頂空-氣相色譜法快速測定飲用酒類中甜蜜素含量

何 浩，吳海智，梁 軍，胡艷君，石鵬途

（1.湖南省產商品質量檢驗研究院，湖南 長沙 410007；2.廣電計量檢測（湖南）有限公司，湖南 長沙 410013）

甜蜜素又名環(huán)己基氨基磺酸鈉，是一種在食品工業(yè)中廣泛使用的水溶性甜味劑。根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[1]規(guī)定，甜蜜素在配制酒中最大使用量為0.65 g/kg，在其他酒類中不得使用。目前，檢測食品中甜蜜素含量的方法主要有液體進樣-氣相色譜法（gas chromatography，GC）[2-6]、頂空-氣相色譜法（headspacegas chromatography，HS-GC）[7]、液體進樣-氣質聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8-10]、頂空-氣質聯(lián)用法（headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS）[11]、液質聯(lián)用法（high performance liquidchromatography mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[12-14]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[15-17]、紫外-可見分光光度法（ultraviolet visible spectrophotometry，UV-VIS）[18-19]。GC法適用于除酒類外其他食品的檢測。因白酒中含有的環(huán)己醇會干擾甜蜜素的檢測，因此GC法不適用于白酒中甜蜜素的檢測[20]。HPLC-MS/MS適用于白酒、葡萄酒、黃酒和料酒的檢測，但液質聯(lián)用儀價格昂貴，使用和維護成本高，不利于方法的推廣[21]。HPLC法因為檢出限太高，僅適用于配制酒和其他食品的檢測，不適用于白酒、葡萄酒、黃酒和料酒的檢測[22]，UV-VIS法也僅適用于高含量甜蜜素樣品的檢測[23]。目前，有相關學者研究了頂空-氣相色譜法檢測普通食品中甜蜜素的方法[7，11]。但李雨翡等[11]的研究中頂空-氣相色譜法檢出限太高（3.62 mg/kg），不適合白酒等產品中甜蜜素含量的檢測。白酒中乙醇和其他小分子有機物含量很高，如果在樣品衍生前不去除，由于雜質峰和目標峰保留時間較接近，在氣相色譜測定甜蜜素衍生產物時會形成干擾。因此，在衍生前應將大部分有機物雜質去除掉。江豐等[24]的研究表明，頂空-氣相色譜法檢出限能達到要求，但該研究的相關系數(shù)較低，定量檢測不夠準確?，F(xiàn)行國家標準檢測白酒中甜蜜素的定量限為0.1 mg/kg[2]。目前，國內外暫未見頂空-氣相色譜法檢測各種飲用酒類中甜蜜素的方法，也未有適合各類飲用酒類檢測的方法。因此，建立一種適合各種飲用酒類中甜蜜素檢測的方法十分必要。本研究擬采用頂空-氣相色譜法對各種飲用酒類進行檢測，通過優(yōu)化前處理條件和儀器參數(shù)等方式，期望方法檢出限、線性范圍等多項指標均能達到或優(yōu)于現(xiàn)行國家標準[2]，且期望本實驗的方法比國家標準[2]更加高效、準確、快捷，降低檢測成本，為食品安全監(jiān)管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒（42%vol）：湖南某酒業(yè)有限公司；黃酒（12.0%vol）：潮州某釀造有限公司；干紅葡萄酒（13%vol）：某酒業(yè)有限公司；威士忌（40%vol）：青島某酒業(yè)有限公司；藥酒（42%vol）：家庭自制；甜蜜素標準物質（純度98.9%）：美國Sigma-Aldrich公司；亞硝酸鈉、硫酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HS-20頂空進樣器+GC-2030氣相色譜儀（配備火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID））：日本島津公司；ElixEssential5+Milli-Q超純水儀：法國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制和標準曲線的制作

準確稱取經純度折算后的甜蜜素標準品100 mg（以環(huán)己基氨基磺酸計），用水溶解并定容至10.0 mL，配制成質量濃度為10.0 mg/mL的標準儲備液。用水作為溶劑，每次稀釋10倍，逐級稀釋至1 μg/mL。在5個22 mL頂空瓶中各加入10.0 mL水，分別加入0.01 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL質量濃度為100 μg/mL的甜蜜素標準物質，再加入1.0 mL質量濃度為100 g/L的硫酸溶液，最后加入1.0 mL質量濃度為100 g/L的亞硝酸鈉溶液，迅速封好頂空瓶蓋，待檢測。

1.3.2 樣品前處理條件優(yōu)化

分別考察超聲（40 ℃，45 kHz、30 min）、振蕩（室溫，120 r/min、30 min）、加熱煮沸（準確稱量25.0 g酒類樣品至100 mL燒杯中，加入3顆玻璃珠，在放有石英棉的電熱爐上緩慢加熱至沸騰，保持沸騰至燒杯中液體還剩5 mL左右，停止加熱，自然冷卻，將燒杯中樣品處理液轉移至250 mL容量瓶中，用水定容）3種前處理方式對酒中甜蜜素檢測的影響。用移液槍準確移取10.0 mL待測溶液至22 mL頂空瓶中，加入1.0 mL質量濃度為100 g/L的硫酸溶液，再加入1.0 mL質量濃度為100 g/L的亞硝酸鈉溶液，迅速封好頂空瓶蓋，待檢測。

1.3.3 儀器條件

（1）頂空條件

考察頂空溫度在20～80 ℃條件下色譜圖的峰面積變化情況。樣品流路溫度95.0 ℃；傳輸線溫度150.0 ℃。

（2）色譜條件

安捷倫DB-1MS UI色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣（氮氣）、燃燒氣（氫氣）、助燃氣（空氣）均為鋼瓶集中供氣（純度＞99.999%）；分流進樣，分流比20∶1；色譜柱流量：2.00 mL/min；升溫程序：80 ℃保持1 min；以40 ℃/min升溫至100 ℃，保持2 min；以40 ℃/min升溫至240 ℃，保持2 min；色譜分析時間共9.0 min。FID檢測器溫度300.0 ℃，氫氣流量32.0 mL/min，空氣流速200.0 mL/min，尾吹氣流量24.0 mL/min。

1.3.4 定性定量方法

根據(jù)何浩等[7]的研究，頂空氣相-色譜檢測食品中的甜蜜素，目標產物為一系列衍生產物，但主要產物是環(huán)己烯，且環(huán)己烯的峰面積與樣品中甜蜜素的含量成正比，因此用頂空-氣相色譜-質譜對甜蜜素衍生產物進行全掃描，選取目標產物。根據(jù)保留時間進行定性，外標法定量。

1.3.5 線性范圍、檢出限、定量限

以標準物質的含量（X）為橫坐標，以待測目標物的峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線。如果樣品中甜蜜素含量很高，可用水稀釋10倍后再進行檢測。在空白基質中添加甜蜜素標準物質，以3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）確定定量限。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

實驗結果表明，當反應在冰浴條件下進行時，生成的物質主要是環(huán)己基亞硝酸酯和環(huán)己醇[2]；當反應溫度在50 ℃時，生成的目標物質主要是環(huán)己烯[7]。50 ℃反應時，反應時間僅需30.0 min，且副產物較少[7]。

對白酒、黃酒、葡萄酒、威士忌、藥酒分別進行樣品和加標的測定，結果表明，藥酒的基質最復雜。甜蜜素標準物質和藥酒加標的氣相色譜圖見圖1。由圖1可知，目標物質環(huán)己烯色譜峰附近沒有雜質峰，表明通過煮沸可將揮發(fā)性干擾物質去除。通過超聲或振蕩前處理后的樣品溶液經頂空-氣相色譜分析時，樣品溶液還存在乙醇和各種揮發(fā)性物質，干擾目標物質的測定。而本實驗采用加熱煮沸的前處理方式能去掉絕大部分乙醇和揮發(fā)性物質，防止假陽性峰的出現(xiàn)。結果表明，25.0 mL待測樣品加熱濃縮至5 mL左右時，干擾物質大部分能夠去除，且對定量結果不造成影響。濃縮體積更小或者至近干，加標回收率會顯著降低。

圖1 甜蜜素標準物質衍生物（A）及藥酒加標后衍生物（B）氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of derivatives of sodium cyclamate standard substance (A) and derivatives of medicinal liquor after standard addition (B)

2.2 儀器條件

甜蜜素在酸性條件下與亞硝酸鹽冰浴衍生，生成的目標物質是環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇[2]。在常溫條件下，生成的是環(huán)己烯等一系列衍生產物[3]。頂空溫度在20～80 ℃條件下目標物質峰面積變化情況見圖2。由圖2可知，頂空溫度越高，目標物質的峰面積越大，但是，隨著頂空溫度的升高，衍生產生的副產物越來越多且峰面積越來越大。因此，本實驗選用50 ℃作為頂空溫度。

圖2 甜蜜素衍生物峰面積隨頂空溫度變化曲線Fig.2 Variation of peak area of sodium cyclamate derivatives with headspace temperature

2.3 方法的線性范圍、檢出限及定量限

在0.1～10 μg/mL（對應樣品中甜蜜素含量為1～100 mg/kg）范圍內，線性方程為Y=5 457.9X-730，線性關系良好，R2為0.998 9，以3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限為0.1 mg/kg，以10倍信噪比（S/N=10）確定定量限為0.3 mg/kg，檢出限和定量限與GB 5009.97—2016《食品安全國家標準食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》[2]第三法液相色譜-質譜/質譜法相當，明顯優(yōu)于GB 5009.97—2016《食品安全國家標準食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》[2]第一法氣相色譜法和第二法液相色譜法。本實驗方法用到的儀器頂空-氣相色譜儀價格明顯低于液相色譜串聯(lián)質譜儀，且本實驗前處理步驟更加簡單快捷，各項參數(shù)均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》[25]要求。

2.4 方法的準確度

在不含甜蜜素的白酒、黃酒、葡萄酒、威士忌、藥酒中進行3水平標準添加回收試驗，添加水平分別為1.0 mg/kg、25.0 mg/kg、100.0 mg/kg，每個水平重復測定6次，通過加標回收率考察該方法的準確度。不同酒樣中甜蜜素平均回收率及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）見表1。由表1可知，在以上5種不同樣品基質中，做6次平行的加標回收率試驗，甜蜜素的平均回收率在94.3%～107.1%，相對標準偏差（RSD）在2.5%～7.1%，均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》[25]要求。

表1 不同飲用酒樣中甜蜜素的平均加標回收率及準確度（n=6）Table 1 Average standard recovery rate and accuracy degree of sodium cyclamate in different alcoholic drinks samples(n=6)

2.5 方法的精密度

選取白酒、黃酒、葡萄酒和藥酒甜蜜素陽性樣品各一個，每個樣品分別測定6次，考察方法的精密度，結果見表2。由表2可知，精密度試驗結果的RSD為3.1%～4.9%，其結果符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》[25]要求。結果表明，本試驗測定結果穩(wěn)定、精密度良好，能滿足酒中甜蜜素含量的檢測要求。

表2 不同飲用酒樣中甜蜜素含量測定的精密度試驗結果Table 2 Precision tests results of cyclamate detection in different alcoholic drinks samples

2.6 實際樣品的測定

運用該方法對市售蒸餾酒、發(fā)酵酒、配制酒每個類別各取10個樣品檢測。由檢驗結果可知，待測的30個酒類樣品中，蒸餾酒、發(fā)酵酒均未檢出甜蜜素，1批次配制酒中檢出了甜蜜素，含量為0.32 mg/kg，在國家標準GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[1]允許的范圍內。

3 結論

本實驗建立了頂空-氣相色譜法快速測定酒類食品中甜蜜素的分析方法。樣品經加熱煮沸除雜、稀釋定容、添加衍生試劑后衍生，衍生產物上機分析。甜蜜素在酒中對應含量為1～100 mg/kg時線性關系良好（R2=0.998 9），檢出限和定量限分別為0.1 mg/kg和0.3 mg/kg，在低、中、高三個水平的回收率分別為94.3%～107.1%，相對標準偏差（RSD）為2.5%～7.1%（n=6），精密度試驗結果RSD為3.1%～4.9%。該實驗與已有的研究相比，簡化了前處理步驟，檢出限和標準曲線相關系數(shù)明顯優(yōu)于已有的研究。本實驗通過頂空-氣相色譜-質譜法對反應產物進行了驗證。實驗簡單快捷，在前處理過程中未用到有機試劑，方法靈敏度、準確度、精密度均能滿足檢測要求，適合于飲用酒類中甜蜜素的大批量快速檢測。