]、mcr-1.9[13]、mcr-1.14和mcr-2[11]。而mcr-4、mcr-5及其突變體主要在較寬的寄主范圍內(nèi)檢測(cè)到，多拷貝的ColE小型質(zhì)粒。不同于大多數(shù)mcr-1陽(yáng)性的窄宿主范圍質(zhì)粒，如IncI2和IncX4，mcr-3陽(yáng)性質(zhì)粒IncP-1是在各種環(huán)境中被鑒定的寬宿主范圍質(zhì)粒，這可能是導(dǎo)致mcr-3比mcr-1傳播更廣泛的原因[124]。

IncI2：mcr-1[27, 111]，mcr-1.3[10]， mcr-1.5[12, 61]，mcr-1.7[11]，mcr-1.9[85]，mcr-1.11[60]，mcr-3.10[25]，mcr-7.1[38]；IncX4：mcr-1[93]，mcr-1.2[89]，mcr-1.4[11]，mcr-2[11]，mcr-1.9[13]；IncHI2：mcr-3[18]，mcr-3.2[19]，mcr-1[107]，mcr-9[42]；IncHI1：mcr-1[107]，mcr-1.5[128]；IncP：mcr-1.6[16]，mcr-3.5[20]，mcr-1[107]，mcr-3.11[21]，mcr-3[68]；IncF：mcr-1[107]，mcr-3[129]；IncFI：mcr-1[107]，mcr-8.2[40]；IncFⅡ：mcr-1[107]，mcr-8[39]，mcr-8.4[41]，mcr-3[130]；ColE：mcr-5[35]，mcr-5.2[36]，mcr-4.3[33]，mcr-4[31]，mcr-4.2[74]，mcr-4.4[131]；IncR：mcr-8.2[40]；IncA/C2：mcr-3.12[22]，mcr-3[76]；IncY：mcr-1[118]；IncK2：mcr-1[119]；IncFIB：mcr-1[121]；IncN：mcr-1[132]，mcr-3.19[132]；IncFIA：mcr-10[43]

就流行性而言，除流行區(qū)域與宿主范圍外，mcr陽(yáng)性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率和穩(wěn)定性也是需要考慮的因素。例如，IncX4質(zhì)粒較IncI2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率更快，IncX4質(zhì)粒中還具有保守的TA樣穩(wěn)定位點(diǎn)TsxAB，該位點(diǎn)在轉(zhuǎn)移抗生素耐藥基因和質(zhì)粒穩(wěn)定性中起重要作用，而IncHI2質(zhì)粒是遺傳上最易變的，它擁有一個(gè)由抗性相關(guān)基因組成的多藥耐藥區(qū)域。另外需要指出的是，一些mcr基因(mcr-1.10、mcr-2.2、mcr-3.3等)是染色體編碼的，較質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，但不能水平傳播。

5 展 望

mcrs的全球傳播已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，并采取了眾多措施防止因其擴(kuò)散而引起的黏菌素耐藥性的傳播。例如，在中國(guó)，從2017年4月1日起，禁止使用黏菌素作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑，致使硫酸黏菌素預(yù)混料的產(chǎn)量從2015年的27 170 t下降到2018年的2 497 t，硫酸黏菌素預(yù)混料的銷售額也從7 150萬美元下降到800萬美元[125]。此外，美國(guó)的食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)、加拿大的公共衛(wèi)生局(Public Health Agency，PHA)、歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)、英國(guó)相關(guān)部門也采取了相應(yīng)的措施限制黏菌素的濫用。在歐盟，2011—2018年，多黏菌素銷售額下降了54%[126]。

mcrs的研究方興未艾，然而，在這些研究中仍然存在一些問題。黏菌素敏感性的體外試驗(yàn)結(jié)果可能受到細(xì)菌種群中的低敏感亞群(異抗性)[127]和LPS結(jié)構(gòu)(O抗原)的差異[128]的影響。此外，黏菌素是一種較大的陽(yáng)離子，在瓊脂上的擴(kuò)散受限，且其可以黏附在普通的塑料實(shí)驗(yàn)室器皿上[129]，因此常規(guī)的藥物敏感性測(cè)試方法，如瓊脂擴(kuò)散法和Etest試紙條，現(xiàn)在被認(rèn)為是不可靠的，導(dǎo)致數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性較低[130]，一些以前報(bào)道的數(shù)據(jù)可能需要重新評(píng)估。因此，臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)建議在陽(yáng)離子調(diào)整的MH肉湯中進(jìn)行肉湯微量稀釋用于黏菌素敏感性試驗(yàn)[131]。另一方面，mcr抗性基因的命名存在一定混亂。保存在國(guó)際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)合作組織(International Nucleotide Sequence Database Collaboration，INSDC)數(shù)據(jù)庫(kù)中的一些新的突變體序列可能會(huì)被給予“保留至發(fā)表”(hold-until publication，HUP)的狀態(tài)，直到相關(guān)手稿被接受。這意味著，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)潛在的新突變體的研究人員可能不知道所有其他已被識(shí)別但尚未公開可用的突變體。為了避免混淆，在提交序列和/或新mcr突變體手稿之前，鼓勵(lì)該領(lǐng)域的作者將新序列提交給INSDC，并通過NCBI(pd-help@ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行mcr突變體編號(hào)的分配和注冊(cè)。如果收到描述可能歸屬于新亞群的相關(guān)基因的手稿，期刊也應(yīng)該推薦并發(fā)起討論[130]。