丁酸梭菌芽孢對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、腸道菌群及短鏈脂肪酸含量的影響

袁海林 李向策 孫秋璇 譚小紅 蘇友祿 黃燕華 尹文飛 周萌

摘要： 【目的】研究飼用丁酸梭菌Clostridium butyricum （CB） 芽孢對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、腸道菌群組成及5 種短鏈脂肪酸含量的影響?！痉椒ā糠謩e將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0（對(duì)照）、0.050%、0.075% 和0.100% 的丁酸梭菌芽孢制劑添加到基礎(chǔ)飼料中（飼料中的活菌數(shù)分別為0、2.50×105、3.75×105、5.00×105 CFU/g），飼喂初始體質(zhì)量為（1.42±0.02） g 的凡納濱對(duì)蝦幼蝦30 d，然后檢測(cè)生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、腸道菌群組成以及短鏈脂肪酸含量?！窘Y(jié)果】與對(duì)照組相比，飼喂30 d 后對(duì)蝦的體質(zhì)量在0.050% 和0.075% CB 組顯著提高（P<0.05），質(zhì)量增加率則在0.050% CB 組顯著提高（P<0.05）；0.075% CB 組對(duì)蝦的血清葡萄糖、0.100% CB 組的血清尿素氮濃度顯著降低（P<0.05），0.050% CB 組血清磷濃度顯著上升（P<0.05）。與對(duì)照組相比，0.050% CB 組浮霉菌門Planctomycetes 和髕骨菌門Patescibacteria 豐度顯著提高（P<0.05）；0.050% 和0.075% CB 組弧菌屬Vibrio 的豐度顯著降低（P<0.05）。多樣性分析表明，0.050% 和0.075% CB 組的腸道菌群組成相似度更高，且明顯不同于對(duì)照組和0.100% CB 組。腸道內(nèi)容物中5 種短鏈脂肪酸的含量均隨丁酸梭菌添加量的升高而增加?！窘Y(jié)論】飼料中添加CB 芽孢制劑可能通過抑制腸道內(nèi)潛在病原菌豐度、提高腸道短鏈脂肪酸的含量，改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，從而提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能。本研究中CB 芽孢制劑在飼料中的適宜添加量為2.50×105 或3.75×105 CFU/g。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對(duì)蝦；丁酸梭菌芽孢；生長(zhǎng)性能；腸道菌群；短鏈脂肪酸

中圖分類號(hào)： S963文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1001-411X（2023）02-0212-09

凡納濱對(duì)蝦Paneaus vannamei 為世界三大養(yǎng)殖蝦類之一。自1988 年引入中國(guó)以來，迄今已有40 多年的養(yǎng)殖歷史，2020 年全國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到186.3 萬噸[1]。然而，隨著集約化養(yǎng)殖的加強(qiáng)，由于養(yǎng)殖密度過高、過度投喂以及飼料營(yíng)養(yǎng)不均衡引發(fā)的腸道損傷問題頻發(fā)，由此導(dǎo)致對(duì)蝦消化吸收功能下降、免疫能力和生長(zhǎng)受損，養(yǎng)殖成功率和養(yǎng)殖效益下降。因此，開發(fā)綠色、高效的對(duì)蝦腸道保健產(chǎn)品，成為保障凡納濱對(duì)蝦健康養(yǎng)殖的當(dāng)務(wù)之急。

丁酸梭菌Clostridium butyricum （CB） 屬于芽孢桿菌科梭菌屬，是一種專性厭氧的革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌。自1933 年被發(fā)現(xiàn)、1935 年被分離及1992 年引入我國(guó)以來，其促進(jìn)腸道健康的效果已在多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物如羅非魚[2]、石斑魚[3]、鰻鱺[4]、鮸魚[5]、鯉魚[6] 等中得到證實(shí)，其已知作用途徑主要包括增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能、調(diào)節(jié)宿主腸道菌群、調(diào)節(jié)腸道pH，促進(jìn)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收等。丁酸梭菌于2009 年被我國(guó)正式批準(zhǔn)作為新飼料添加劑使用，在當(dāng)前國(guó)家養(yǎng)殖減抗、飼料替抗（生素） 的大背景下，其開發(fā)和應(yīng)用將受到持續(xù)關(guān)注。

近年來的研究表明，飼用丁酸梭菌能改善克氏原螯蝦、羅氏沼蝦、日本囊對(duì)蝦的抗氧化功能，提高腸道消化酶活性，或改善腸道形態(tài)、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)[7-9]，說明丁酸梭菌在蝦類飼料中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但將丁酸梭菌作為腸道健康產(chǎn)品應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦的研究還比較缺乏。有研究表明，在飼料中分別添加丁酸梭菌活菌、芽孢、破碎菌體或活菌與發(fā)酵上清混合物，均能提高凡納對(duì)蝦生長(zhǎng)性能，且丁酸梭菌活菌和破碎菌體皆可提高凡納對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抵抗力，綜合考慮生長(zhǎng)性能、抗病力及產(chǎn)品保質(zhì)期，丁酸梭菌芽孢更具有應(yīng)用價(jià)值[10-11]。為此，本研究擬選用一種丁酸梭菌芽孢制劑，研究其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、腸道菌群及腸道內(nèi)短鏈脂肪酸含量的影響，為明確丁酸梭菌芽孢制劑在凡納濱對(duì)蝦中的應(yīng)用效果及探討其可能的作用途徑提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料配制

以進(jìn)口魚粉、小麥粉、去皮豆粕為主要蛋白源，精制魚油為脂肪源，配制凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料配方及其營(yíng)養(yǎng)水平測(cè)定值如表1 所示。丁酸梭菌菌株（DZNCB-1-105） 分離自土壤，其芽孢制劑由廣東大澤農(nóng)生物科技有限公司提供，粉狀，活菌數(shù)為5×108 CFU/g。分別將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0（對(duì)照）、0.050%、0.075% 和0.100% 的丁酸梭菌添加到基礎(chǔ)飼料中，即飼料中的活菌數(shù)分別為0、2.50×105、3.75×105 和5.00×105 CFU/g，各處理簡(jiǎn)稱為對(duì)照組（CK）、 0.050% CB 組、0.075% CB 組和0.100%CB 組。和其他飼料原料充分混合均勻后，用雙螺桿擠壓機(jī)制成直徑為1.5 mm 的4 種試驗(yàn)飼料，于?20 ℃ 條件下保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

凡納濱對(duì)蝦購(gòu)于廣東省湛江市某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，購(gòu)回后放入廣東恒興集團(tuán)“863”基地室內(nèi)海水流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2 周，暫養(yǎng)期間每日投喂基礎(chǔ)飼料4 次。暫養(yǎng)期結(jié)束后，挑選480 尾大小均勻、健康的幼蝦，初始體質(zhì)量為（1.42±0.02） g，將幼蝦隨機(jī)分成4 組，每組設(shè)4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 尾蝦，置于流水養(yǎng)殖系統(tǒng)的350 L PVC 水族箱中。分別投喂4 種試驗(yàn)飼料，每日投喂4 次（07：00、11：30、16：00和20：30），日投飼率4%～6%，每3 d 根據(jù)蝦的攝食情況調(diào)整投飼率。試驗(yàn)用水為經(jīng)砂濾、臭氧消毒的天然海水，水溫（28±1） ℃，鹽度（22±2）‰。通過不定期進(jìn)水、排污及充氧，保持溶氧為（8.0±0.2） mg/L，氨氮（0.04±0.003） mg/L。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)30 d。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 生長(zhǎng)性能 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)水族箱的蝦稱質(zhì)量、計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)飼料投喂量，計(jì)算各處理組對(duì)蝦的存活率、質(zhì)量增加率和飼料系數(shù)。

存活率= 收獲尾數(shù)=放養(yǎng)尾數(shù)_100%;

質(zhì)量增加率= （末質(zhì)量初質(zhì)量）=初質(zhì)量_100%;

飼料系數(shù)= 投喂量=（末質(zhì)量初質(zhì)量）。

1.3.2 全蝦及基礎(chǔ)飼料的營(yíng)養(yǎng)組成 每箱隨機(jī)取6 尾蝦，作為1 個(gè)重復(fù)，保存于?20 ℃ 條件下用于檢測(cè)全蝦體成分。分別采用105 ℃ 恒溫干燥法、凱氏定氮法、索氏抽提法及550 ℃ 灼燒法測(cè)定全蝦及基礎(chǔ)飼料的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量。

1.3.3 血清生化指標(biāo) 每箱隨機(jī)取9 尾蝦，使用1 mL 注射器，從圍心腔抽取血淋巴，4 ℃ 靜置2 h后，使用冷凍離心機(jī)（Eppendorf，5425R）10 000r/min 離心10 min，取上層血清。每3 尾蝦的血清混合成1 個(gè)樣品，作為1 個(gè)重復(fù)，保存于?80 ℃ 條件下待測(cè)，每個(gè)處理12 個(gè)重復(fù)。血清生化指標(biāo)用全自動(dòng)生化分析儀（HITACHI，7 170 型） 根據(jù)專用試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 腸道菌群組成 每箱隨機(jī)取6 尾蝦，在冰盤上取出腸道內(nèi)容物，混合后置于凍存管，作為1 個(gè)重復(fù)，迅速保存于?80 ℃ 條件下待測(cè)，每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)。用DNA Kit（Omega Biotek） 試劑盒提取腸道細(xì)菌基因組DNA。取合格樣本DNA 擴(kuò)增16SrDNA 序列的V4 可變區(qū)。擴(kuò)增引物為515F（5'-G T G C - C A G C M G C C G C G G - 3 ' ） 和8 0 6 R （ 5 ' -GGACTACH-VGGGTWTCTAAT-3'）。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)，之后按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，構(gòu)成測(cè)序樣品文庫(kù)。由I l l u m i n a M i S e q 測(cè)序儀采用M i S e q R e a g e n tKitv2（500-cycle） 完成測(cè)序。采用Qiime 平臺(tái)和RDP classifier 2.2 軟件對(duì)97% 相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，置信度閾值為0.8，并在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。利用Mothur 軟件統(tǒng)計(jì)樣品的α 多樣性，結(jié)果用Sob、Chao、Ace、Shannon 以及Simpson 多樣性指數(shù)來表示。用QIIME v1.80 軟件統(tǒng)計(jì)分析樣品的β 多樣性指數(shù)，采用主坐標(biāo)分析（Principal coordinatesanalysis，PCoA） 來進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用PCoA 散點(diǎn)圖來表示不同處理之間的微生物群落物種組成的差異。

1.3.5 腸道內(nèi)短鏈脂肪酸含量 每箱隨機(jī)取6 尾蝦，在冰盤上取出蝦腸道內(nèi)容物，混合后置于1.5mL 無菌離心管中，作為1 個(gè)重復(fù)，置于?80 ℃ 冰箱中保存，每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)。取0.1 g 樣品于2.0mL 的Ep 管中，加入400 μL 體積分?jǐn)?shù)為50% 的乙腈溶液、200 μL 的200 mmol/L 3-NPH 及200μL 的120 mmol/L EDC 溶液（含體積分?jǐn)?shù)為6% 的吡啶） 渦旋1 min 混勻，40 ℃ 反應(yīng)1 h，期間每隔5min 震蕩1 次；反應(yīng)完成后12 000 r/min、4 ℃ 離心1 5 m i n，取上清液上機(jī)進(jìn)行L C - M S / M S （美國(guó)WATERS 的液相色譜Waters Acquity UPLC 、美國(guó)SCIEX 的質(zhì)譜AB SCIEX 5500 QQQ-MS ）。色譜分離條件：柱溫40 ℃，流速0.30 mL/min；流動(dòng)相組成：A 為水（含φ 為0.1% 的甲酸），B 為乙腈（含φ 為0.1% 的甲酸）。運(yùn)行8 min，進(jìn)樣量6 μL。質(zhì)譜分析條件：電子轟擊電離（ESI 離子源），離子源溫度4 5 0 ℃，離子源氣體3 5 a r b。選擇離子檢測(cè)（SIM） 進(jìn)行定量分析。按照上述色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣，利用MultiQuant 軟件進(jìn)行積分，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)濃度計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。結(jié)果先進(jìn)行單因子方差分析（One-way ANOVA），再通過 Duncans多重比較分析數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

如表2 所示，各組對(duì)蝦的存活率為96.66%～100.00%。其中，0.100% CB 組存活率達(dá)到100.00%。與對(duì)照組相比，0.050% 和0.075% CB 組對(duì)蝦的末質(zhì)量顯著提高（P<0.05）；其中0.050% CB 組質(zhì)量增加率也顯著提高。飼料系數(shù)在丁酸梭菌各添加組有下降趨勢(shì)，但和對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

2.2 丁酸梭菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)組成的影響

如表3 所示，添加丁酸梭菌各組凡納濱對(duì)蝦的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量和對(duì)照組相比，均沒有顯著差異。

2.3 丁酸梭菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響

如表4 所示，和對(duì)照組相比，0.075% CB 組對(duì)蝦血清的葡萄糖濃度顯著下降；該組膽固醇、甘油三酯濃度也低于其他各組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著丁酸梭菌添加量的升高，血清尿素氮濃度呈下降趨勢(shì)，0.100% CB 組顯著低于對(duì)照組；而添加丁酸梭菌提高了血清磷濃度，在0 . 0 5 0 %CB 組達(dá)到顯著性水平?？偟鞍诐舛仍诟鹘M之間無顯著差異。

2.4 丁酸梭菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物菌群組成的影響

表5 展示了各組豐度排名前10 位的菌門。和對(duì)照組相比， 丁酸梭菌各添加組浮霉菌門Planctomycetes 的豐度顯著升高，且在0.075%C B 組達(dá)到最高； 0 . 0 5 0 % C B 組髕骨菌門Patescibacteria 的豐度也顯著高于對(duì)照組。其余各菌門的豐度在組間差異不顯著。

在屬水平，和對(duì)照相比，0.050% 和0.075%CB 組弧菌屬Vibrio 豐度顯著下降，假交替單孢菌屬Pseudoalteromonas 豐度有下降趨勢(shì)；但后者在0.100% CB 組豐度反而呈升高趨勢(shì)。其余各屬在組間差異不顯著（表6）。

以97% 序列相似度為閾值生成OTU 后，計(jì)算不同樣品的5 個(gè)α 多樣性指數(shù)，并生成箱形圖，以分析樣品的α 多樣性（圖1 ） 。結(jié)果表明， S o b 、Chao、Ace 和Shannon 多樣性指數(shù)的變化趨勢(shì)一致：與對(duì)照組相比，0.050% 和0.075% CB 組對(duì)蝦腸道菌群的4 項(xiàng)指數(shù)較高；當(dāng)進(jìn)一步將添加量提高到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.100% 時(shí)，4 項(xiàng)指數(shù)數(shù)值均下降，但各組之間差異不顯著。Simpson 多樣性指數(shù)亦在組間差異不顯著。β 多樣性分析表明，同一處理樣品基本聚為一簇，其中0.050% 和0.075% CB 組的樣本距離較接近，而對(duì)照組和0.100% CB 組與其他2 組樣本的距離較遠(yuǎn)，表明0.050% 和0.075% CB 組物種組成較相似（圖2）。

2.5 丁酸梭菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)短鏈脂肪酸含量的影響

隨著丁酸梭菌添加量的升高，對(duì)蝦腸道內(nèi)5 種短鏈脂肪酸的含量均有不同程度的升高（表7）。和對(duì)照組相比，乙酸含量在0.050%、0.075% 和0 . 1 0 0 % CB 組分別升高了3 1 . 4 % 、9 8 . 1% 和182.5%；丙酸含量升高了6.7%、40.0% 和266.7%；丁酸含量升高了?10.0%、65.0% 和60.0%；戊酸含量升高了9.7%、95.6% 和140.7%，己酸含量升高了5.7%、68.6% 和117.1%?？梢?，飼料中添加丁酸梭菌總體上大幅增加了腸內(nèi)5 種短鏈脂肪酸的含量。

3 討論與結(jié)論

3.1 丁酸梭菌對(duì)生長(zhǎng)性能的影響

丁酸梭菌對(duì)動(dòng)物的促生長(zhǎng)作用與其生物學(xué)特性密切相關(guān)。該菌屬厭氧芽孢桿菌，在不良環(huán)境脅迫下能以孢子形式存在，具有更強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽特性，能夠很好地在腸道定植而發(fā)揮作用。研究表明，丁酸梭菌能提高羅氏沼蝦[12]、日本沼蝦[13] 和斑節(jié)對(duì)蝦[14] 等的生長(zhǎng)性能，本研究中適宜數(shù)量的丁酸梭菌顯著提高了凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，進(jìn)一步表明蝦等無脊椎動(dòng)物也可有效利用飼料中的丁酸梭菌，提高生長(zhǎng)性能。

3.2 丁酸梭菌對(duì)血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)可以反映出機(jī)體能量代謝和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力。血清總蛋白和白蛋白含量的升高是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝旺盛的體現(xiàn)[15]，尿素氮是衡量動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡的一個(gè)重要指標(biāo)，血清尿素氮的降低通常伴隨著蛋白質(zhì)沉積的升高[16]。在豬和肉雞中的研究表明，飼料中添加丁酸梭菌可以顯著降低兩者血清尿素氮的濃度，并顯著提高血清總蛋白、白蛋白和球蛋白的濃度[16-17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，添加丁酸梭菌可顯著降低對(duì)蝦血清尿素氮濃度，0.050% 和0.075% CB 組的總蛋白濃度也有升高趨勢(shì)；同時(shí)，還觀察到血清磷濃度的顯著升高。這可能是因?yàn)檫M(jìn)入腸道的丁酸梭菌在腸道產(chǎn)生的短鏈脂肪酸促使腸道酸度增加，從而有利于某些有益菌的生長(zhǎng)繁殖，增強(qiáng)消化酶活性，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)尤其是蛋白質(zhì)及礦物元素的消化率[16]。血糖水平在一定程度上可以反映機(jī)體的合成代謝情況。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.075% 的丁酸梭菌顯著降低了對(duì)蝦血糖水平。類似的研究包括，丁酸梭菌可以降低糖尿病小鼠的空腹血糖，改善糖尿病及相關(guān)代謝紊亂[18]；飼料中添加丁酸梭菌可降低豬對(duì)感染大腸埃希菌的應(yīng)激反應(yīng)，降低血糖水平[19]。但也有研究表明，飼料中添加丁酸梭菌能提高犢牛的生長(zhǎng)性能和血清葡萄糖含量[20]。有關(guān)丁酸梭菌調(diào)節(jié)動(dòng)物糖代謝的機(jī)制及效果，還需要更多的研究數(shù)據(jù)支持。

3.3 丁酸梭菌對(duì)腸道菌群的影響

本研究中，凡納濱對(duì)蝦腸道第一、二優(yōu)勢(shì)菌分別是變形菌門和擬桿菌門，它們也是大多數(shù)研究中對(duì)蝦腸道的常見優(yōu)勢(shì)菌[21-22]，豐度并未受飼料中丁酸梭菌的影響，表明它們可能是對(duì)蝦體內(nèi)穩(wěn)定的“核心菌群”[23]。和對(duì)照組相比，添加3 種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的丁酸梭菌均顯著提高了對(duì)蝦腸道內(nèi)浮霉菌門的豐度。浮霉菌門的成員在水生系統(tǒng)中普遍存在，包含多種厭氧氨氧化細(xì)菌，是高氨污染系統(tǒng)脫氮的生態(tài)友好型微生物[24]。郁維娜等[25] 的研究顯示，健康凡納濱對(duì)蝦腸道中浮霉菌門豐度顯著高于患病蝦，表明浮霉菌門的增殖有利于提高對(duì)蝦的健康水平。同時(shí)，飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.050% 和0.075% 的丁酸梭菌降低了對(duì)蝦腸道弧菌屬的豐度，對(duì)假交替單胞菌屬的豐度有降低的趨勢(shì)?；【鷮僦械暮芏喾N類是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常見的病原菌，其在腸道以及水體中豐度的升高常被視為蝦類弧菌病暴發(fā)的前奏[26]。Sumon 等[27]的研究表明，丁酸梭菌可以抑制羅氏沼蝦腸道內(nèi)弧菌的生長(zhǎng)；宋增福等[28] 使用腸細(xì)胞模型評(píng)估丁酸梭菌對(duì)鰻弧菌黏附能力的拮抗作用，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌有效抑制鰻弧菌對(duì)魚類腸道的黏附。假交替單胞菌是一種能產(chǎn)生多種胞外活性物質(zhì)的海洋細(xì)菌屬，為對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的常見致病菌，有研究證實(shí)其具有較強(qiáng)的致腐能力，并且其在患病凡納濱對(duì)蝦中的豐度顯著高于健康組[25]?？梢姡砑佣∷崴缶芙档湍c道中這些潛在病原菌的豐度，這可能與丁酸梭菌能夠通過改善腸道屏障功能來降低病原菌的入侵和定植，以及其含有的脂磷壁酸等益生成分抑制了病原菌對(duì)腸道細(xì)胞的黏附作用，或其代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸的抑菌作用有關(guān)[29-30]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)梭菌屬并非腸道內(nèi)容物的優(yōu)勢(shì)菌，推測(cè)丁酸梭菌對(duì)于腸道上皮細(xì)胞具有高黏附作用，大部分可定植在腸壁，而非直接進(jìn)入腸腔，但需要通過細(xì)菌定植試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

3.4 丁酸梭菌對(duì)腸道短鏈脂肪酸的影響

丁酸梭菌可在動(dòng)物腸道發(fā)酵，產(chǎn)生以丁酸為主的短鏈脂肪酸，它們對(duì)動(dòng)物腸道的能量供應(yīng)、腸黏膜屏障的維持、腸道高敏感和腸道動(dòng)力的調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等具有重要作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著丁酸梭菌添加量的升高，凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物中5 種短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸） 的含量均顯著升高，這與D u a n 等[ 9 ] 在日本囊對(duì)蝦Marsupenaeus japonicus 中的研究結(jié)果一致。不同種類的短鏈脂肪酸或其衍生物對(duì)提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)代謝的作用也在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)。如飼料中添加丙酸鈉可增加凡納濱對(duì)蝦對(duì)能量和磷的表觀消化率，調(diào)節(jié)其腸道微生物并促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)[32]；在飼料中添加丁酸鹽能夠顯著提高商業(yè)蝦采食量，改善其生長(zhǎng)[ 3 3 ]；添加3%（w） 的β?羥基丁酸可改善凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能、腸道消化酶活性及免疫水平，并增加其腸道短鏈脂肪酸含量[34]；在藍(lán)蟹Salvelinus alpinus 飼料中分別添加乙酸鈉、檸檬酸鈉、丁酸鈉或2%（w） 丙酸鈉等有機(jī)酸，均能夠促進(jìn)藍(lán)蟹生長(zhǎng)，促進(jìn)其蛻皮，并提高其存活率[35]。目前關(guān)于戊酸對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物腸道健康的影響研究甚少，但研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加戊酸酯可降低小鼠腸道艱難梭菌的存活數(shù)[36]，且腸道菌群代謝產(chǎn)生的戊酸可防止小鼠的輻射損傷[37]。然而，本研究中也觀察到，添加丁酸梭菌至0.100%（w） 時(shí)，盡管腸道短鏈脂肪酸含量進(jìn)一步升高，但對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能指標(biāo)并未繼續(xù)升高，且腸道菌群組成和0.050% 及0.075% CB 組相比，發(fā)生了較大變化，表明短鏈脂肪酸的過量產(chǎn)生可能會(huì)使腸道pH 過低，導(dǎo)致腸道發(fā)生酸脅迫，從而破壞腸道菌群平衡[38]，影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能。

綜上，本研究證實(shí)，飼料中添加丁酸梭菌芽孢制劑可抑制腸道潛在病原菌的豐度、提高腸道短鏈脂肪酸的含量，改善腸道健康水平，從而改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)條件下，丁酸梭菌芽孢制劑在飼料中的適宜添加劑量為2.50×105 或3.75×105 CFU/g。

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【責(zé)任編輯 莊 延】