基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外實驗探討附子-干姜抗心肌缺血再灌注損傷的作用機制

謝 鋒，段廣靖，李 敏，蘭 衛(wèi)*

1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830000；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽 712046

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是我國發(fā)病率、致殘率、死亡率最高的心臟疾病。隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展和人口老齡化，IHD出現(xiàn)年輕化且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1-2]。其中心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)是在缺血性心臟病治療期間不可避免的現(xiàn)象，MI/RI期間導(dǎo)致心肌組織梗死面積擴大，以及心律失常[3]。MI/RI是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟待解決的問題，但尚無特效藥。

MI/RI屬于中醫(yī)學(xué)胸痹的范疇。中醫(yī)藥講究整體觀念，在治療胸痹方面有著獨特的經(jīng)驗與優(yōu)勢。以往的研究表明中醫(yī)藥在治療胸痹有很好的療效比如：四逆湯、益氣活血湯、瓜蔞薤白湯[4-6]。附子-干姜(Aconiti Lateralis Radix Preparata-Zingiberis Rhizoma，AZ)是四逆湯的核心藥對，本課題組以往的拆方研究表明，四逆湯拆方后AZ組的療效最好，但其具體機制尚不清楚，此外課題組也證明了AZ配伍可降低MI/RI期間心肌細(xì)胞的凋亡率，但其具體機制尚未研究[7]。AZ因成分復(fù)雜，作用機制不清楚，嚴(yán)重阻礙了AZ臨床應(yīng)用以及新藥開發(fā)，對AZ抗MI/RI的機制研究刻不容緩。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是分析中藥復(fù)方的重要工具[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已廣泛用于分析中藥復(fù)方治療疾病的生物過程和信號通路。為研究AZ抗MI/RI的作用機制，本研究擬用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測AZ抗MI/RI的作用機制，并通過體外研究驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果，為AZ下一步開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測AZ抗MI/RI的靶點、生物過程、信號通路

通過TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫篩選附子、干姜的活性成分、靶點。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件。將獲得的靶點導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)規(guī)范靶點名稱，利用Cytoscape 3.8.0制作AZ成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

通過Disgenet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)獲得MI/RI靶點，再利用Venny 2.1工具整合AZ治療MI/RI的潛在靶點并繪圖。

將AZ抗MI/RI靶點導(dǎo)入STITCH數(shù)據(jù)庫(http://stitch.embl.de)獲得蛋白互作圖保存TSV格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件繪圖。

將AZ抗MI/RI靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)獲得GO富集信息以及KEGG信號通路信息。利用Cytoscape 3.8.0制作AZ成分-靶點-通路圖，利用R語言制作KEGG信號通路氣泡圖。

1.2 體外細(xì)胞實驗研究

1.2.1 細(xì)胞及材料

大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat vascular endothelial cells，RVEC)、HIFα、VEGF、eNOS、DMEM培養(yǎng)基(武漢博士德生物科技有限公司，批號：R0157，H202009、V202009、e202010、20201224)；附子、干姜(咸陽興盛德藥業(yè)有限公司，批號：20190912、20190915)；胎牛血清(杭州四季青公司，批號：HQ202003)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、凋亡試劑盒(南京建成生物科技有限公司，批號：20200612，20200701、20200813)；流式細(xì)胞儀(賽默飛有限公司)；酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)；小型垂直電泳槽、小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽(上海伯樂公司)；Odyssey Fc雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

1.2.2 藥物制備

AZ水煎液：按照中國藥典記載的方法進行制備。稱取附子35 g(先煎30 min)，干姜20 g完全浸泡在水中0.5 h，加入8倍量水，煮沸1.5 h，重復(fù)該步驟一次后收集提取液。經(jīng)紗布過濾濃縮至0.5 g生藥材/mL，將水煎液儲存于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞分組及造模

RVEC細(xì)胞用含10 %胎牛血清、1 %青霉素鏈霉素的培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后用于后續(xù)試驗。實驗分為五組：空白組(control，Con)、模型組(hypoxia/reoxygenation，H/R)、AZ低劑量組(AZ-L，0.125 mg/mL)、AZ中劑量組(AZ-M，0.25 mg/mL)、AZ高劑量組(AZ-H，0.5 mg/mL)。除Con組正常培養(yǎng)外，其余4組均參照文獻造模方法建立H/R模型，其中給藥組預(yù)處理24 h后建立H/R模型[9]。

1.2.4 細(xì)胞存活率檢測

按“1.2.3”方法分組將RVEC在96孔板上鋪板，每組設(shè)置6個復(fù)孔，按“1.2.3”中的方法造模給藥。造模后每孔加入10 μL CCK-8，在酶標(biāo)儀450 nm波長處記錄每孔的吸光度。

1.2.5 SOD、MDA、凋亡率檢測

RVEC細(xì)胞分組及造模后收集各組細(xì)胞按SOD、MDA、凋亡率試劑盒說明書進行檢測。

1.2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達

RVEC細(xì)胞分組及造模后收集各組細(xì)胞后用含有雞尾酒蛋白酶抑制劑(1∶100)和蛋白磷酸酶抑制劑(1∶50)的RIPA緩沖液冰溶30 min。采用BCA法測定上清中的蛋白濃度，用10% SDS-PAGE分離等量蛋白(30 μg)，然后電泳轉(zhuǎn)移到PVDF，用5%脫脂牛奶在TBST緩沖液中孵育2 h。然后用一抗：anti-HIF1α(1∶1 000)、anti-VEGF(1∶500)、anti-eNOS(1∶500)、anti-β-actin(1∶1 000)在4 ℃孵育過夜。第二天洗膜3次后用hrp標(biāo)記的IgG孵育膜，免疫印跡在增強化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)下成像。利用AlphaEase FC軟件分析了目標(biāo)帶的分子量和凈光密度。每個樣品的灰度值與β-actin灰度值之比用于反應(yīng)RVEC的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AZ活性成分收集與篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和文獻查找補充關(guān)鍵化合物，共獲得16個活性成分附子7個、干姜9個(見表1)，靶點171個。

表1 AZ活性成分Table 1 Active compounds of AZ

2.2 AZ活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape 3.8.0獲得AZ活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)(見圖1)，紅色三角形代表成分，綠色圓形代表靶點。

圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The target network of active compounds

2.3 AZ抗MI/RI靶點獲取

在Disgenet數(shù)據(jù)庫中獲取MI/RI相關(guān)靶點966個，利用Venny2.1工具獲得AZ抗MI/RI靶點80個(見圖2)。

圖2 成分靶點-疾病靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of component target-disease target

2.4 AZ抗MI/RI靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共同靶點導(dǎo)入STITCH數(shù)據(jù)庫獲得蛋白互作圖，保存TSV格式利用Cytoscape 3.8.0可視化PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。從圖可看出AKT1、IL6、TNF可能是AZ抗MI/RI的關(guān)鍵靶點。

圖3 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of targets

2.5 GO富集和KEGG通路分析

將AZ抗MI/RI靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中獲得GO、KEGG信息，利用EXCEL和R語言進行可視化。研究發(fā)現(xiàn)AZ抗MI/RI的生物過程主要與細(xì)胞凋亡、炎癥、血管舒張有關(guān)(見圖4)。通過KEGG氣泡圖發(fā)現(xiàn)AZ抗MI/RI可能通過PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、HIF信號通路發(fā)揮治療作用(見圖5)。

圖4 生物過程Fig.4 Biological process

圖5 前10個AZ抗MI/RI的通路Fig.5 The top 10 AZ anti-MI /RI signaling pathways

2.6 AZ對RVEC細(xì)胞存活率的影響

顯微鏡下觀察(100×)正常組細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞米粒狀。造模后與Con組相比H/R組細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞皺縮成圓形(P<0.01)；給藥組與H/R組相比細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)，在給藥組中AZ-M組治療效果最好(見圖6)。

圖6 AZ對RVEC細(xì)胞存活率的影響Fig.6 Effects of AZ on the survival rate of RVEC 注：與Con組對比，#P<0.05，##P<0.01；與H/R組對比，*P<0.05，**P<0.01，下同。Note:Compared with Con group, #P<0.05,##P<0.01;Compared with H/R group,*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.7 AZ對RVEC細(xì)胞凋亡率及氧化損傷的影響

與Con組相比，H/R組凋亡率增加、氧化損傷增加(P<0.01)；與H/R組相比，給藥組凋亡率降低、氧化損傷降低(P<0.01)，在給藥組中AZ-M組的治療效果最好(見圖7)。

圖7 AZ對RVEC細(xì)胞凋亡、氧化損傷的影響Fig.7 Effects of AZ on apoptosis and oxidative damage of RVEC

2.8 AZ對H/R損傷的RVEC細(xì)胞HIFα、VEGF、eNOS蛋白表達的影響

與Con組相比，H/R組HIFα、VEGF、eNOS蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與H/R組相比給藥組HIFα、VEGF、eNOS蛋白表達顯著增加(P<0.01)，綜合來看在給藥組中AZ-M組的治療效果最好(見圖8)。

圖8 AZ對RVEC細(xì)胞HIFα、VEGF、eNOS蛋白表達的影響Fig.8 Effects of AZ on the expression of HIFα,VEGF and eNOS proteins in RVEC

3 討論與結(jié)論

心肌缺血再灌注損傷在中醫(yī)學(xué)中屬于胸痹、心痛的范圍，胸痹的發(fā)生多與寒邪內(nèi)侵、情志失節(jié)、年邁體虛等因素有關(guān)[10]。附子和干姜藥性熱，是溫里藥的代表藥，附子無干姜不熱，AZ配伍溫里療效更好[11]。同時AZ用于治療胸痹是因為它具有溫陽通脈的功效，溫陽是指改善心肌細(xì)胞能量代謝，通脈是指舒張血管，AZ可改善能量代謝和舒張血管發(fā)揮治療作用[12]。為了驗證AZ是否通過改善能量代謝和舒張血管治療MI/RI，我們選擇了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來預(yù)測AZ抗MI/RI的生物過程與具體機制。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對AZ中活性成分進行分析，構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵成分排名前幾的是附子中的烏頭堿，干姜中的β-谷甾醇、10-姜酚?，F(xiàn)代藥理研究表明烏頭堿具有強心、抗心律失常等功效[13]；β-谷甾醇具有抗氧化、抗腫瘤等作用[14]；10-姜酚具有抗炎，改善H/R損傷的心肌細(xì)胞活力[15]。這些結(jié)果表明預(yù)測的成分很有可能是AZ抗MI/RI的關(guān)鍵活性成分。

通過對關(guān)鍵靶點進行GO-BP分析篩選出10個關(guān)鍵生物學(xué)過程。其中一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、在凋亡信號通路對DNA損傷的影響、脂多糖介導(dǎo)的信號通路等生物學(xué)過程與血管舒張、凋亡、炎癥、氧化損傷相互關(guān)聯(lián)。研究表明減少細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化損傷、促進血管舒張可減輕MI/RI[16]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的GO-BP結(jié)果與已知MI/RI相關(guān)文獻報道基本吻合，說明其結(jié)果具有一定的可行性。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)AZ可提高H/R損傷的RVEC細(xì)胞存活率、降低凋亡率、氧化損傷。

為了進一步探究AZ抗MI/RI的機制，通過KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)AZ抗MI/RI主要通過HIF信號通路、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路發(fā)揮治療作用，這三個信號通路被認(rèn)為是AZ抗MI/RI的潛在作用信號通路。HIF信號通路在MI/RI期間發(fā)揮著重要的作用[17]。缺氧誘導(dǎo)因子HIFα感知到機體缺氧時被激活，激活的HIFα提高下游的VEGF、eNOS表達。VEGF是血管新生誘導(dǎo)劑可促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，改善血管穩(wěn)態(tài)。一氧化氮合成酶eNOS可促進NO的釋放使血管舒張增加動脈血流量[18]。VEGF、eNOS在心肌組織缺氧期間被激活可促進血管組織舒張與血管生成，為心肌組織提供充足的氧氣[19]。PI3K-AKT信號通路在MI/RI期間減少心肌細(xì)胞凋亡[20]。TNF信號通路在MI/RI期間減少炎癥反應(yīng)[21]。已有的研究也表明通過HIF信號通路促進血管舒張、PI3K-AKT信號通路改善心肌細(xì)胞能量代謝、TNF信號通路減少炎癥反應(yīng)是治療MI/RI的重要信號通路[22,23]。AZ具有溫陽通脈的功效，其中溫陽是指改善心肌能量代謝減少心肌細(xì)胞凋亡已被證實[24]，是否促進血管舒張發(fā)揮治療作用尚不清楚。而在本研究中證實了AZ可激HIFα/VEGF/eNOS通路，提高H/R損傷的RVEC細(xì)胞HIFα、VEGF、NOS蛋白的表達，促進血管舒張/血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。值得注意的是在WB指標(biāo)中高劑量組的治療效果并不明顯，這可能是我們設(shè)置的劑量梯度不合理以及附子的有效成分也是有毒成分影響，在后面的研究中課題組將關(guān)注這方面的問題。

綜上所述，本研究獲得AZ活性成分16個、治療靶點171個；作圖分析發(fā)現(xiàn)AKT1、IL6、TNF為潛在靶點；GO富集分析發(fā)現(xiàn)AZ可能通過凋亡、炎癥、血管舒張發(fā)揮治療作用；KEGG分析發(fā)現(xiàn)AZ可能通過PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、HIF信號通路發(fā)揮治療作用；體外研究發(fā)現(xiàn)AZ可使H/R損傷的RVEC細(xì)胞存活率提高、降低凋亡率、氧化損傷；提高HIF-α、VEGF、eNOS蛋白的表達。AZ激活HIF/VEGF/eNOS信號通路降低血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷、凋亡、促進血管舒張/血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果是相符合的。AZ可通過HIF信號通路促進血管舒張與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖發(fā)揮治療作用，這為AZ進一步地開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。