紅花葉總黃酮提取純化工藝優(yōu)化及抗急性肝損傷活性研究

馬夢(mèng)鴿，宋忠興，陳 琳*，唐志書,,3*，孔 鑫，段金廒

1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，咸陽(yáng) 712083；3中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700；4南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023

菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花是中國(guó)傳統(tǒng)的珍貴藥材，也是蒙醫(yī)臨床應(yīng)用最廣泛的藥材之一。本藥性涼，味微苦，歸心、肝經(jīng)，是活血通經(jīng)，去瘀止痛之良藥[1-3]。一直以來(lái)，對(duì)植物紅花的使用和研究只集中于其藥花，但是植物紅花的花產(chǎn)量很低，這就使得其藥用部位—“花”采收后產(chǎn)生的大量的葉子被棄掉，從而出現(xiàn)資源浪費(fèi)的現(xiàn)象。有學(xué)者對(duì)紅花地上部分的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，但大多集中在生物堿和萜類[3-5]。但對(duì)其黃酮類化合物的研究較少，黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、保肝、抗癌、抗炎等藥理活性[6,7]，并且植物源黃酮類化合物具天然低毒的特點(diǎn)，在開(kāi)發(fā)高效安全的天然藥物、護(hù)膚品、保健品等方面具有廣闊前景。目前尚未見(jiàn)對(duì)紅花葉黃酮類提取純化工藝和生物活性的研究。相關(guān)研究表明，紅花莖醇提取物具有明顯的抗CCl4致急性肝損傷作用[3]，那么紅花葉提取物是否也具有肝保護(hù)作用值得探討。故本實(shí)驗(yàn)從充分利用紅花非藥用部位資源的角度出發(fā)，通過(guò)提取、純化工藝優(yōu)化得TFCTLL，并進(jìn)一步探究其保肝作用，為紅花非藥用部位資源的充分利用及其藥理活性研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用紅花葉采摘自新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州，由經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍高級(jí)工程師鑒定為紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥葉。水飛薊素(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S25549)；羧甲基纖維素鈉(天津天士力圣特制藥有限公司，批號(hào)：QHG3-2161-96)。蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：HR17513S1)。橄欖油(山東魯花集團(tuán))；四氯化碳(CCl4，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20210102)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT，批號(hào)：140120014)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST，批號(hào)：140220008)、總膽汁酸(total bile acid，TBA，批號(hào)：143222001)檢測(cè)試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；HPD-600、HPD-100、D-101、HP-20、AB-8型大孔吸附樹(shù)脂(西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司)；其他試劑(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明小鼠，50只，4周齡，體質(zhì)量(20±2)g。購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(SCXK(川) 2020-030)，飼養(yǎng)于陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)新中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(SYXK(陜) 2017-004)，每天光照和黑暗各12 h，適宜溫度設(shè)置在20 °C～24 °C范圍內(nèi)，室內(nèi)保持55%～65%的相對(duì)濕度。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先經(jīng)過(guò)1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SUCMDL20220612001)。

1.3 儀器

Acquity H-CLASS型超高效液相色譜(UPLC，美國(guó)沃特世科技有限公司)串聯(lián)Triple TOFTM 5600+質(zhì)譜儀(美國(guó)愛(ài)博才思公司)；液相配置：二元超高壓溶劑系統(tǒng)、FTN自動(dòng)進(jìn)樣管理器、PDA檢測(cè)器和Empower3色譜工作站。全自動(dòng)血清生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司)；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

將紅花地上部分莖、葉分離，去雜質(zhì)，置于通風(fēng)陰涼處陰干后，備用。

1.4.2 總黃酮含量測(cè)定

1.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測(cè)定總黃酮含量。用65%乙醇溶解蘆丁對(duì)照品后制得0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。精確吸取不同體積對(duì)照品溶液(0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL)于25 mL量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min，加4%NaOH溶液10.0 mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻靜置15 min，于510 nm處測(cè)定吸光度值。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程為：Y=12.706X-0.002 6(r=0.999 4)，表明蘆丁在0.008～0.056 mg/mL濃度下吸光度線性關(guān)系良好。

1.4.2.2 樣品溶液中總黃酮含量的測(cè)定

將紅花葉粉碎后過(guò)50目篩，真空干燥至恒重，得到樣品粉末。精密稱取粉末10.0 g，加入適量溶劑進(jìn)行加熱回流提取，分別考察不同乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)TFCTLL提取率影響，根據(jù)“1.4.2.1”項(xiàng)下的線性方程計(jì)算總黃酮濃度并根據(jù)下列公式[8]計(jì)算總黃酮提取率。

總黃酮提取率=(C×V×D)/m×100%

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出的總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為取樣量，mg。

1.4.3 提取工藝單因素試驗(yàn)

分別考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)、提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)和提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)對(duì)總黃酮提取率的影響。每個(gè)因素平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.4 提取工藝響應(yīng)面水平選取與設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定提取次數(shù)2次的條件下，選取料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間作為Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3個(gè)因素，以TFCTLL提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合響應(yīng)面法的設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平的設(shè)計(jì)方案，共17組實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factor and level of response surface experiment

1.4.5 總黃酮的富集和純化

1.4.5.1 紅花葉提取液前處理

稱取適量干燥至恒重的紅花葉藥材，照響應(yīng)面法的最佳提取工藝提取，提取液減壓濃縮至無(wú)醇味。上柱之前采用抽濾法過(guò)濾大量雜質(zhì)、蛋白質(zhì)、黏液以及色素。

1.4.5.2 大孔樹(shù)脂的篩選和預(yù)處理

總黃酮化合物大都呈非極性至弱極性，而其所用的大孔吸附樹(shù)脂也大都在非極性至弱極性之間。故本試驗(yàn)選取AB-8型[9]、HPD-100型[10]、HPD-600樹(shù)脂[11]、D101型[12]和HP-20型[12]5種適合富集總黃酮的大孔吸附樹(shù)脂用于純化TFCTLL，使用4%的HCl浸泡24 h，蒸餾水洗滌至中性；4%的NaOH浸泡24 h，蒸餾水洗滌至中性；無(wú)水乙醇浸泡24 h，蒸餾水洗滌至無(wú)醇味，備用。將大孔樹(shù)脂用95%的乙醇浸泡24 h后進(jìn)行濕法裝柱，精密稱取一定量大孔樹(shù)脂對(duì)紅花葉提取液進(jìn)行吸附。

1.4.5.3 大孔樹(shù)脂型號(hào)的篩選

將已處理好的大孔樹(shù)脂HPD-600、HPD-100、D-101、HP-20、AB-8各稱取10 g，分別置于150 mL錐形瓶中，向每個(gè)錐形瓶中加入預(yù)處理后的紅花葉提取液40 mL，置于25 ℃恒溫水浴搖床上以110 r/min的速度震蕩2 h，靜置8 h，使各個(gè)型號(hào)大孔樹(shù)脂達(dá)到飽和吸附，并吸收上等紅花葉提取液對(duì)黃酮類物質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定。比較不同型號(hào)樹(shù)脂對(duì)TFCTLL的吸附率。將載樣樹(shù)脂移入150 mL錐形瓶中，加入40 mL的95%乙醇，置于25 ℃恒溫水浴搖床振搖2 h過(guò)濾，靜置8 h即得解吸液，比較不同型號(hào)樹(shù)脂對(duì)紅花葉總黃酮的解吸率，根據(jù)吸附率和解析率結(jié)果選出大孔吸附樹(shù)脂。吸附率和解析率的計(jì)算公式[13]如下：

吸附率=(C0V0-C1V1)/C0V0×100%

解吸率=(C2V2)/(C0V0-C1V1)×100%

式中，C0為吸附前樣品液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為吸附前樣液體積，mL；C1:吸附后殘液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附后殘液體積，mL；C2為解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為解吸液體積，mL。

1.4.5.4 純化工藝單因素考察

1.4.5.4.1 不同pH的紅花葉提取液

稱取10 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的樹(shù)脂，用去離子水對(duì)其進(jìn)行清洗，置于150 mL的三角瓶中，分別加入40 mLpH為2、4、7、10、12的紅花葉提取液震蕩吸附4 h。靜置12 h，檢測(cè)其中總黃酮含量，計(jì)算出吸附率，選出最佳pH值。

1.4.5.4.2 最大吸附量

準(zhǔn)確稱取已處理好的大孔樹(shù)脂100 g，采取濕法裝柱，取紅花葉提取液進(jìn)行上樣，分段收集流出液，每份40 mL，收集10份流出液，測(cè)定黃酮含量。流出液中黃酮濃度如果達(dá)到上樣液濃度的10%時(shí)，稱為泄漏點(diǎn)，當(dāng)流出液中黃酮濃度達(dá)到上樣液濃度的100%時(shí)，稱為飽和點(diǎn)，收集流出液，測(cè)定流出液中總黃酮的含量。

1.4.5.4.3 不同濃度洗脫溶劑

準(zhǔn)確量取10 g吸附總黃酮達(dá)到飽和狀態(tài)的樹(shù)脂，用去離子水對(duì)其進(jìn)行清洗，置于150 mL的三角瓶中，分別加入濃度為20%、40%、60%、80%、95%乙醇40 mL，震蕩洗脫2 h。靜置8 h，檢測(cè)其中總黃酮含量，計(jì)算出解吸率，由解吸率得出最適乙醇濃度。

1.4.6 UPLC-Q-TOF-MS/MS檢測(cè)TFCTLL化學(xué)成分

1.4.6.1 質(zhì)譜條件

離子源：ESI離子源；正、負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，源噴射電壓(IVF)分別為5 500、-4 500V，裂解電壓(DP)±80 V，碰撞能量(CE)±10 eV，GS1和輔助氣、GS2都為氮?dú)狻?44.74 kPa(50 psi)，氣簾氣(CUR)：241.32 kPa(35psi)，霧化溫度(TEM)500 ℃，采用信息依賴采集(IDA)、動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)和高靈敏度模式；母離子(TOF-MS)、子離子的掃描范圍都為m/z 100～2000。

1.4.6.2 液相色譜條件

采用ACQUITY UPLC?BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色譜柱，使用0.1%甲酸水溶液(A)溶液-乙腈(B)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度 洗脫條件：0～10 min，5%→12% B；10～30 min，12%→30% B；30～50 min，30%→50% B；50～52 min，50%→80% B；52～55 min，80%→80% B；55～57 min，80%→5% B；57～62 min；5%→5% B柱溫為30 ℃；流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

1.4.7 TFCTLL抗小鼠急性肝損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.7.1 受試藥物的制備

按最佳提取、純化工藝獲得的TFCTLL，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液分別配置成5、10 mg/mL，水飛薊素用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成10 mg/mL，4 ℃冰箱冷藏備用。

1.4.7.2 分組、造模及給藥

實(shí)驗(yàn)選取50只健康雄性昆明小鼠，將小鼠隨機(jī)分為空白組(control，C)、模型組(model，M)、水飛薊素組(陽(yáng)性對(duì)照組，silymarin，S)、TFCTLL低劑量組(T-L)和TFCTLL中劑量組(T-M)，每組各10只。T-L和T-M組分別給予TFCTLL提取物50、100 mg/kg，S組給予水飛薊素100 mg/kg，空白組和模型組灌胃給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每天一次，連續(xù)灌胃給藥14天。第14天末，除空白組腹腔注射等量的橄欖油溶液外，模型組和給藥組小鼠均腹腔注射含0.1%CCl4的橄欖油溶液10 mL/kg。小鼠末次給藥后間隔24 h，眼球取血后處死，分取肝臟及脾臟并稱取其重量，計(jì)算小鼠的肝臟指數(shù)及脾臟指數(shù)；收集血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清中ALT、AST和TBA含量。

1.4.7.3 動(dòng)物體重變化及相關(guān)臟器指數(shù)測(cè)定

每周監(jiān)測(cè)并記錄小鼠體重，試驗(yàn)結(jié)束后摘取各組小鼠肝臟、脾臟，生理鹽水清洗后用濾紙吸干，記錄肝臟和脾臟濕重并計(jì)算臟器指數(shù)。

1.4.7.4 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

通過(guò)全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組小鼠血清AST、ALT和TBA的含量。

1.4.7.5 肝組織病理學(xué)觀察

各組小鼠肝臟在4%多聚甲醛固定液中固定，肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋并切片(5 μm)，常規(guī)方式脫蠟，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，顯微鏡下觀察肝組織損傷的病理變化。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。單因素結(jié)果見(jiàn)圖1。綜合考慮時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，選擇提取次數(shù)為2次，料液比為1∶25，提取溶劑為80%乙醇，單次提取時(shí)間為60 min。

圖1 不同因素對(duì)TFCTLL提取率的影響Fig.1 Effect of different factors on the extraction rate of TFCTLL

2.2 提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定提取次數(shù)2次的條件下，選取料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間3個(gè)因素為變量，以紅花葉總黃酮提取率R為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。使用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下多元二次回歸方程R=4.89+0.144 9A+0.061B+0.058 8C+0.077 4AB+0.083 1AC+0.039 9BC-0.446 3A2-0.532 8B2-0.223 8C2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2，該模型顯著性檢驗(yàn)的P值為<0.000 1，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬項(xiàng)P>0.05。說(shuō)明回歸模型擬合較好，能較準(zhǔn)確反映3個(gè)因素對(duì)TFCTLL提取率的影響。方差來(lái)源中的A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2的P值表明3個(gè)因素對(duì)TFCTLL提取率有顯著影響，且料液比的影響極大。乙醇濃度和提取時(shí)間的影響作用較大。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和圖4，各因素兩兩交互作用的3D響應(yīng)面圖曲線坡度陡峭程度上得到了驗(yàn)證，料液比的曲面最為陡峭；另外乙醇濃度和提取時(shí)間、料液比和提取時(shí)間均有一定的交互作用，而料液比和乙醇濃度的等高線為橢圓形，3D響應(yīng)面幾乎無(wú)曲度，說(shuō)明二者幾乎無(wú)較大的交互作用。由此可知各因素對(duì)TFCTLL提取率的影響大小為料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間。

圖2 乙醇濃度和料液比對(duì)TFCTLL提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Effect of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction of TFCTLL by response surface methodology and contour map

圖3 乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)TFCTLL提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Effect of ethanol concentration and extraction time on the extraction of TFCTLL by response surface methodology and contour map

圖4 料液比和提取時(shí)間對(duì)TFCTLL提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Effect of Solid-liquid ratio and extraction time on the extraction of TFCTLL by response surface methodology and contour map

表2 方差分析結(jié)果Table 2 The results of variance analysis

根據(jù)響應(yīng)面分析得到最優(yōu)提取條件為：料液比1∶26.852，乙醇濃度80.776%，提取時(shí)間65.175 min，此條件下TFCTLL的提取率理論值可達(dá)4.907%?？紤]到實(shí)際可操作性，對(duì)最佳提取條件優(yōu)化為料液比1∶27，乙醇濃度80%，提取時(shí)間65 min，得到實(shí)際提取率為4.921%，與理論值差0.014%，說(shuō)明此模型預(yù)測(cè)較好且穩(wěn)定，可用于TFCTLL的提取。

2.3 總黃酮富集純化

2.3.1 不同大孔樹(shù)脂的吸附率和解析率

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，以總黃酮的吸附率及解吸率為考察指標(biāo)來(lái)篩選最佳樹(shù)脂類型，結(jié)果顯示AB-8大孔樹(shù)脂吸附率及解吸率較高,故本實(shí)驗(yàn)選用此做為吸附樹(shù)脂。

表3 吸附率及解析率結(jié)果Table 3 Adsorption rate and desorption rate results

2.3.2 不同pH紅花葉提取液的吸附率

結(jié)果見(jiàn)圖5A，pH為7時(shí)，大孔樹(shù)脂對(duì)紅花葉總黃酮的吸附率達(dá)到最大。在酸堿環(huán)境中，吸附率都較低，可能由于酸堿性的條件下紅花葉提取液中成分發(fā)生變化。酸堿性也可能導(dǎo)致大孔樹(shù)脂對(duì)TFCTLL的吸附性發(fā)生變化。從結(jié)果得出，在pH為7的條件下，大孔樹(shù)脂對(duì)TFCTLL的吸附率最好，所以選擇pH=7的紅花葉提取液進(jìn)行大孔樹(shù)脂的洗脫實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 最大吸附量

結(jié)果見(jiàn)圖5B，上樣提取液達(dá)到120 mL時(shí)，達(dá)到上樣濃度的10%，已經(jīng)到達(dá)理論上的泄漏點(diǎn)，這時(shí)已經(jīng)達(dá)到了大孔樹(shù)脂的飽和吸附量。對(duì)加入的紅花葉提取液已經(jīng)無(wú)法全部吸附，在上樣液達(dá)到160 mL時(shí)，已經(jīng)達(dá)到飽和點(diǎn)。超過(guò)160 mL之后紅花葉提取液就開(kāi)始泄露。

2.3.4 不同乙醇濃度的解吸率

結(jié)果見(jiàn)圖5C。從結(jié)果看出95%的乙醇濃度達(dá)到較高的解吸率，當(dāng)乙醇濃度從20%乙醇濃度到80%乙醇濃度時(shí)，對(duì)TFCTLL的解吸率持續(xù)上升。當(dāng)選擇95%乙醇濃度時(shí)解析率最高，對(duì)TFCTLL的解吸效果最好，故此條件下進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)。

圖5 TFCTLL純化工藝的考察結(jié)果Fig.5 Investigation results of TFCTLL purification process

2.3.5 純化富集最優(yōu)工藝

將提取最優(yōu)工藝下的提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，并調(diào)節(jié)pH值為7，吸附于預(yù)處理過(guò)的大孔樹(shù)脂色譜柱AB-8，用95%乙醇洗脫，收集95%洗脫液濃縮為干浸膏，采用“1.4.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行黃酮含量測(cè)定。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂富集純化后得到的TFCTLL純度達(dá)到61.42%。

2.4 成分鑒定

TFCTLL成分表征的負(fù)離子模式的總離子流圖見(jiàn)圖6，通過(guò)PeakView 2.2軟件對(duì)化合物進(jìn)行鑒定表征，經(jīng)文獻(xiàn)查閱及結(jié)構(gòu)解析[14-16]，共推斷出木犀草素、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、牡荊苷等4個(gè)成分見(jiàn)表4。

圖6 TFCTLL成分表征的負(fù)離子模式的總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram for the characterization of TFCTLL composition under negative ion mod

表4 TFCTLL成分表征結(jié)果Table 4 TFCTLL composition characterization results

2.5 TFCTLL抗小鼠急性肝損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.5.1 TFCTLL對(duì)急性肝損傷小鼠肝、脾臟器指數(shù)的影響

空白組小鼠毛色光滑，精神狀態(tài)較好。與空白組相比，模型組小鼠精神萎靡不振，食欲下降，體重明顯減輕，其余給藥組小鼠毛色、精神狀態(tài)和攝食等明顯優(yōu)于模型組。結(jié)果見(jiàn)圖7，與空白組相比，模型組小鼠的肝臟、脾臟臟器指數(shù)升高具有顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，水飛薊素藥組肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，T-L、T-M肝、脾臟器指數(shù)在不同程度上降低(P<0.05)。

圖7 TFCTLL對(duì)急性肝損傷小鼠肝、脾臟器指數(shù)的影響Fig.7 Effect of TFCTLL on the index of liver and spleen in mice with acute liver 注：與C組相比，#P<0.05；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with C group,#P<0.05;Compared with M group,*P<0.05, **P<0.01.

2.5.2 TFCTLL對(duì)急性肝損傷小鼠血清生化指標(biāo)的影響

小鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)圖8，與空白相比，模型組小鼠 ALT、AST、TBA水平顯著升高(P<0.001)。說(shuō)明模型組小鼠出現(xiàn)肝功能損傷。與模型組相比，水飛薊素和TFCTLL低、中劑量組小鼠的ALT、AST、TBA均顯著降低(P<0.05)，表明TFCTLL可以較好改善急性肝損傷小鼠的肝功能。

圖8 TFCTLL對(duì)急性肝損傷小鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.8 Effect of TFCTLL on serum biochemical indexes in mice with acute liver 注：與C組相比，###P<0.001；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note:Compared with C group, ###P<0.001;Compared with M group,*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001.

2.5.3 TFCTLL對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果見(jiàn)圖9，空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞無(wú)壞死、排列整齊，大小均勻，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，圓整、邊界清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，纖維結(jié)締組織增生，匯管區(qū)炎性細(xì)胞及壞死細(xì)胞增多，出現(xiàn)大量的脂肪變性及肝細(xì)胞壞死，明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；水飛薊素組和TFCTLL低、中劑量組小鼠肝細(xì)胞變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象較模型組顯著改善。

圖9 TFCTLL對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響Fig.9 Effect of TFCTLL on the pathological changes of liver tissue in mice with acute liver injury

3 討論與結(jié)論

本研究首次以紅花廢棄物紅花葉為試驗(yàn)材料，采用加熱回流法對(duì)紅花葉總黃酮進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化提取紅花葉總黃酮的最佳提取工藝，確定料液比1∶27，乙醇濃度80%，提取時(shí)間65 min，得到實(shí)際提取率為4.921%，與理論值差0.014%，并且對(duì)單因素和響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)二者并沒(méi)有顯著性差異P>0.05。說(shuō)明此模型預(yù)測(cè)較好且穩(wěn)定，可用紅花葉中總黃酮的提取。由于經(jīng)過(guò)最優(yōu)提取工藝得到的是含有紅花葉總黃酮的粗提物，且提取率較低，因此需要對(duì)粗提物進(jìn)一步地富集純化，以便后續(xù)的活性研究。

大孔樹(shù)脂近年來(lái)普遍運(yùn)用于天然產(chǎn)物的分離純化中，特別是黃酮類成分的富集，因其純化工藝具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)污染、能耗小且分離效果好等特點(diǎn)，在黃酮類化合物的純化研究中得到廣泛使用[9]。大多黃酮類化合物呈弱極性，故弱極性和非極性的樹(shù)脂對(duì)黃酮類化合物的純化效果較好。Hou等[17]研究大孔吸附樹(shù)脂富集純化玳玳花總黃酮，通過(guò)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)考察NKA-9、HPD100、HPD400、HPD600、AB-8、D101、X-5、DM301大孔吸附樹(shù)脂對(duì)總黃酮的吸附、解吸能力，結(jié)果表明AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附、解吸能力最佳。相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道了HPD-100型[10]、HPD-600型樹(shù)脂[11]、D101型[12]和HP-20型[12]4種大孔吸附樹(shù)脂，在富集黃酮類成分中吸附和解析能力較其他型號(hào)樹(shù)脂具有明顯的優(yōu)勢(shì)，故本試驗(yàn)選取AB-8型、HPD-100型、HPD-600型樹(shù)脂、D101型和HP-20型5種適合富集總黃酮的大孔吸附樹(shù)脂用于純化TFCTLL。得出最優(yōu)純化工藝后，將提取最優(yōu)工藝下的紅花葉提取液吸附于預(yù)處理過(guò)的大孔樹(shù)脂色譜柱AB-8，用95%乙醇洗脫，其總黃酮純度達(dá)到61.42%，收集洗脫液濃縮為干浸膏。為后續(xù)的活性研究提供基礎(chǔ)。

相關(guān)研究表明，紅花莖醇提取物具有明顯的抗CCl4致急性肝損傷作用[3]，紅花葉提取物是否也具有肝保護(hù)作用？本研究共鑒定了TFCTLL中木犀草素、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、牡荊苷等4個(gè)黃酮類化合物。相關(guān)研究結(jié)果證明[18-21]其具有特異性的抗炎、抗氧化和抗纖維化作用，可以降低血清ALT、AST活性、抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平、抑制抗氧化酶的活化和NF-κB通路激活，通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗炎、減少鐵沉積、調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡、促進(jìn)自噬等多種途徑減輕對(duì)肝臟的損傷，常被用于治療急性肝損傷等相關(guān)的疾病。

急性肝損傷[22-24]是一種在短期內(nèi)因各種原因而引起的肝功能突發(fā)異常疾病，其臨床預(yù)后較差，如果不加以積極干預(yù)和治療，可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化與肝癌，威脅人體生命健康。造成肝損傷的因素多種多樣，其中包括化學(xué)性肝損傷、細(xì)菌和病毒引起的生物性肝損傷。CCl4是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中誘導(dǎo)化學(xué)性肝損傷最常用的肝毒素[24]，一次給藥CCl4便可制備肝細(xì)胞損傷型的ALI?？稍斐筛渭?xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，導(dǎo)致胞內(nèi)ALT和AST溢出進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中ALT和AST活性升高，其升高水平與肝損傷程度呈正相關(guān)，因此ALT和AST活性常作為評(píng)價(jià)肝損傷程度的指標(biāo)。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射CCl4后，血清中ALT、AST和TBA活性顯著升高，并且發(fā)生肝組織病變，表明成功建立CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型。經(jīng)TFCTLL干預(yù)后，小鼠血清中ALT、AST和TBA活性顯著降低，肝組織病變程度減輕，表明TFCTLL對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用。

本研究從紅花藥材資源的角度出發(fā)，將中藥傳統(tǒng)非藥用部位等廢棄物及副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化研制成資源性藥物，對(duì)紅花藥材充分利用，并對(duì)其紅花葉進(jìn)行了保肝作用的探索性研究。結(jié)果表明提取純化后得到的TFCTLL對(duì)急性肝損傷小鼠具有作用。本研究可為TFCTLL的后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供參考，也對(duì)紅花資源的高值化利用具有重要意義。