SPME-GC-MS 聯(lián)用法測定鯉和草魚肌肉揮發(fā)性腥味物質(zhì)的條件優(yōu)化

曲樂天，夏騰，張晶晶，周鑫蔚，許建和，丁祝進(jìn)，陳香凝，程漢良

（江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005）

鯉（Cyprinus carpio）和草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類。2019 年我國鯉養(yǎng)殖產(chǎn)量為2 885 284 t，比2018 年減少了2.6%，比2017 年減少了4%；2019 年草魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為5 533 083 t，比上年增加了0.52%，比2017 年增加了3.43%[1]。大部分消費(fèi)者認(rèn)為鯉的土腥味較草魚更重，這可能是導(dǎo)致鯉和草魚產(chǎn)量變化的潛在因素之一，因此有必要對(duì)比分析鯉和草魚肌肉腥味物質(zhì)的差異。

目前萃取水產(chǎn)品揮發(fā)性腥味物質(zhì)的方法主要有五種，分別是吹掃捕集法、固相微萃取法、有機(jī)溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法，及同時(shí)蒸餾萃取法[2]。由于有機(jī)溶劑萃取法在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后產(chǎn)生的有機(jī)廢液會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，而蒸餾萃取法在萃取過程中揮發(fā)性成分會(huì)損失，所以目前主流的萃取方法是固相微萃取法和吹掃補(bǔ)集法[3]。尤其是固相微萃取方法，其操作簡單、靈敏度很高、所需樣品量少，已被廣泛用于食品、醫(yī)藥檢測[4]。

本文通過篩選萃取纖維、氯化鈉添加量、萃取溫度、萃取時(shí)間、解析時(shí)間等固相微萃取條件，旨在優(yōu)化SPME-GC-MS 聯(lián)用法測定淡水魚肉揮發(fā)性氣味的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鯉和草魚均購自江蘇省連云港市贛榆區(qū)歡墩魚場，體質(zhì)量約為（128.22±1.25）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和萃取纖維

實(shí)驗(yàn)儀器：島津GC-MS（QP2010 SE）、色譜柱為Agilent DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；固相微萃取加熱和磁力攪拌裝置。

萃取纖維為PDMS/DVB/CAR 50/30 μm，不同萃取纖維的固相涂層和厚度對(duì)揮發(fā)性成分的萃取吸附能力不同。PDMS/DVB/CAR 50/30 μm 萃取纖維是由DVB（二乙烯基苯）、CAR（Carboxen）、PDMS（聚二甲基硅氧烷）3 種涂層復(fù)合而成，相較單層萃取纖維可以萃取到更多的揮發(fā)性成分。且這種萃取纖維較長，可以富集更多成分。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 GC-MS 參數(shù):

氣相條件：升溫程序：初始溫度40℃，保持5 min，以4℃/min 升至120℃，保持1 min，以13℃/min 升至250℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣（He）流量：1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，離子源溫度230℃，接口溫度250℃；電子能量70 eV；質(zhì)譜檢測器選擇Scan 檢測方式。

1.3.2 萃取纖維的老化

將PDMS/DVB/CAR 萃取纖維插入氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)行270℃/0.5h 的老化，直至無雜峰出現(xiàn)。

1.3.3 樣品處理

將魚擊暈后取背部肌肉絞碎作為實(shí)驗(yàn)材料。準(zhǔn)確稱取3 g 魚肉于15 mL 頂空瓶中，加入不同濃度NaCl 溶液，加入攪拌子，并用聚四氟乙烯隔墊密封。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)將本實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)置為40℃、50℃、60℃，將萃取時(shí)間設(shè)置為30 min、40 min、50 min。萃取結(jié)束后將萃取纖維插入GC 進(jìn)樣口進(jìn)行解析。

1.3.4 樣品處理

采用SPSS statistics analysis 23.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著水平P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

溫度升高會(huì)加快揮發(fā)性分析物的分子運(yùn)動(dòng)，有利于揮發(fā)性分析物在基質(zhì)中擴(kuò)散，能夠有效縮短平衡所需要的時(shí)間；但溫度過高會(huì)使纖維涂層和基質(zhì)中分析物的分配系數(shù)降低，分析物在纖維上的吸附量將減少，萃取纖維吸附分析組分的能力將會(huì)降低[5-7]。溫度太低會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)不完全，也會(huì)影響萃取效果。

萃取時(shí)間由待分析樣品的分配系數(shù)和樣品基質(zhì)、樣品體積以及分子擴(kuò)散速率、萃取涂層厚度等因素決定[8]。在萃取過程中存在吸附-解吸-吸附的平衡問題，因此并不是吸附時(shí)間越長越好，且實(shí)驗(yàn)時(shí)間越長，頂空瓶中的水蒸氣濃度也會(huì)增加，而水蒸氣會(huì)降低萃取纖維對(duì)揮發(fā)物的吸附。

實(shí)驗(yàn)樣品量為3.00 g，NaCl 濃度為0.36 g/mL，解析時(shí)間為5 min，不同吸附溫度和吸附時(shí)間對(duì)萃取效果的影響見圖1。結(jié)果表明：萃取時(shí)間為30 min，60℃的總峰面積顯著高于40℃、50℃（P＜0.05）。萃取時(shí)間為40 min，60℃的總峰面積依然顯著高于40℃、50℃（P＜0.05），且此時(shí)可發(fā)現(xiàn)，各溫度的總峰面積顯著高于30 min 時(shí)各溫度的總峰面積（P＜0.05）。萃取時(shí)間為50 min，50℃、60℃的總峰面積顯著低于40 min 時(shí)的總峰面積（P＜0.05）。因此可確定，在上述實(shí)驗(yàn)條件下，最佳萃取溫度為60℃，最佳萃取時(shí)間為40 min。

2.1.2 離子濃度對(duì)萃取效果的影響

在樣品進(jìn)行萃取之前添加NaCl 可以降低有機(jī)化合物的溶解度，提高分配系數(shù)，有利于萃取纖維對(duì)待分析化合物的吸附。在固定樣品量為3.00 g，萃取時(shí)間為40 min，萃取溫度為60℃，解析時(shí)間為5 min 的條件下，分別添加不同濃度NaCl（0 g/mL、0.18 g/mL、0.27 g/mL、0.36 g/mL）3 mL，研究NaCl 添加量對(duì)總峰面積的影響。隨著NaCl 濃度不斷升高，總峰面積不斷升高，在NaCl 濃度為0.36 g/mL 時(shí)總峰面積達(dá)到最大值，表明萃取效果最好（圖2）。

圖2 NaCl 添加量對(duì)萃取效率的影響Fig.2 Effect of NaCl spiked levels on extraction efficiency

2.1.3 攪拌對(duì)萃取結(jié)果的影響

攪拌在一定程度上可以加速萃取過程，本實(shí)驗(yàn)比較了不攪拌和攪拌對(duì)部分揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的影響。在攪拌狀態(tài)下，主要揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積均顯著高于不攪拌（P＜0.05），所以攪拌可以明顯提升萃取效果（圖3）。

2.1.4 解析時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響

解析過程是將吸附結(jié)束后的萃取纖維插入GC進(jìn)樣口，利用高溫?zé)峤廨腿☆^上吸附的揮發(fā)性化合物，然后通過載氣（He）將其送入色譜柱中進(jìn)行分析，解析時(shí)間太短會(huì)導(dǎo)致解析不完全，解析時(shí)間過長則會(huì)減少萃取纖維的使用壽命。本實(shí)驗(yàn)在固定樣品量為3.00 g，萃取時(shí)間40 min，萃取溫度60℃，NaCl 濃度為0.36 g/mL 的條件下，將解析時(shí)間設(shè)定為1 min、3 min、5 min、7 min。結(jié)果如圖4，在解析時(shí)間為5 min 時(shí)，總峰面積顯著高于1 min、3 min（P＜0.05），當(dāng)解析時(shí)間超過5 min 后，總峰面積略有降低，因此確定在上述實(shí)驗(yàn)條件下，最佳解析時(shí)間為5 min。

圖4 解析時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.4 Effect of desorption time on extraction efficiency

2.2 鯉、草魚揮發(fā)性成分的鑒定與比較分析

采用上述最優(yōu)萃取條件對(duì)鯉和草魚肌肉中揮發(fā)物質(zhì)進(jìn)行萃取，將鯉和草魚肌肉揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)NIST 譜庫對(duì)比檢索，只選取相似度大于90%的化合物，最終確定鯉和草魚肌肉中的35 種揮發(fā)性成分，并采用峰面積歸一化法計(jì)算各種化合物相對(duì)含量。新鮮鯉肌肉含有5 種醛類化合物（43.32%）、7 種醇類化合物（47.91%）、13 種烷烴（3.96%）、3 種酯（3.40%）、3 種烯烴（0.36%）、3 種酸（0.67%）和1 種酮（0.39%）。新鮮草魚肌肉中含有5 種醛（33.12%）、7 種醇（51.82%）、10 種烷烴（5.95%）、6 種酯（7.32%）、2 種醚（1.03%）、1 種酸（0.07%）、1 種烯烴（0.06%）和1 種酚（0.63%）（表1）。

表1 鯉、草魚肌肉揮發(fā)性物質(zhì)組成對(duì)比（/%）Tab.1 Comparison of muscle volatile composition in carp and grass carp

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)醛類化合物閾值很低，其對(duì)魚肉的氣味有重要貢獻(xiàn)，它們大多來源于多不飽和脂肪酸的氧化。飽和直鏈醛通常會(huì)產(chǎn)生一些刺激性氣味，其中己醛是n-6 不飽和脂肪酸氧化的產(chǎn)物，具有青草味、腥味[9]，壬醛是n-9 不飽和脂肪酸氧化的產(chǎn)物，也具有魚腥味[10]，目前這類物質(zhì)已被證明普遍存在于淡水魚中[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鯉己醛的含量為38.49%，遠(yuǎn)高于草魚的24.06%，鯉醛類物質(zhì)總含量也顯著高于草魚，這表明鯉魚肉腥味比草魚肉更重。

有研究指出，脂肪氧化分解或羰基化合物還原會(huì)產(chǎn)生飽和醇類，飽和醇類閾值較高，如己醇、庚醇等，對(duì)魚肉風(fēng)味影響較小[12]。不飽和醇類閾值較低，對(duì)魚肉氣味貢獻(xiàn)較大[13]，其中1-辛烯-3-醇廣泛存在于淡水魚中，它被證實(shí)是ARA 氧化降解的產(chǎn)物，具有類似蘑菇的香味[14]，其閾值僅為1.5ng/g。本實(shí)驗(yàn)中鯉組1-辛烯-3-醇的含量為17.44%，低于草魚組的19.77%，說明草魚的氣味較鯉更好一些。

魚肉中的烴一般來源于烷氧自由基脂肪酸氧化或者類胡蘿卜素分解而成，其閾值較高，對(duì)魚肉風(fēng)味影響較小[15]，但他們?cè)谝欢ǔ潭壬弦矔?huì)提高魚肉的香味，本實(shí)驗(yàn)中草魚組的烷烴含量高于鯉組，也表明了，草魚的氣味較鯉好一些。

酸類物質(zhì)是醛類、醇類、酯類的前體物質(zhì)，一般是由脂肪酸甘油三酯降解而成，其閾值較高，對(duì)水產(chǎn)品風(fēng)味影響不大[16]。酯類物質(zhì)如鄰苯二甲酸二異丁酯等是由酸和醇之間的酯化反應(yīng)生成，也與微生物發(fā)酵和脂肪酸代謝相關(guān)。酮類是醛類的同分異構(gòu)體，可能來源于脂肪酸氧化或氨基酸降解，可能對(duì)魚腥味由一定的增強(qiáng)作用，由于閾值較高，所以對(duì)氣味特征貢獻(xiàn)較低[17]。

結(jié)論

采用SPME-GC-MS 技術(shù)優(yōu)化了鯉魚肉中的揮發(fā)性成分檢測條件，得到的最佳萃取條件為：在3.00 g 魚肉中加入3 mL 飽和NaCL 溶液（0.36 g/mL），使用50/30 μm 的PDMS/DVB/CAR 萃取纖維在60℃下攪拌萃取40 min，之后將萃取纖維插入GC 進(jìn)樣口解析5 min。在該條件下對(duì)鯉和草魚肉揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了萃取并比較分析，各得到35 種主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：鯉肌肉揮發(fā)性成分中的醛類物質(zhì)含量高于草魚，尤其是產(chǎn)生腥味的主要物質(zhì)-己醛的含量遠(yuǎn)高于草魚，醇類中的主要香味物質(zhì)1-辛烯-3 醇的含量低于草魚，烷烴的含量也低于草魚，說明鯉的腥味較草魚更重一些。