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      “魚-植物”共生模式下不同植物根際細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)研究

      2023-02-26 06:02:22胡建勇李曉東翟旭亮時春明焦飛高攀
      水產(chǎn)學雜志 2023年1期
      關(guān)鍵詞:利用效率共生群落

      胡建勇,李曉東,翟旭亮,時春明,焦飛,高攀

      (1.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站,新疆 烏魯木齊 830000;2.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,重慶 400020)

      “魚-植物”共生模式是通過植物吸收利用養(yǎng)殖水體中氮、磷的一種綜合種養(yǎng)模式,因此,提高氮磷的利用效率對該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有現(xiàn)實意義[1]。研究表明,植物對氮磷吸收與利用效率受種類等多方面因素的影響。水稻(Oryza sativa)對氮素的利用效率隨施氮量的增加而下降[2];與鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)和水芹菜(Oenanthe javanica)相比,水蕹菜(Ipomoea aquatica)對富營養(yǎng)化水質(zhì)凈化效果表現(xiàn)更加優(yōu)秀[3];進一步研究發(fā)現(xiàn),植物根系微生物中有益菌群能夠提升植物營養(yǎng)元素的吸收與利用效率,促進植物生長發(fā)育,周冬梅等[4],柏文戀等[5]認為,根系微生物能夠促進土壤中難溶態(tài)無機磷溶解和有機磷的礦化,促進磷的利用。而在“魚-植物”共生模式應(yīng)用的實踐中,提高水體中氮磷利用效率的主要方法為多種植物組合模式,彭剛[6]利用“挺水植物荷花(Nelumbo)、蘆葦(Phragmites australis)等+沉水植物植物苦草(Vallisneria natans)、伊樂藻(Elodea nuttallii)等+浮水植物水葫蘆(Eichhornia crassipes)、浮萍(Lemna minor)等”的聯(lián)合凈化模式去除了水體中50%~70%的氮磷?;谏鲜鲅芯窟M展,為解決新疆地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的尾水生態(tài)治理的技術(shù)瓶頸,作者開展了以魚菜共生為代表的“魚-植物”綜合種養(yǎng)模式的應(yīng)用,取得了良好的效果。但提高共生植物對不同類型尾水氮、磷利用效率,需要強化不同植物的協(xié)同作用,重視其根際微生物的作用。為此,本文利用高通量測序技術(shù)分析了水稻、茨菰、水蕹菜、水芹菜、蘇丹草等植物根系細菌群落結(jié)構(gòu),同時采集植物種植區(qū)水樣進行水質(zhì)分析,研究“魚-植物”共生模式下不同植物根系細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)與水體中氮、磷含量的關(guān)系,以期為進一步豐富“魚-植物”共生理論,為加快該技術(shù)的推廣應(yīng)用提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      以水稻(Oryza sativa)、茨菰(Sagittaria sagittifolia)、水蕹菜(Ipomoea aquatica)、水芹菜(Oenanthe javanica)和蘇丹草(Sorghum sudanense)為研究對象;其中水稻品種為秋田小町,經(jīng)育苗,大田生長;茨菰購自烏魯木齊米東區(qū)種植戶;水蕹菜購自烏魯木齊新市區(qū)種植戶;蘇丹草采用種子直播法;水芹菜購自湖北省黃岡市。上述植物于5 月25 日定植于花盆,每種植物定植16 盆,隨后置于植物浮床,種植于新疆水生野生動物救護中心循環(huán)水養(yǎng)殖池塘,其養(yǎng)殖模式為浮式平臺養(yǎng)殖模式:構(gòu)建養(yǎng)殖單元和生態(tài)凈化單元,養(yǎng)殖單元為8 個直徑3 m、高1.2 m 的圓形漂浮養(yǎng)殖池,配置水循環(huán)和集排污、增氧系統(tǒng),分別放養(yǎng)易捕鯉(211.35±14.19)g/ 尾、松浦鏡鯉(212.36±15.65)g/ 尾,放養(yǎng)密度均為10 kg/m3水體;生態(tài)凈化單元放養(yǎng)500 g 以上的鰱100 尾/667m2、鳙50 尾/667m2,并利用本試驗所用植物凈化水質(zhì)。8 月25 日剪取一定長度的植物根系經(jīng)PBS緩沖液(pH7.4)漂洗后,置于20 mL PBS 緩沖液(pH=7.4)中,搖床震蕩30 min 后經(jīng)4℃12 000 r/min離心5 min 富集根系土壤備用;同時采集植物種植區(qū)水樣,部分經(jīng)4℃12 000 r/min 離心5 min 富集備用,其他用作水質(zhì)分析。

      1.2 方法

      1.2.1 DNA 提取

      根系及水樣微生物DNA 提取使用OMEGA 公司E.Z.N.ATM Mag-Bi-nd Soil DNA 試劑盒并經(jīng)凝膠檢測后備用。

      1.2.2 PCR 擴增及高通量測序

      根系及水樣微生物DNA 使用Life 公司Qubit2.0 DNA 試劑盒精確定量后,用上海生工的細菌16S rDNA 通用引物進行第一輪擴增。引物序列如下:341F:CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG;805R:GACTGGAG TTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(barcode)GACTA CHVGGGTATCTAATCC。上述PCR 產(chǎn)物引入Illumina 橋式PCR 兼容引物進行第二輪擴增后,用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)富集后經(jīng)Life 公司Qubit2.0 DNA 試劑盒精確定量后委托上海生工使用Illumina MiseqTM平臺測序。

      1.2.3 水質(zhì)測定

      水樣的采集、貯存、運輸和處理具體參照GB/T12999-91,氨氮(NH4+-N)含量采用納氏試劑比色法(GB7479-87)測定;亞硝酸鹽氮(NO2--N)含量采用萘乙二胺分光光度法(GB7493-87)測定;硝酸鹽氮(NO3--N)含量采用酚二磺酸分光光度法(GB7480-87)測定;總氮(TN)含量采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(GB11894-89)測定;總磷(TP)含量采用鉬酸銨分光光度法(GB11893-89)測定。

      1.2.4 數(shù)據(jù)分析

      測序結(jié)果經(jīng)去除接頭、引物序列后拼接、過濾、去除嵌合體,最終得到可用于劃分操作分類單元(Opera-tional taxonomic units,OTU)的序列數(shù)。水質(zhì)試驗結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示,采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行關(guān)聯(lián)性分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 不同植物根系細菌群落多樣性

      水稻(OS-1)、茨菰(ST-1)、水蕹菜(IA-1)、水芹菜(OJ-1)、蘇丹草(SS-1)和水樣(W-1)共得到有效OTU 數(shù)見表1。

      由表1 可知,在“魚-植物”共生模式下,不同植物根系細菌群落測序所得序列數(shù)差異極大,最高的茨菰是最低的水芹菜的1.7 倍。為了更好地反應(yīng)研究的真實情況,本試驗構(gòu)建了各樣品OTU 的韋恩圖(圖1)和樹狀結(jié)構(gòu)(圖2)。

      圖1 不同樣品OTU 數(shù)花瓣圖Fig.1 Petal graph based on OTUs of different sample

      表1 測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果Tab.1 The results of sequencing data

      圖2 不同樣品OTU 數(shù)聚類樹圖Fig.2 Bray-crutis tree of different samples OTUs

      由圖1 可知,不同植物在“魚-植物”共生模式下根系細菌OTU 絕大部分為特有類型,彼此間差異極大,除水樣外,水蕹菜最高,蘇丹草最低。由圖2可知,除水樣外,茨菰和水稻聚于一個分支,說明它們的OTU 相似性較高,這可能與它們同屬單子葉植物有關(guān);而蘇丹草與其他四種植物差異最大,這可能與其原本為陸生植物有密切關(guān)系?;诟咄康臏y序技術(shù)是研究根系微生物群落結(jié)構(gòu)的主要手段,但對于該技術(shù)而言,保證測序結(jié)果的準確性即需要準確反映被測樣本微生物群落的豐度和多樣性。為此,本課題組構(gòu)建了稀釋曲線(圖3)和Rank-abundance 曲線(圖4)。

      由圖3 可知,隨著擴增數(shù)的增加稀釋曲線逐漸平緩,表明隨著擴增數(shù)的增加產(chǎn)生新的OTU 的概率低,說明本研究的測序數(shù)據(jù)合理。而圖4 中各條曲線凸凹不平,說明在“魚-植物”共生模式下,各植物根系細菌群落組成均勻度低,不同種類菌群差異較大。本研究通過基于RDP classifier 分類方法,在科(family,圖5)、屬(genus,圖6)水平上對以上5 種植物根系細菌菌群進行了分類分析,同樣證實了不同植物在同一種植模式下根系細菌群落結(jié)構(gòu)據(jù)巨大差異。

      圖3 稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curve of samples

      圖4 Rank-abundance 曲線Fig.4 Rank-abundance curve of samples

      圖5 科水平上不同處理樣品物種豐度Fig.5 Abundance of species with different treatments on family level

      圖6 屬水平上不同處理樣品物種豐度Fig.6 Abundance of species with different treatments on genus level

      2.2 根系細菌群落結(jié)構(gòu)與池塘水質(zhì)關(guān)聯(lián)性分析

      在池塘“魚-植物”共生模式下,水體是植物所需氮、磷及其他營養(yǎng)元素的唯一來源;水體中的氮、磷濃度能夠影響植物的生長發(fā)育;而根系中的有益微生物菌群又有利于植物對各類營養(yǎng)元素的吸收。鑒于此,本研究對水質(zhì)分析結(jié)果(表2)同上述五種植物根系細菌種群含量均高于0.1%的優(yōu)勢菌群在科屬水平進行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以下各科(包括Planctomycetaceae、Enterobacteriaceae、Aeromonadaceae、Flavobacteriaceae、Sphingomonadaceae、Comamonadaceae、Acidimicrobiaceae、Rhodocyclaceae、Chitinophagaceae、Burkholderiaceae、Ectothiorhodospir aceae、Caldilineaceae、Desulfobacteraceae 和 Parachlamydiaceae)、各屬(包括Rhodobacter、Ilumatobacter、Novosphingobium、Dechloromonas、Aquisphaera、Enterobacter、Pirellula、Ralstonia、Hydrogenophaga、Litorilinea、Arenimonas、Phreatobacter、Bosea 以及Planctomicrobium)與水體中的N、P 含量呈顯著(P<0.05)或極顯著相關(guān)性(P<0.01)(表3)。

      表2 “魚-植物”共生模式的水質(zhì)測定結(jié)果Tab.2 The results of water quality in the“fish-plant”symbiosis system

      表3 水質(zhì)與植物根系細優(yōu)勢菌群在科、屬水平上的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of water quality and plant shizosphere microflora at family and genus levels

      3 討論

      3.1 根系細菌與植物種類、生長環(huán)境的關(guān)系

      植物根系對營養(yǎng)元素的吸收、利用與生長環(huán)境密切相關(guān);同時,根系菌群在參與相關(guān)生理活動中起著重要作用。因此,研究植物生長環(huán)境與根系微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系將對提高植物對營養(yǎng)元素利用效率、增強抗逆性具有重要意義。例如,在鹽堿環(huán)境中堿蓬(Suaeda glauca)根系中Echinicola 屬、蘆葦中Bacillus 屬和Filobacillus 屬菌群具有較高豐度[7];而在人工濕地中,相比梭魚草(Pontederia cordata)和再力花(Thalia dealbata Fraser),美人蕉(Canna indica L.)根系具有較高的菌群多樣性[8]。這說明同一生長環(huán)境下,植物根系微生物菌群結(jié)構(gòu)與植物的種類密切相關(guān),在荒漠環(huán)境下,半日花(Helianthemum songaricum)中優(yōu)勢屬為Sphingomonas、Gemmatimonas、Aciditerrimonas、Pseudomonas、Adhaeribacte而四合木(Tetraena mongolica)中的Sphingomonas、Gemmatimonas、Aciditerrimonas、Steroidobacter、Streptophyta 為優(yōu)勢屬[9];現(xiàn)有證據(jù)表明,植物根系分泌物類別和數(shù)量能夠影響植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)[1,10]。本研究中5 種植物在“魚-植物”共生模式下根系細菌OTU 結(jié)果看,絕大部分為特有類型,彼此間差異極大,進一步證實了上述結(jié)論。

      3.2 根系細菌促進氮磷利用

      植物對不同化合態(tài)的N、P 的吸收利用效率差異極大,對氮的利用主要為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮,對磷的利用主要是處于溶解態(tài)的有機或無機磷[11,12]。在“魚-植物”共生模式下,水體中的P 濃度含量較低,植物根系微生物通過生理生化途徑提供可溶態(tài)磷以滿足植物生長發(fā)育所需?,F(xiàn)有證據(jù)表明,巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Ewingella)等根系細菌能夠參與相關(guān)生理活動,而且在根系中的真菌,尤其是叢枝菌根真菌在提升磷的利用效率中作用更為顯著[13,14];不同植物對P 的利用效率有較大差異,相比燈心草(Juncus effusus L.)和蝴蝶花(Iris japonica Thunb.),石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)吸收同化磷素的效率更高[15]。這種差異可能與根系中與磷利用相關(guān)菌群數(shù)量有關(guān),并已在水芹菜的研究中獲得了證實[16]。與P 利用相比,植物對N 的利用表現(xiàn)出更為復(fù)雜的生理生化特性;就參與N 利用的根系微生物而言,涉及氨氧化細菌、亞硝酸鹽氧化細菌和其他消化細菌、反硝化細菌、根瘤菌乃至部分真菌,但細菌在植物對N 的吸收利用中起著主要作用[1,16]。同樣,不同植物中與N 利用相關(guān)的菌群存在著巨大差異,例如,蘆葦根際比香蒲更適合亞硝酸細菌的生長[17]。在逆境條件下,植物根系細菌群落有較高的固氮和解磷等促生能力[9],而在“魚-植物”這一種養(yǎng)模式下,水稻根系中存在與氮代謝如固氮、硝化、反硝化及除磷、降解纖維素、降解各類有機物、吸收金屬離子、產(chǎn)生絮凝劑等作用的細菌[18],這與本研究所得到的結(jié)果一致,并且這些菌群在促進植物營養(yǎng)元素吸收中具有潛在的利用價值,相關(guān)研究已在種植業(yè)中開展了廣泛研究并在土塘改良[19]、肥力提升[20]中取得了良好效果。

      3.3 結(jié)論

      “魚-植物”共生模式下,不同種類植物根系細菌群落結(jié)構(gòu)差異極大,這種差異與植物對營養(yǎng)元素的吸收及利用密切相關(guān),且不同植物對各類營養(yǎng)元素的吸收及利用也存在巨大差異。鑒于此,為了提高共生植物對水產(chǎn)養(yǎng)殖中水或尾水的凈化效率,建議在選擇該技術(shù)時應(yīng)采用多種植物搭配模式。

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