淺析β防御素的免疫功能及作用機(jī)制

蘇 慶，黃凱悅

（1.重慶市合川區(qū)渭沱鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶 401557；2.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460）

防御素是一種具有廣譜、高效、特殊免疫作用的抗菌肽，按照二硫鍵的位置差異，可將其分為三個(gè)不同的亞家族：α、β、θ。其中β防御素含有3對(duì)二硫鍵，其在分子鏈上的位置連接為Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6。β防御素不僅僅在皮膚、呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位中存在，其在結(jié)膜、胎盤(pán)、淋巴器官、骨髓、中性粒細(xì)胞、異嗜性白細(xì)胞等其他生物構(gòu)成中也發(fā)揮著宿主防御作用（見(jiàn)表1）。有關(guān)報(bào)道證明，β防御素不僅對(duì)念珠菌、白色念珠菌、肺炎克雷伯菌、痤瘡丙酸桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等具有較好的抗菌效果，同時(shí)在抗偽狂犬病病毒、單純皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒方面表現(xiàn)出強(qiáng)大能力，且對(duì)膀胱癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞也有抑制作用（見(jiàn)表2）?？偟膩?lái)說(shuō)，β防御素作為生物機(jī)體免疫功能發(fā)揮的重要蛋白肽，其抗菌、抗病毒、抗腫瘤功能及先天免疫效能在科學(xué)研究及生產(chǎn)利用上都占有極其重要的地位。

表1 防御素分布部位及生物活性

表2 β-防御素對(duì)細(xì)菌、真菌和腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理

防御素家族系列成員均為帶有陽(yáng)離子的多肽物質(zhì)，具有獨(dú)特的特征性片狀結(jié)構(gòu)。由六個(gè)半胱氨酸殘基依靠分子內(nèi)部的三個(gè)二硫鍵相互連接組成，殘基之間的鍵合模式為C1–C5，C2–C4，C3–C6。此系列抗微生物肽均由三條反向平行鏈構(gòu)成，各條平行鏈以“反式”排列的形態(tài)與二硫鍵相互連接，并以此維持肽鏈的結(jié)構(gòu)性穩(wěn)定。通過(guò)各種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肽鏈間二硫鍵對(duì)防御素發(fā)揮抗微生物活性的作用并不大，但若將其去除則會(huì)引起非結(jié)構(gòu)化肽水解，導(dǎo)致防御素的穩(wěn)定性降低。β防御素及其獨(dú)特的一個(gè)特征是可以通過(guò)折疊產(chǎn)生如α螺旋、β結(jié)構(gòu)、延伸、轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)以及其他排列方式。天然存在的防御素具有不穩(wěn)定且半衰期較短的不利特性，但若是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾則能夠彌補(bǔ)該缺點(diǎn)，且修飾后的防御素在高溫條件下仍能保持性質(zhì)穩(wěn)定，并保持抗菌等生物活性不受影響，為生產(chǎn)利用提供可能。

通常防御素在生物體內(nèi)的合成與釋放可以由細(xì)胞因子、發(fā)育信號(hào)、微生物信號(hào)及部分神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)以組織特異性的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)。β防御素完成合成的位置一般在生物體的上皮細(xì)胞內(nèi)。絕大多數(shù)β防御素均有兩個(gè)外顯子基因，一個(gè)主要作用是編碼前原肽（含較多疏水性亮氨酸的信號(hào)序列），另一個(gè)主要作用是為成熟肽編碼。在生物體內(nèi)防御素含有的兩個(gè)外顯子基因轉(zhuǎn)錄為各自對(duì)應(yīng)的mRNA時(shí)，一個(gè)外顯子形成5′UTR區(qū)及含有編碼信號(hào)肽的mRNA片段，另一個(gè)外顯子則形成3′UTR區(qū)及含有為成熟肽編碼的mRNA片段，該成熟肽是由對(duì)前體片段進(jìn)行分割產(chǎn)生。β防御素最早是從牛中性粒細(xì)胞以及上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，之后陸續(xù)在各個(gè)種類的脊椎動(dòng)物體內(nèi)均有分離得到。成年動(dòng)物身體內(nèi)的中性粒細(xì)胞主要由骨髓生產(chǎn)，骨髓中β防御素的mRNA合成方式大體與中性粒細(xì)胞內(nèi)α防御素的基因轉(zhuǎn)錄模式類似，合成后的β防御素主要存儲(chǔ)在已經(jīng)與吞噬泡發(fā)生融合的中性粒細(xì)胞致密顆粒當(dāng)中。在牛中性粒細(xì)胞致密顆粒中儲(chǔ)存的主要有BNBD-4、BNBD-12以及BNBD-13三種典型β防御素，上述三種β-防御素的mRNA含量最多的部位為骨髓，在骨髓生成的早期完成BNBD-4的合成，但是BNBD-12則只存在于新產(chǎn)生的致密顆粒當(dāng)中，伴隨著組織蛋白酶前體同時(shí)分泌。β防御素初級(jí)翻譯產(chǎn)物能夠迅速轉(zhuǎn)化為成熟的β防御素，其前體在生物體內(nèi)的半衰期十分短。中性粒細(xì)胞在骨髓中成熟的同時(shí)停止顆粒合成，然后匯聚形成顆粒庫(kù)，初級(jí)顆粒與吞噬泡發(fā)生融合釋放防御素，并在吞噬泡中蓄積較高濃度的防御素，從而在吞噬泡被釋放到外周血液循環(huán)之中時(shí)已經(jīng)完成β防御素的合成。

另外依照β防御素在細(xì)胞膜上配體的不同，其免疫作用可通過(guò)激活許多不同的信號(hào)通路而發(fā)揮。重組鼠BD123可以抑制Mapk通路（LPS介導(dǎo)）中P38蛋白的磷酸化，從而降低TNF-a因子的分泌。重組豬BD3則能夠?qū)RK1、2蛋白的磷酸化產(chǎn)生誘導(dǎo)，繼而促進(jìn)母豬卵巢的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生增殖并進(jìn)行遷移。同時(shí)據(jù)試驗(yàn)反饋，細(xì)胞膜具有的KV3.1通道和人類的BD2結(jié)合，可對(duì)鉀離子通道的活性產(chǎn)生抑制作用，從而下調(diào)外周單核細(xì)胞IL-2以及Jur-kat細(xì)胞的表達(dá)；另外人類的BD2與Thp-1細(xì)胞膜具有的CCR2受體相互連接還可以激活NOD2信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)Ifn-β產(chǎn)生表達(dá)。人類的 BD3可以和細(xì)胞內(nèi)膜具有的磷酸肌醇4，5二磷酸鹽產(chǎn)生互動(dòng)，從而激活P13k-Akt-Nf-kb信號(hào)通路，使TNF以及IL-6產(chǎn)生表達(dá)。人類的BD3同樣可以和CCR6受體相互作用以激活Smad3、Caspases1、Caspases4、NF-kB和MAPKs等不同的信號(hào)通路，從而對(duì)皮膚角質(zhì)細(xì)胞具有的IL-37表達(dá)產(chǎn)生增長(zhǎng)作用。人β防御素2、3可以加強(qiáng)吸收細(xì)胞內(nèi)的Cpg-DNA，以增加樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)IL-6、IFN-a 等多種因子的合成總量。同時(shí)人β防御素2、3還可通過(guò)C-FOS及EGR蛋白含量的下調(diào)來(lái)抑制巨噬細(xì)胞自噬功能，以加大對(duì)細(xì)菌的清除效率。人β防御素2、3、4即可以誘導(dǎo)Mapk通路ERk1、2蛋白以及P38蛋白的磷酸化來(lái)促進(jìn)IL-18細(xì)胞因子的分泌；又可以通過(guò)誘導(dǎo)STAT1、STAT3以及EGFR的磷酸化，來(lái)增加單核細(xì)胞趨化蛋白I、IL-6、IL-10的表達(dá)。

CpG ODN刺激可以促進(jìn)A549細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK含量的增加，活化p38 MAPK途徑，從而誘導(dǎo)hBD-2的表達(dá)。肺炎克雷伯菌毒力因子夾膜多糖可誘導(dǎo)生物體肺部的上皮細(xì)胞分泌hBD-3，而且實(shí)驗(yàn)證明hBD-3的分泌對(duì)多糖濃度劑量具有極大的依賴性。在肺炎克雷伯菌CPS的刺激下，肺部上皮細(xì)胞分泌的hBD-3量可以比普通狀態(tài)增長(zhǎng)20倍左右，肺炎克雷伯菌CPS可以極大增加hBD-3的生成。mPGES-1是生物機(jī)體內(nèi)PGES的一種，而PGES則是PGE2合成過(guò)程中的末端限速酶，其可以限制或催化PGH2轉(zhuǎn)化產(chǎn)生PGE2。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBD-2的表達(dá)與PGE2的分泌顯著相關(guān)；在胎膜早破患者中胎膜組織hBD3、TLR2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于正常健康產(chǎn)婦胎膜組織，且二者呈強(qiáng)烈正相關(guān)性，結(jié)合該研究結(jié)果，推測(cè)hBD3與TLR2蛋白可能存在某種關(guān)聯(lián)。雌激素可以促進(jìn)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞大量增殖，同時(shí)可以誘導(dǎo)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞分泌SBD1，有試驗(yàn)證明雌激素最佳的添加劑量為10-8M，而SBD1表達(dá)最高量的出現(xiàn)時(shí)間節(jié)點(diǎn)在添加后的3.5h。17-β雌二醇誘導(dǎo)SBD1表達(dá)的過(guò)程需要PKA、PKC以及NF-KB三條信號(hào)通路的同時(shí)與，并且在前期需要通過(guò)由GPR30所介導(dǎo)的非基因組途徑實(shí)現(xiàn)，后期過(guò)程則需要通過(guò)雌激素受體所介導(dǎo)的基因組途徑實(shí)現(xiàn)。17-β雌二醇誘導(dǎo)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞SBD1基因表達(dá)（經(jīng)NF-KB信號(hào)通路）的作用機(jī)制如下：處于靜息狀態(tài)下的NF-KB和抑制蛋白家族的IKB蛋白相互結(jié)合形成無(wú)活性復(fù)合體并游離于上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，而作為外界刺激因子加入的E2則和GPR30結(jié)合并產(chǎn)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)；0.5h后IKB蛋白發(fā)生磷酸化形成p-IKB蛋白，然后p-IKB蛋白經(jīng)過(guò)泛素化降解，游離的NF-KB蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，1h后入核的NF-KB蛋白和SBDI開(kāi)始子結(jié)合并激活SBD1的轉(zhuǎn)錄；隨著細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中IKB蛋白濃度的降低，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)新生成的IKB蛋白且其在添加的17-β雌二醇刺激下發(fā)生磷酸化。但是高表達(dá)的SBD1會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞將通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)終止NF-KB信號(hào)通路，從而通過(guò)細(xì)胞內(nèi)部磷酸化、泛素化、脫磷酸化等一系列過(guò)程使細(xì)胞內(nèi)蛋白達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

綜上所述，β防御素既可以直接對(duì)抗細(xì)菌、病毒實(shí)現(xiàn)免疫功能，也能夠通過(guò)不同的信號(hào)通路產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，從而參與到動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)中。通過(guò)不斷的深入研究，其在應(yīng)用領(lǐng)域的作用必將被不斷開(kāi)發(fā)。