基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)和PLS-DA分析的五個基原綠絨蒿化學(xué)成分差異研究

李玉凰，王云紅，張成江，郭延壘，秦偉瀚，劉 翔*，陽 勇*

1重慶市中藥研究院，重慶400065；2遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遵義563000

藏藥是我國四大民族藥之首，其特殊的地理環(huán)境造就了藏藥材獨特的治療效果[1]。綠絨蒿作為常用的藏藥，在《新修晶珠本草》《民族藥辭典》《藏藥部頒》《國家藏藥標(biāo)準(zhǔn)全書》《藏藥志》等藏藥典籍中均有記載。綠絨蒿屬(MeconopsisVig.)是Viguier于1814年根據(jù)康布里罌粟Papavercambricum建立的，是極具特色的高山藏藥，本屬分2個亞屬、5個組和9個系，間斷分布于東亞和西歐，為一年生或多年生草本，株高10～180 cm不等，種類不同，花型花色各不相同，綠絨蒿中的不少種類莖葉上長滿了柔長的絨毛，因此得名[2-4]。因南北學(xué)用藥不一，各地綠絨蒿屬植物在使用上和名稱上有所異同，導(dǎo)致藥物混淆，品種混亂、基原復(fù)雜，故綠絨蒿屬藥用植物的研究和應(yīng)用面臨挑戰(zhàn)[5,6]。

超高液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q-TOF-MS)具有高分辨率、高靈敏度和高效分離能力，可在缺少對照品的情況下對復(fù)雜中藥成分進(jìn)行初步定性分析，已被廣泛用于天然藥物分析[7,8]。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS對總狀綠絨蒿MeconopsisracemoseMaxim.、多刺綠絨蒿MeconopsishorridulaHook.f.&Thoms、五脈綠絨蒿MeconopsisquintuplinerviaRegel、全緣葉綠絨蒿Meconopsisintegrifolia(Maxim).French.和紅花綠絨蒿MeconopsispuniceaMaxim.5個基原共49個批次綠絨蒿藥材的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，結(jié)合主成分分析(principal component analysis，PCA)及偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination-analysis，PLS-DA)數(shù)學(xué)模型探討不同基原綠絨蒿成分差異，為綠絨蒿品種分類、物質(zhì)基礎(chǔ)和合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

TripleTOF 4600型四極桿串聯(lián)飛行時間高分辨質(zhì)譜儀(美國，ABSCIEX公司)：Peak View 1.2數(shù)據(jù)處理軟件；SIMCA-P 14.1(瑞典，Umetrics公司)。

1.2 試藥

甲醇(分析純，批號：202010101，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司)；乙腈(色譜純，批號：1100130025，Merck)；甲酸(色譜純，批號：202674，F(xiàn)isher)；水(色譜純，批號：197545，F(xiàn)isher)。

1.3 藥材

本實驗用綠絨蒿全草藥材經(jīng)重慶市中藥研究院生藥所劉翔副研究員采集鑒定，采集信息表見表1。

表1 綠絨蒿樣品信息Table 1 Sample information of Meconopsis

續(xù)表1(Continued Tab.1)

1.4 供試品溶液制備

取樣品粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理，(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液即得。

1.5 分析方法

1.5.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC CSH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為甲酸水溶液(0.1%)，流動相B為乙腈，梯度洗脫(0～3.0 min，30% B；3.0～11.0 min，30%→90% B；11.0～12.8 min，90% B；12.8～13.0 min，90%→10% B；13～15.0 min，10% B)；柱溫30 ℃；流速0.25 mL/min；進(jìn)樣量3 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，分別在正、負(fù)離子模式下掃描，掃描范圍m/z：100～1 000；離子源溫度(TEMP)：600℃；正、負(fù)離子模式下噴霧電壓(IS)分別為+5.5、-4.5 kV；碰撞能量(CE)：10 eV；碰撞能量疊加(CES)：25±15 eV；去簇電壓(DP)：100 V；氣簾氣壓力(CUR)：25 psi；霧化氣壓力(GS1)：55 psi；輔助氣壓力(GS2)：55 psi；采集時間15 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

通過中國知網(wǎng)(CNKI)、SciFinder、PubChem、ChemSpider 等平臺或數(shù)據(jù)庫查詢綠絨蒿屬藥材中所含的化學(xué)成分，建立綠絨蒿成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，包含化合物名稱、分子式、結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜信息等。將供試品溶液按“1.5.1”和“1.5.2”項下條件檢測，結(jié)合前期建立的綠絨蒿成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Peak View 1.2軟件中的 XIC Manager功能進(jìn)行化合物初步的篩選，得化合物的分子離子峰、二級碎片離子信息及保留時間等信息，根據(jù)文獻(xiàn)資料、化合物Mol式匹配結(jié)果、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫結(jié)合軟件的Formula Finder、Mass Calculators、Fragment Matching 等功能以及二級碎片裂解規(guī)律進(jìn)行定性分析，進(jìn)行化合物的鑒定。

1.7 PCA、PLS-DA數(shù)據(jù)處理方法

將49批綠絨蒿供試品溶液的數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入 PeakView 1.2 軟件，將滿足誤差小于5 ppm，同位素分布正確且含有二級碎片的化合物確認(rèn)為目標(biāo)物質(zhì)，結(jié)合PeakView 1.2軟件Formula Finder等功能、數(shù)據(jù)庫及二級碎片裂解規(guī)律，對綠絨蒿所含成分進(jìn)行定性分析，并按化合物類別建立已知成分篩查表。將5個基原綠絨蒿的MS數(shù)據(jù)用notepad++軟件打開編輯后，轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)，在正離子模式下得到1 811組化合物相關(guān)數(shù)據(jù)，負(fù)離子模式下得到1819組化合物相關(guān)數(shù)據(jù)。將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件中，運用模式識別技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化處理，構(gòu)建PCA及PLS-DA數(shù)學(xué)模型。從整體到部分，全面分析5個基原綠絨蒿的化學(xué)成分差異、分組趨勢和相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個基原綠絨蒿中化學(xué)成分的質(zhì)譜解析

通過檢測，得總離子流圖(TIC)，并以5個基原綠絨蒿各1個代表性樣品的TIC圖作代表性數(shù)據(jù)(見圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多刺綠絨蒿、總狀綠絨蒿、五脈綠絨蒿、全緣葉綠絨蒿、紅花綠絨蒿的色譜圖具有一定差異性。通過對5個基原綠絨蒿在正、負(fù)離子模式下碎片離子進(jìn)行對比，在正離子模式下鑒定得到了65個化合物，在負(fù)離子模式下鑒定得到了65個化合物，共鑒定出75個化合物(見表2)，其中包括生物堿類化合物16個，黃酮類化合物26個，揮發(fā)油類化合物24個，其他化合物9個。其中二氫血根堿、去甲血根堿、原阿片堿、馬齒莧酰胺、芹菜素、木犀草素、槲皮素、白屈菜堿、苜蓿素等43個化學(xué)成分為5個基原綠絨蒿中的共有成分；桂皮酰胺、阿撲嗎啡、原荷包牡丹堿、威爾士綠絨蒿定堿、脈奎寧、槲皮素-3-O-[2-O-乙?；?α-L-阿拉伯糖(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-[2-O-乙酰基-α-L-阿拉伯糖( 1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷、2-胺基-苯甲酸甲酯、二十一酸甲酯、豆甾-3,5,22-三烯、二氫刺苞菊醛、5,15-O-diacetyl-3-O-phenyl-6 ( 17 ) epoxylathyrol等在5個基原綠絨蒿中存在明顯差異，各批次綠絨蒿化學(xué)成分差異(見表3)。

圖1 不同基原綠絨蒿樣本UPLC-Q-TOF-MS正離子和負(fù)離子模式總離子流圖Fig.1 UPLC-Q-TOF-MS total ion chromatograms for different origins of Meconopsis under positive ion and negative ion注：A：多刺綠絨蒿；B：總狀綠絨蒿；C：五脈綠絨蒿；D：全緣葉綠絨蒿；E：紅花綠絨蒿。Note:A:M.horridula;B:M.racemose;C:M.quintuplinervia;D:M.integrifolia;E:M.punicea.

表2 5個基原綠絨蒿樣品中化學(xué)成分分析Table 2 Analysis of chemical constituents in five origins of Meconopsis

續(xù)表2(Continued Tab.2)

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續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

表3 49個批次綠絨蒿的化學(xué)成分對照Table 3 Chemical composition control of 49 batches of Meconopsis

續(xù)表3(Continued Tab.3)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

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2.2 主成分分析(PCA)

基于對上述5個基原綠絨蒿TIC圖的觀察和化學(xué)成分比較，為進(jìn)一步明確5個基原綠絨蒿的差異，以PCA建立不同基原綠絨蒿的分散點圖進(jìn)行整體趨勢分析觀察。將5個基原綠絨蒿的MS數(shù)據(jù)用notepad++軟件打開編輯后，轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)，將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件中進(jìn)行無監(jiān)督的PCA處理(見圖2)，結(jié)果表明5個基原綠絨蒿不能各自明顯分離，正離子模式下多刺綠絨蒿和總狀綠絨蒿較好地聚集在一起，五脈綠絨蒿、全緣葉綠絨蒿和紅花綠絨蒿能較好地聚集在一起；負(fù)離子模式下5個基原綠絨蒿各批次較為分散，提示不同基原綠絨蒿的化學(xué)成分存在一定的差異性。

圖2 不同離子模式下5個基原綠絨蒿的PCA得分Fig.2 PCA scores of five origins of Meconopsis under different ion modes

2.3 偏最小二乘法-辨別分析(PLS-DA)

基于上述TIC和PCA結(jié)果，為充分了解5個基原綠絨蒿間的差異信息，將處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行PLS-DA模式識別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正、負(fù)離子模式下多刺綠絨蒿和總狀綠絨蒿均能較好地聚集在一起；五脈綠絨蒿、全緣葉綠絨蒿和紅花綠絨蒿較為分散，但仍存在一定交集，見圖3。由此可得，5個基原綠絨蒿存在差異性化學(xué)成分，可將多刺綠絨蒿和總狀綠絨蒿分為一類，與其余3個基原綠絨蒿明顯區(qū)分開。

圖3 不同離子模式下5個基原綠絨蒿的PLS-DA得分Fig.3 PLS-DA scores of five origins of Meconopsis in different ion modes

3 討論與結(jié)論

《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥)》1995年版中，分別收載了多刺綠絨蒿和綠絨蒿兩個品種，多刺綠絨蒿的來源僅1種，綠絨蒿的來源有3種：全緣綠絨蒿、五脈綠絨蒿、長葉綠絨蒿，但市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在藏區(qū)實際應(yīng)用中長葉綠絨蒿品種較少，資源較為匱乏。據(jù)報道，綠絨蒿屬植物因生長環(huán)境惡劣和人類過度開采等原因，導(dǎo)致綠絨蒿資源有限，部分綠絨蒿已處于瀕危狀態(tài)，作為我國瀕危保護(hù)植物[9,10]。因而對藏藥綠絨蒿進(jìn)行深入研究，對品種進(jìn)行整理分類，為綠絨蒿的合理開發(fā)與應(yīng)用具有重要的作用。

藥物的不同臨床作用很大程度上是由于化學(xué)成分的不同導(dǎo)致的。根據(jù)文獻(xiàn)報道[11-16]，綠絨蒿屬植物中含有生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類、甾體類、萜類等化學(xué)成分，其中生物堿和黃酮為其主要活性成分[17]，是近年來研究的重點。有專家提出在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥)》刺爾恩的來源中增加總狀綠絨蒿這一基原，但尚未有研究報道支持此建議。本研究首次通過質(zhì)譜手段對5個基原綠絨蒿的化學(xué)成分進(jìn)行研究，基于本研究中鑒別出的75種化學(xué)成分，多刺綠絨蒿與總狀綠絨蒿有59種共有化學(xué)成分，表明多刺綠絨蒿與總狀綠絨蒿的化學(xué)成分種類上基本一致，與其他3個基原的綠絨蒿化學(xué)成分種類存在一定差異，此研究結(jié)果可為多刺綠絨蒿中增加總狀綠絨蒿這一基原提供科學(xué)依據(jù)。

在物質(zhì)基礎(chǔ)方面，5個基原綠絨蒿的化學(xué)成分差異可能會對該藥材的藥效產(chǎn)生較大影響，建議將多刺綠絨蒿和總狀綠絨蒿歸為一類，多刺綠絨蒿的來源中增加總狀綠絨蒿；五脈綠絨蒿、全緣綠絨蒿、紅花綠絨蒿各分為一類；在實際應(yīng)用中不可將五脈綠絨蒿、全緣綠絨蒿、紅花綠絨蒿與多刺綠絨蒿混用，注意區(qū)分。目前，綠絨蒿種類復(fù)雜，基原混亂，其具有極大的種類差異，在品種分類和研究應(yīng)用方面需要給予更多的關(guān)注。本研究從物質(zhì)基礎(chǔ)角度分析了5個基原綠絨蒿的差異性，差異性成分可考慮作為不同基原綠絨蒿的品種鑒別的參考依據(jù)，后續(xù)將對5個基原綠絨蒿之間的差異性成分進(jìn)行詳細(xì)分析，也將從藥理和臨床應(yīng)用方面對這5個基原綠絨蒿的差異作進(jìn)一步研究。