靶向切割豬Y 染色體的CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建及功能驗(yàn)證

霍夢(mèng)飛 孟繁明 王塑天 李顥 楊化強(qiáng)

摘要： 【目的】通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)Y 染色體多位點(diǎn)切割，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)染色體的敲除，為畜禽性別控制提供新的手段?！痉椒ā恳訡RISPR/Cas9 技術(shù)為基礎(chǔ)，尋找Y 染色體上能被sgRNA 特異性識(shí)別的多拷貝重復(fù)序列，并通過體外切割、定量分析、核型鑒定驗(yàn)證其對(duì)靶點(diǎn)的有效性?！窘Y(jié)果】所設(shè)計(jì)的sgRNA 能夠在體外實(shí)現(xiàn)對(duì)靶片段的明顯切割，且切割效率均達(dá)到了50% 以上。基因的定量分析結(jié)果證明了其在細(xì)胞水平切割的有效性，且簇狀重復(fù)序列切割效果明顯優(yōu)于散在重復(fù)序列；核型鑒定結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞水平豬Y 染色體的丟失?！窘Y(jié)論】研究結(jié)果為后續(xù)構(gòu)建染色體敲除豬，實(shí)現(xiàn)豬的性別控制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 豬；CRISPR/Cas9；Y 染色體；性別控制；基因編輯

中圖分類號(hào)： S813.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1001-411X（2023）02-0187-10

染色體作為生物遺傳物質(zhì)的載體，對(duì)當(dāng)前生命遺傳研究開展尤為重要。染色體消除技術(shù)（Chromosomeelimination technology） 近年來隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展不斷進(jìn)步，在動(dòng)物模型構(gòu)建、家畜育種改良中的性別控制、特定染色體的功能研究以及人類非整倍體疾病治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前通過該技術(shù)已成功在人、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)了特定染色體的消除[1-3]，然而打靶效率低、非靶點(diǎn)的額外失活及操作過程的繁瑣性大大制約了該技術(shù)的發(fā)展[3-5]。但隨著新一代CRISPR/Cas9 技術(shù)的出現(xiàn)，靈活的靶點(diǎn)選擇、較高的編輯效率以及對(duì)于靶點(diǎn)多重切割的可能性使該技術(shù)的有效運(yùn)用成為可能。

目前，研究者們已通過鋅指核酸酶（Zinc fingernuclease，ZFN） 技術(shù)、Cre/loxP 系統(tǒng)、TKNEO 基因敲入等多種方法實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)染色體的敲除[5-7]。ZFN 技術(shù)通過人工改造的核酸內(nèi)切酶（鋅指蛋白單元） 與特定的DNA 序列結(jié)合賦予其精確的打靶功能[8]，但其脫靶效應(yīng)、毒性及鋅指結(jié)構(gòu)的低適用性造成其基因操作效率低下[ 9 ]；Cre/loxP 系統(tǒng)主要由Cre 重組酶與2 個(gè)loxP 位點(diǎn)組成，由于loxP 的位點(diǎn)不同會(huì)產(chǎn)生DNA 鏈的插入、刪除、易位等不同重組方式[10]，但該系統(tǒng)的使用需要引入特定表達(dá)元件且本身會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[4， 11]；TKNEO 是胸苷激酶（Thymidine kinase，TK） 和新霉素抗性（Neomycinresistance，NEO） 的融合編碼基因，利用傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)敲入目標(biāo)染色體進(jìn)行藥篩可產(chǎn)生自發(fā)性染色體缺失[3]，但其操作的繁瑣性和不確定性使其并不具有廣泛的適用性。

CRISPR/Cas9 技術(shù)近年來已經(jīng)成為了基因編輯的主要手段，其由大腸埃希菌Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)改造而來，由于其引導(dǎo)RNA（Small guide RNA，sgRNA） 序列的靈活性而能對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行靈活編輯，從而實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲入、敲除或其他多種修飾[12-16]。該系統(tǒng)主要由2 個(gè)部分組成，Cas9 蛋白和sgRNA，其中后者負(fù)責(zé)識(shí)別目標(biāo)靶序列，前者依靠其自身含有的2 個(gè)切割域完成對(duì)目標(biāo)序列的切割，之后依靠細(xì)胞本身的2 種修復(fù)機(jī)制（同源重組修復(fù)和非同源末端連接） 實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的精確編輯[17-21]。最新研究表明，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可通過產(chǎn)生多重DNA 雙鏈斷裂（Double-strand breakage，DSB） 引起Y 染色體降解[22-23]，對(duì)這種方法，雖然部分細(xì)胞會(huì)因自身修復(fù)機(jī)制保持基因組的穩(wěn)定性，但是仍有相當(dāng)?shù)膸茁士僧a(chǎn)生特定染色體消除的細(xì)胞，通過篩選出此種染色體消除的細(xì)胞系作為供體應(yīng)用于動(dòng)物克隆，可制備出特定染色體消除的動(dòng)物，因此達(dá)到控制動(dòng)物本身及其后代的性別進(jìn)行偏移的目的。

本研究擬通過CRISPR/Cas9 技術(shù)，在豬Y 染色體內(nèi)尋找能夠被特異sgRNA 識(shí)別的重復(fù)序列，進(jìn)行多位點(diǎn)切割以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)染色體的降解。本研究旨在為特定染色體及其攜帶基因功能的研究提供一種新的工具，同時(shí)也為實(shí)現(xiàn)大型家畜性別控制提供一種新的技術(shù)方案。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用的CRISPR/Cas9 載體HP180_p x 3 3 0 _ G F P 及豬胎兒成纖維細(xì)胞（ P o r c i n eembryonic fibroblast，PEF） 由國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心保存。設(shè)計(jì)的sgRNA 及相關(guān)引物由華大基因合成。質(zhì)粒與基因組DNA 抽提試劑盒、限制性內(nèi)切酶B p i I 、g R N A 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit、熒光定量試劑盒PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 購自賽默飛公司；T4 DNA 連接酶購自TaKaRa 公司；Cas9 內(nèi)切酶購自NEB 公司；感受態(tài)細(xì)胞Trans5α、6×DNA Loading buffer、RNA loading buffer 購自全式金生物。高糖DMEM 培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清均購自Gibco 公司。

1.2 方法

1.2.1 尋找Y 染色體特異靶向重復(fù)序列及sgRNA設(shè)計(jì) 在Ensembl 獲取整個(gè)Y 染色體注釋文件，在Linux 下用awk 命令提取注釋文件中的所有基因，并在Ensembl 上將每個(gè)基因與全基因組序列進(jìn)行逐一比對(duì)，最終篩選出符合條件的多拷貝基因。利用在線網(wǎng)站CCTop - CRISPR/Cas9 targetonline predictor（https：//cctop.cos.uni-heidelberg.de/）對(duì)所選擇靶基因進(jìn)行sgRNA 設(shè)計(jì)，確定最終序列與位點(diǎn)，并送至華大基因合成。

1 . 2 . 2 s g R NA 體外切割驗(yàn)證 對(duì)設(shè)計(jì)好的sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行切割，初步篩選出效率較高的進(jìn)行載體構(gòu)建。首先進(jìn)行靶片段的PCR 擴(kuò)增。根據(jù)本試驗(yàn)靶基因的選擇，使用Primer Premier 6 進(jìn)行相應(yīng)靶點(diǎn)引物設(shè)計(jì)，合成目標(biāo)靶片段。然后根據(jù)賽默飛公司的GeneArtTM Precision gRNA SynthesisKit 說明書設(shè)計(jì)sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄模板引物，并最終進(jìn)行G e n e _ I D 為E N S S S C G 0 0 0 0 0 0 4 3 0 5 8 、ENSSSCG00000046447 的轉(zhuǎn)錄模板合成（以下簡(jiǎn)稱為43058、46447）。其合成原理（圖1） 及相關(guān)引物（表1、表2） 如下所示。

體外Cas9 切割驗(yàn)證主要包含3 個(gè)過程：Cas9-sgRNA 的自發(fā)組裝、Cas9-sgRNA 復(fù)合體與靶片段的特異結(jié)合、Cas9-sgRNA 對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行特異切割。采用2 0 μ L 反應(yīng)體系： 體外轉(zhuǎn)錄s g R NA 模板100 ng，靶片段250 ng，Cas9 蛋白1 μL，10×Cas9Reaction buffer 2 μL，最后加Nuclease-free water 補(bǔ)足至20 μL。

在進(jìn)行Cas9 體外切割時(shí)，反應(yīng)體系首先加入除靶片段外其他成分進(jìn)行Cas9 與sgRNA 組裝（組裝時(shí)間30 min），再加入相應(yīng)靶片段孵育1 h，切割完畢后在反應(yīng)體系中加入2 μL 的蛋白酶K 再次孵育20 min。最終切割產(chǎn)物加入6×DNA LoadingBuffer 進(jìn)行20 g/L 的凝膠電泳，分析電泳條帶灰度計(jì)算切割效率。

1.2.3 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建 確定有效的sgRNA 后進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建。首先使用限制性內(nèi)切酶BpiI 對(duì)載體HP180_px330_GFP（圖2） 雙酶切使其線性化，合成的sgRNA 經(jīng)退火形成雙鏈由T4 連接酶在16 ℃ 條件下連接1 h，然后熱應(yīng)激轉(zhuǎn)入Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞，于220 r/min、37 ℃培養(yǎng)1 h 后涂布含氨芐青霉素的LB 平板，隔夜培養(yǎng)后挑取單克隆，進(jìn)行菌液PCR 并送測(cè)序，測(cè)序正確菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用于PEF 電轉(zhuǎn)。

1.2.4 PEF 培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 試驗(yàn)所用細(xì)胞經(jīng)鑒定為公豬細(xì)胞（使用引物F：TCATAGCTCAAACGATGGACGTG，R：ACACAATGAAAGCGTTCATGGGTC，擴(kuò)增片段大小為92 bp）。PEF 復(fù)蘇后加入含體積分?jǐn)?shù)為12% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液，置于38 ℃、CO2 體積分?jǐn)?shù)為5% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)復(fù)蘇后的細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90% 時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05% 的胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取1×106 mL?1 細(xì)胞懸液加入1.5 mL離心管，加入100 μL 電轉(zhuǎn)液及目的質(zhì)粒以Lonza核轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)程序A003。轉(zhuǎn)染24 h 后，熒光顯微鏡下拍照并觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光信號(hào)強(qiáng)弱，判斷轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5 流式分選及單細(xì)胞克隆團(tuán)鑒定 細(xì)胞轉(zhuǎn)染2～3 d 后進(jìn)行流式分選（Fluorescence activating cellsorter，F(xiàn)ACS）。細(xì)胞分選前經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05% 的胰酶消化，加入含體積分?jǐn)?shù)為2% 胎牛血清的DPBS 重懸，并在上機(jī)前經(jīng)40 μm 細(xì)胞篩過濾防止細(xì)胞團(tuán)塊的干擾。根據(jù)GFP 標(biāo)記激發(fā)波長(zhǎng)488 nm分選出陽性細(xì)胞（5×104～10×104 個(gè)） 并進(jìn)行極限稀釋（梯度稀釋降低細(xì)胞密度） 培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)形成單個(gè)細(xì)胞團(tuán)后取部分細(xì)胞抽提DNA 進(jìn)行Y 染色體性別決定區(qū)（Sex determination region of Y chromosome，SRY） 基因鑒定。引物信息如表3 所示。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量熒光PCR 檢測(cè)Y 染色體敲除效率 分選后待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90% 提取基因組DNA，并設(shè)計(jì)相應(yīng)靶基因及SRY 定量引物（表3）觀察其DNA 含量是否顯著降低。以基因組為模版檢測(cè)目的基因在DNA 水平的含量是否變化，并以基因組水平的β-actin 為內(nèi)參。反應(yīng)體系與反應(yīng)產(chǎn)物均按照相應(yīng)試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser 與PowerUpTM SYBRTM GreenMaster Mix） 說明進(jìn)行。

1.2.7 核型鑒定 對(duì)SRY 鑒定為陰性細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)繁培養(yǎng)，并傳代至T25 培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為70%～80% 時(shí)進(jìn)行核型分析，判斷染色體核型是否缺失。核型分析由杭州卡優(yōu)太譜生物科技公司進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 多拷貝基因查詢及sgRNA 設(shè)計(jì)結(jié)果

2.1.1 多拷貝基因查詢結(jié)果 通過Ensembl 的blast 篩選出了35 個(gè)位于Y 染色體上的多拷貝基因，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4 所示。

通過再次與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，以及基于靶點(diǎn)基因組測(cè)序的真實(shí)結(jié)果與sgRNA 設(shè)計(jì)的實(shí)際情況，我們最終選擇了網(wǎng)站預(yù)測(cè)評(píng)分較高、符合測(cè)序結(jié)果且在Y 染色體上重復(fù)拷貝數(shù)靠前（多位點(diǎn)DSB） 的Gene_ID 為ENSSSCG00000043058、ENSSSCG00000046447 的基因進(jìn)行了sgRNA 設(shè)計(jì)。這2 個(gè)基因在全基因組的比對(duì)結(jié)果如圖3 所示。

2.1.2 sgRNA 設(shè)計(jì)結(jié)果 對(duì)ENSSSCG0000004 3 0 5 8 和E N S S S C G 0 0 0 0 0 0 4 6 4 4 7 位點(diǎn)進(jìn)行sgRNA 設(shè)計(jì)（表5）。在sgRNA 及其互補(bǔ)序列末端分別加上與BpiI 酶切HP180_px330_GFP 質(zhì)?；パa(bǔ)的黏性末端，由華大基因合成相應(yīng)的Oligo。

2.2 sgRNA 體外切割結(jié)果

以野生型PEF DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析后切膠回收得到sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄模板。根據(jù)G e n e A r t T M P r e c i s i o n g R N ASynthesis Kit 試劑盒的體系與方法進(jìn)行sgRNA 的轉(zhuǎn)錄模板合成（圖4A） 與體外sgRNA 轉(zhuǎn)錄（圖4B），轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)純化后電泳驗(yàn)證條帶完整性（長(zhǎng)度100 bp），電泳結(jié)果與預(yù)期一致。

將擴(kuò)增好的靶片段、sgRNA 按照一定比例與Cas9 混合，按照方法中的步驟進(jìn)行反應(yīng)得到切割產(chǎn)物，43058sg1 的理論切割產(chǎn)物長(zhǎng)度為525 和91 bp，43058sg2 的理論切割產(chǎn)物長(zhǎng)度為444 和172 bp，46447sg1 的理論切割產(chǎn)物長(zhǎng)度為498 和159 bp，46447sg2 的理論切割產(chǎn)物長(zhǎng)度為453 和204 bp。凝膠電泳分析表明43058sg2 與46447sg2 均達(dá)到了預(yù)期的切割效果，并且43058sg2 實(shí)現(xiàn)了接近完全的靶基因切割（圖5）?；叶确治霰砻?，46447sg2 的體外切割效率也達(dá)到了5 8 % （圖6 ），最終我們選擇43058sg2 和46447sg2 進(jìn)行載體構(gòu)建。

2.3 HP180_px330_GFP 載體構(gòu)建結(jié)果

HP180_px330_GFP 骨架上有預(yù)留的BpiI 雙酶切位點(diǎn)，其線性化后與退火形成具有黏性末端的雙鏈sgRNA，在連接酶作用下形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。其測(cè)序結(jié)果如圖7 所示，結(jié)果與設(shè)計(jì)的sgRNA 結(jié)果一致，表明載體構(gòu)建成功。

2.4 細(xì)胞性別鑒定及細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測(cè)

2.4.1 性別鑒定 對(duì)試驗(yàn)所用PEF 進(jìn)行SRY 鑒定，電泳結(jié)果顯示目的細(xì)胞為雄性（圖8）。

2.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將構(gòu)建的CRISPR/Cas9 載體通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)染導(dǎo)入雄性PEF 中。由于載體帶有增強(qiáng)綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescentprotein，EGFP） 表達(dá)單元，可通過觀察EGFP 的表達(dá)評(píng)估載體的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)已電轉(zhuǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后觀察熒光信號(hào)，確定已構(gòu)建好的載體成功電轉(zhuǎn)進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)果（圖9） 表明質(zhì)粒已成功表達(dá)。

2.5 FACS 分選陽性細(xì)胞及單克隆鑒定結(jié)果

通過FACS 分選EGFP 陽性細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與試驗(yàn)組GFP 信號(hào)存在顯著差異，其中對(duì)照組未檢測(cè)到GFP 信號(hào)，而陽性對(duì)照的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了71%，這與熒光觀察結(jié)果類似。通過培養(yǎng)EGFP 陽性細(xì)胞，獲得單細(xì)胞克隆團(tuán)。接著我們對(duì)單克隆細(xì)胞團(tuán)提取微量DNA，進(jìn)行相應(yīng)的SRY 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1/3 的細(xì)胞克隆未檢測(cè)到SRY 信號(hào)（圖10），顯示這些細(xì)胞的Y 染色體存在缺失的可能。

2.6 實(shí)時(shí)定量熒光PCR 檢測(cè)目的基因及SRY 基因

由于選用的目的基因在P E F 上并不表達(dá)mRNA，因此采用qPCR 檢測(cè)目的基因（內(nèi)參基因選擇β-actin） 和SRY 基因的DNA 含量。我們抽提EGFP 陽性細(xì)胞的基因組DNA，進(jìn)行qPCR 分析目的基因（43058 和46477） 和SRY 在DNA 水平的含量。qPCR 結(jié)果顯示在進(jìn)行靶基因敲除后，靶基因含量均顯著降低。其中靶基因43058 和46447 分別下降了約20% 和30%（P<0.05），對(duì)應(yīng)的SRY 也下降了7% 和11%。46447 敲除效果相對(duì)于43058 的基因敲除效果更為顯著，不僅靶基因敲除效率較高，SRY 基因DNA 水平也下降較多（圖11）。

2.7 核型分析結(jié)果

核型鑒定結(jié)果顯示上述流式分選得到的EGFP 陽性細(xì)胞存在染色體缺失現(xiàn)象，表明設(shè)計(jì)的sgRNA 在細(xì)胞水平上能夠?qū)崿F(xiàn)整個(gè)Y 染色體的刪除。在鑒定的12 個(gè)單細(xì)胞核型中，有1 個(gè)完全缺失Y 染色體（圖12）。

3 討論與結(jié)論

CRISPR/Cas9 近年來由于其基因編輯的靈活性和高效率而被廣泛應(yīng)用。其通過DSB 導(dǎo)致的非保守非同源末端連接修復(fù)途徑造成目的基因的敲除效果，但是該種途徑常常造成異常的插入缺失，甚至破壞染色體和基因組的完整性[24-26]。而以天然的（或定向的）DNA 模板的同源重組修復(fù)（Homologousrecombination repair，HDR） 途徑則可以對(duì)目的基因位點(diǎn)進(jìn)行精確修飾而產(chǎn)生意向的目的基因型[14， 27]，本研究利用CRISPR 系統(tǒng)的高效切割能力對(duì)Y 染色體上多個(gè)重復(fù)基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，通過產(chǎn)生多重DSB 損傷基因組和DNA 修復(fù)的穩(wěn)定性，引起Y 染色體降解。實(shí)現(xiàn)整條染色體刪除是建立在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)編輯的基礎(chǔ)上的，雖然早期的研究已經(jīng)證明能夠產(chǎn)生大片段的缺失，但這對(duì)于整條染色體的消融還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。2015年，Yang 等[ 2 8 ] 首先通過靶向內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)率病毒（PERVs） 的62 個(gè)重復(fù)位點(diǎn)在豬上實(shí)現(xiàn)了PERVs 的全基因組降解；隨后，研究人員進(jìn)一步利用CRISPR/Cas9 對(duì)靶點(diǎn)切割的多重性，成功在ES 細(xì)胞、體內(nèi)細(xì)胞和受精卵中刪除了Y 染色體，并對(duì)其他常染色體（7 號(hào)、14 號(hào)） 及X 染色體進(jìn)行了特異性消除[22-23]。

實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的關(guān)鍵是在Y 染色體上尋找能夠被sgRNA 特異識(shí)別的靶向序列，這些序列在其他常染色體或X 染色體上不能被識(shí)別，通過對(duì)其進(jìn)行多重切割從而實(shí)現(xiàn)整條染色體的消融。因此在選擇靶點(diǎn)時(shí)，單一數(shù)據(jù)庫的比對(duì)結(jié)果不能很好地反映個(gè)體染色體組的真實(shí)情況，最終選擇靶基因是在Ensembl比對(duì)的基礎(chǔ)上重新與NCBI、Sanger 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，選擇多個(gè)數(shù)據(jù)庫共有序列并與個(gè)體基因組序列結(jié)合，增加靶點(diǎn)的可靠性。

不同于一般的sgRNA 效率檢測(cè)采用T7E1 酶切和測(cè)序驗(yàn)證，由于本試驗(yàn)靶點(diǎn)為Y 上的多拷貝重復(fù)序列，這些片段在Y 上廣泛分布且保守性不強(qiáng)，可能會(huì)存在一些SNP 或者突變，導(dǎo)致擴(kuò)增未編輯前的靶基因產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)套峰現(xiàn)象，和編輯后的測(cè)序結(jié)果無法區(qū)分。因此在這里只能通過體外切割進(jìn)行sgRNA 的效率檢測(cè)。最終以ID 為ENSSSCG00000043058、ENSSSCG00000046447 的基因?yàn)榘悬c(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA，通過對(duì)Y 上不同靶點(diǎn)，即散在重復(fù)和簇狀聚集的靶基因的打靶，探索了不同打靶位點(diǎn)對(duì)編輯效率的影響，結(jié)果表明簇狀聚集的打靶效果要明顯優(yōu)于散在重復(fù)序列，這與Zuo 等[22] 和Adikusuma等[23] 的研究結(jié)果一致，其原因可能是長(zhǎng)臂偶然斷裂造成的染色體截?cái)嗷蛞孜粚?dǎo)致的。另外由于我們選擇的基因?yàn)榉堑鞍拙幋a基因，所以在定量分析時(shí)最終選擇以DNA 為模板。在檢測(cè)靶點(diǎn)DNA 含量變化的同時(shí)我們也對(duì)SRY 含量進(jìn)行了定量，結(jié)果均表明其表達(dá)量隨靶基因降低而降低，雖然這種變化并不明顯，但從側(cè)面說明了整條Y 染色體降解的可能性。核型分析的結(jié)果也表明部分單細(xì)胞克隆在染色體水平確實(shí)存在著Y 染色體的丟失，表明通過多位點(diǎn)斷裂造成整條染色體的缺失是可行的。

本研究通過尋找能夠特異性識(shí)別Y 染色體的多拷貝重復(fù)序列設(shè)計(jì)sgRNA，并通過體外切割、qPCR、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、核型分析等手段證明了該系統(tǒng)在體外體內(nèi)都有較高的切割效率，可成功實(shí)現(xiàn)整條染色體的消除，為未來染色體功能及動(dòng)物性別控制研究提供了新的方向。

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