LncRNA H19通過調節(jié)miR-let7/MMP-9分子軸促進滋養(yǎng)細胞侵襲及遷移*

劉明嫦,劉師玚,馬 敬**

(1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，昆明 650031；2.云南省婦幼保健院，昆明 650051)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders of pregnancy,HDP)是以血壓升高(收縮壓≥140mmHg，舒張壓≥90mmHg)，不出現(xiàn)(妊娠期高血壓)或出現(xiàn)(子癇前期)蛋白尿(大于0.3g/24h)為特征的一組妊娠期特發(fā)的臨床綜合征。HDP可繼發(fā)母親高血壓腦病、腦出血、心力衰竭、腎功能衰竭、多器官功能衰竭，導致胎兒宮內發(fā)育遲緩、胎兒臍血流異常、慢性胎兒宮內窘迫，是醫(yī)源性早產的主要原因。HDP治療極為棘手，發(fā)病機制復雜，目前病因尚未完全闡明。既往研究認為,在母胎循環(huán)建立的過程中，絨毛外滋養(yǎng)細胞侵襲能力受損，造成“胎盤淺著床”和子宮螺旋動脈重塑障礙，是HDP發(fā)病的一個重要的原因[1]。深入研究絨毛外滋養(yǎng)細胞侵襲能力，可為臨床早期發(fā)現(xiàn)、治療HDP提供理論依據(jù)。

人類H19基因的轉錄產物是一種lncRNA，在人早期胎盤組織中豐富表達，生后常消失。LncRNA H19作為分子海綿吸附并抑制miRNA與靶基因的結合，促進腫瘤細胞的侵襲[2]。胎盤的種植過程類似于腫瘤的侵襲過程，胎盤中l(wèi)ncRNAs差異性表達與子癇前期(preeclampsia,PE)發(fā)病有關。但lncRNA H19在HDP中的表達情況存有爭議。既往研究報道，HDP胎盤組織中H19表達水平明顯低于正常胎盤[3]。最近有報道，PE孕婦妊娠早期血液中H19表達水平顯著上調[4]。本研究旨在明確H19在HDP胎盤中的表達情況，并進一步探討H19參與HDP發(fā)病的具體機制。

miRNA能與mRNA的3'非翻譯區(qū)結合，通過調節(jié)mRNA穩(wěn)定性和抑制翻譯控制基因表達，進而參與腫瘤的發(fā)生[7]。目前關于miR-let7e-5p在HDP發(fā)病中具體作用機制的研究較少。PE孕婦的miR-let7表達水平發(fā)生了改變，但不同亞型報道的結果不一致。研究發(fā)現(xiàn)，miR-let7a及miR-let7g在重度子癇前期(severe pre-eclampsia,sPE)中明顯升高[5]。李曉娟等[6]發(fā)現(xiàn)，miR-let7b-5p及miR-let7e-5p在sPE胎盤中表達減少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，H19基因內包含有miR-let7的多個結合位點[7]，預測H19可能通過吸附miR-let7調控下游靶基因，進而參與HDP的發(fā)病。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)在腫瘤侵襲轉移中起作用，參與滋養(yǎng)細胞侵入子宮蛻膜和肌層及子宮螺旋動脈的重塑過程[8]。MMP-9表達水平與滋養(yǎng)細胞侵襲力和血管重鑄水平正相關，HDP中MMP-9表達下調[9]。在脂肪來源的干細胞中，MMP-9是受miR-let7e調控的下游靶基因[10]。目前尚不清楚miR-let7是否通過調控MMP-9表達進而參與HDP的發(fā)病。

本研究通過檢測HDP胎盤組織中l(wèi)ncRNA H19、miR-let7、MMP-9 mRNA、MMP-9蛋白表達，并根據(jù)臨床標本檢測結果進行體外細胞實驗，探索HDP發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 臨床標本及細胞 收集2019年12月至2021年3月在昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院分娩的HDP孕婦86例和正常孕婦20例。86例HDP孕婦中，妊娠期高血壓26例(PIH組)，子癇前期29例(PE組)，重度子癇前期31例(sPE組)，其中早發(fā)型8例、晚發(fā)型23例。分娩時收集胎盤組織，剪成約1cm×1cm×1cm大兩塊，一塊置-80℃冰箱凍存?zhèn)錂z，另一塊放入10%福爾馬林溶液固定24h后石蠟包埋。HTR8/Svneo細胞株購自武漢普諾賽，傳代并保存于昆明醫(yī)科大學科研實驗中心。本研究經醫(yī)院倫理委員會同意，孕產婦均簽署知情同意書。根據(jù)臨床標本實驗結果，從miR-let7b-5p和miR-let7e-5p兩者中，篩選出與疾病發(fā)展相關且與lncRNA H19負相關性更強的miRNA，進行后續(xù)研究探索其作用機制。

1.2 主要試劑 1640培養(yǎng)基(gibco 126 31200-022，美國)、10% 胎牛血清(FBS)(gibco 10099-141,America)和青霉素-鏈霉素(100U/mL,1∶1)(gibco 1902417,America)混合物培養(yǎng)人滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo。細胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H19過表達質粒(pexH19)、空質粒購自漢恒生物，siH19和siCon購自銳博公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞轉染 將HTR/SVneo細胞分組：對照組(NC組)，轉染空質粒組(NC+empty質粒)，轉染siH19敲低H19組(siH19組)，用過表達H19質粒轉染過表達H19組(NC+pEX-H19組)，用miR-let7e-5p模擬物和含H19的質粒轉染滋養(yǎng)細胞(pEX-H19+let-7e組)。siRNA和miRNA轉染按riboFECTTMCP轉染試劑盒說明書進行。轉染質粒DNA按lipofectamineTM3000試劑盒(質粒濃度2500ng/孔)說明書進行。轉染后48h，收集細胞用于進一步實驗。

1.3.2 細胞活性測定 使用細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8，同仁化學，日本)測定。將HTR-8/SVneo細胞接種到96孔板(1500細胞/孔)，在1640培養(yǎng)基置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。HTR-8/SVneo細胞轉染48h，將CCK-8試劑(10μL/孔)加入細胞，置37℃和5%CO2培養(yǎng)箱孵育2h。使用酶標儀檢測450nm處吸光度。

1.3.3 細胞劃痕試驗 將細胞濃度調整為2.5×104/mL，并接種到Ibidi插件的左右孔中。培養(yǎng)細胞，直至細胞達到95%融合，用PBS液洗滌細胞，拔除Ibidi插件后0、24h在倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度并拍照。

1.3.4 Transwell試驗 用24孔板進行。每個孔板使用Matrige基質膠(50μL/孔，corning，356234，美國)包被。轉染48h后，將細胞接種到24孔板。將1×105細胞/mL細胞懸液100μL加入上室，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。將10%FBS培養(yǎng)基500μL加入下室，孵育24h。去除膜上表面的非侵入細胞和基質膠。膜下表面用4%多聚甲醛固定細胞30min，用結晶紫染色15min。使用100倍顯微鏡拍照，使用Image J軟件進行細胞計數(shù)。

1.3.5 逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 通過Trizol試劑(Lifetech，美國)從胎盤組織或滋養(yǎng)層細胞中提取RNA。使用FastKing RT(With gDNase) FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(天根，中國)將mRNA逆轉錄為cDNA。使用RiboTMmRNA /lncRNA qPCR Starter Kit(銳博,中國)檢測lncRNA H19。使用Bulge-Loop miRNA RT-qPCR試劑盒檢測miR-let7b-5p和miR-let7e-5p，使用Starter Kit Bulge-Loop miRNA RT-qPCR Starter Kit(銳博,中國)進行逆轉錄。實驗方法按試劑盒說明書進行。H19和let7引物購自銳博(中國廣州)。MMP-9 mRNA和GAPDH引物由Beacon Designer 7.90設計，由Invitrogen(中國廣州)合成。RT-qPCR使用SYBR Green master的Cycle 96實時PCR系統(tǒng)(LightCycle，瑞士)完成。lncRNA和mRNA的定量通過使用GAPDH作為內參；miRNA的定量由U6作為內參。采用相對定量方法(2-△△ct)分析數(shù)據(jù)。

1.3.6 免疫組化(包含IHC)檢測 人胎盤組織固定，包埋，切成4μm切片，脫水，用中性樹膠封閉。經脫蠟、復水、檸檬酸緩沖液浸泡，微波10min修復抗原。3%過氧化氫孵育30min，5%山羊血清25℃封閉1h，用抗MMP-9(abcam)抗體孵育過夜。山羊抗兔二抗與切片25℃孵育1h。用PBST洗滌，DAB溶液處理。用顯微鏡觀察和成像人胎盤中MMP-9蛋白表達。使用Image J用于測量圖像的灰度。

2 結 果

2.1 臨床特征 進行年齡、分娩前體質量指數(shù)(body mass index,BMI)匹配后，PIH組、PE組、sPE組的收縮壓、舒張壓均高于正常妊娠組(P<0.001)；早發(fā)型、晚發(fā)型sPE組的新生兒出生體重均顯著低于正常組(P<0.001，P<0.05)；早發(fā)型、晚發(fā)型sPE組的分娩孕周顯著低于正常妊娠組(P<0.001，P<0.05)。見表1。

表1 各組患者臨床特征

2.2 免疫組化檢測HDP患者胎盤組織中MMP-9蛋白表達 免疫組化結果顯示，MMP-9蛋白在合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜、細胞外基質中表達；MMP-9蛋白在中性粒細胞膜上表達；PIH、PE、sPE胎盤中滋養(yǎng)細胞數(shù)減少，MMP-9陽性細胞少，壞死增多，出現(xiàn)較多中性粒細胞。PIH胎盤組織中MMP-9蛋白表達明顯低于正常組，且PE及sPE組均顯著低于PIH組。見圖1、2。

圖1 PIH、PE和sPE患者胎盤組織中MMP-9蛋白表達比較

圖2 免疫組化法檢測MMP-9蛋白在PIH、PE和sPE胎盤中的表達(×400)

2.3 RT-qPCR檢測HDP胎盤中l(wèi)ncRNA H19、miR-let7、MMP-9表達 與正常妊娠組比較，HDP患者中l(wèi)ncRNA H19表達水平顯著升高，miR-let7b-5p、miR-let7e-5p水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與正常妊娠組比較，PIH和sPE組胎盤組織中MMP-9 mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。早發(fā)型和晚發(fā)型sPE患者的lncRNA H19、miR-let7e-5p表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，早發(fā)型sPE中miR-let7b-5p、MMP-9表達低于晚發(fā)型sPE，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Pearson相關性顯示，lncRNA H19與miR-let7e-5p、MMP-9 mRNA均呈負相關(r=-0.54,P<0.01；r=-0.229,P<0.05)，見圖3。

圖3 胎盤組織中l(wèi)ncRNAH19、miR-let7b-5p、miR-let7e-5p和MMP-9 mRNA表達

2.4 lncRNA H19對滋養(yǎng)細胞侵襲力、遷移力及細胞活力的影響 在HTR/SVneo細胞中，過表達H19后，滋養(yǎng)細胞的穿膜細胞數(shù)、滋養(yǎng)細胞遷移率及細胞活力均增強；敲減H19后，滋養(yǎng)細胞的穿膜細胞數(shù)、滋養(yǎng)細胞遷移率及細胞活力均減弱。表明lncRNA H19促進了滋養(yǎng)細胞的侵襲力、遷移力及細胞活力。過表達H19與miR-let7e-5p mimics共轉染后，lncRNA H19對滋養(yǎng)細胞的侵襲力、遷移力及細胞活力的促進作用被逆轉，表明人滋養(yǎng)細胞中l(wèi)ncRNA H19抑制miR-let7e-5p表達、上調MMP-9表達，進而促進滋養(yǎng)細胞的侵襲力、遷移力并增強細胞活力。見圖4。

圖4 細胞的侵襲力、細胞活力及遷移力

2.5 HTR/SVneo細胞中H19、miR-let7b-5p、miR-let7e-5p、MMP-9 mRNA表達 在HTR/SVneo細胞中過表達H19后，miR-let7e-5p表達下降，lncRNA H19及MMP-9 mRNA表達增加；敲減H19后，miR-let7e-5p表達增加，lncRNA H19及MMP-9 mRNA表達減少。表明lncRNA H19抑制miR-let7e-5p表達，促進MMP-9表達。過表達H19與miR-let7e-5p mimics共轉染后，lncRNA H19表達量高于pEX-H19組，MMP-9 mRNA表達低于pEX-H19組。表明miR-let7e-5p增加反向促進了H19表達增加，LncRNA H19與miR-let7e-5p之間為內源性競爭性RNA；lncRNA H19對MMP-9 mRNA的促進作用受miR-let7e-5p影響，miR-let7e-5p可能抑制MMP-9 mRNA表達。見圖5。

圖5 滋養(yǎng)細胞中H19、miR-let7e-5p、MMP-9 mRNA表達

3 討 論

PIH及PE與胎盤滋養(yǎng)細胞植入異常有關[11]，在人類胎盤形成早期，H19呈雙等位基因表達；10周后，H19僅在母系表達，父系沉默[12]。目前關于lncRNA H19參與HDP發(fā)病的機制還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，PIH及PE胎盤組織中l(wèi)ncRNAH19均表達升高，lncRNA H19具有促進滋養(yǎng)細胞的侵襲力、遷移力和細胞活力的作用，表明lncRNA H19表達可能通過影響滋養(yǎng)細胞的功能參與HDP發(fā)病。

既往研究發(fā)現(xiàn),H19基因上存在多個miR-let7的靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，PIH、PE、sPE胎盤組織中miR-let7b-5p及miR-let7e-5p均表達降低,尤以早發(fā)型sPE胎盤中miR-let7b-5p表達最低，miR-let7e具有抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲力、遷移力和細胞活力的作用，提示miR-let7差異性表達可能與HDP發(fā)病相關,并且與疾病的嚴重程度有關。

MMP-9是溶解細胞外基質的蛋白酶，是滋養(yǎng)層侵襲能力的代表分子[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在PIH及sPE胎盤中，MMP-9 mRNA均表達下降，尤以早發(fā)型sPE胎盤中下降最顯著。此外，MMP-9蛋白在PIH、PE及sPE胎盤組織中表達下降。值得注意的是，PE胎盤中MMP-9 mRNA表達與正常組無明顯差異，但MMP-9蛋白表達明顯下降，表明MMP-9 mRNA可能在轉錄后水平受到損傷。滋養(yǎng)細胞中MMP-9表達受到lncRNA H19的促進，進而增強滋養(yǎng)細胞的侵襲、遷移和細胞活力；miR-let7e-5p抑制MMP-9表達，提示MMP-9 mRNA可能是miR-let7e-5p的下游靶基因。綜上，滋養(yǎng)細胞中MMP-9表達可能在轉錄或轉錄后水平被破壞，并參與PIH及PE的發(fā)病，且因病情程度不同呈動態(tài)變化。

絨毛外滋養(yǎng)細胞侵襲能力差導致螺旋動脈重構不足，從而導致PE。H19促進了絨毛外滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo的侵襲、遷移和細胞活力，但結果顯示lncRNA H19在HDP胎盤中表達上調。HTR-8/SVneo是一種來源于早孕期人類滋養(yǎng)細胞的細胞系。本實驗通過敲減H19導致HTR-8/SVneo細胞侵襲能力下降，模擬了PIH及PE胎盤早期變化。結果顯示，MMP-9 mRNA表達下調，滋養(yǎng)層侵襲能力減弱。但孕晚期胎盤中H19與MMP-9 mRNA表達呈輕度負相關，提示存在人體負反饋調節(jié)作用，即低水平MMP-9 mRNA可能重新激活H19表達。因而在PE胎盤中，lncRNA H19的上調促進了MMP-9 mRNA的表達，使其與正常組的表達無明顯差異。但在sPE胎盤中，尤其是早發(fā)型sPE，胎盤代償能力嚴重下降甚至消失，MMP-9 mRNA降至最低水平。本研究發(fā)現(xiàn)，H19在HDP中上調可能是HDP胎盤代償?shù)谋憩F(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，H19與let-7e共表達時，miR-let7e-5p對lncRNA H19存在一定的正反饋作用。可能是因miR-let7e-5p具有抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲力、遷移力及細胞活力的作用，轉染miR-let7e-5p進入滋養(yǎng)細胞后，細胞發(fā)生“自救”，上調lncRNA H19表達，以對抗miR-let7e-5p對細胞的“損傷”，但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，在胎盤形成早期，滋養(yǎng)細胞H19表達下調，MMP-9表達下調，侵襲力下降，胎盤淺著床，導致HDP發(fā)病。疾病進展過程中，低水平MMP-9負反饋激活lncRNA H19表達，通過抑制miR-let7，進而促進MMP-9表達，影響滋養(yǎng)細胞的侵襲力、遷移力及細胞活力，從而影響HDP病程進展。本研究將為探索HDP的早期預測、早期診斷和治療提供理論依據(jù)。