大蒜素及茜草素抗鴿毛滴蟲藥效觀察

薛 勇，俞小紅，徐嘉萍，王 洋

（蘇州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇 蘇州 215128）

鴿毛滴蟲?。═richomonas gallinae）是一種單細(xì)胞原蟲病，由鴿毛滴蟲引起，主要侵害消化道上段，其主要特征是消化潰瘍、下痢等[1]。毛滴蟲病寄生于各種雞、火雞以及各野生的其他鳥類。成年鴿一般情況不出現(xiàn)臨床癥狀，而青年鴿死亡數(shù)中有70%以上是由于在生長(zhǎng)過程中感染毛滴蟲引起的。幼鴿通常是因?yàn)閲L食成年鴿嗉囊里的“鴿乳”而導(dǎo)致感染的，幼鴿由于免疫機(jī)制沒有形成足夠的保護(hù)力，從而受到強(qiáng)毒蟲株的感染，導(dǎo)致死亡率高達(dá)50%。帶蟲幼鴿由于受到感染，不僅導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)吸收不良，肉質(zhì)下降，而且還會(huì)成為新的感染源，感染其他幼鴿[2]。臨床上治療鴿毛滴蟲的首選藥物是具有明顯殺毛滴蟲效果的甲硝唑，但其具有較大的副作用，如致癌和人基因突變等[3]。另一方面，由于甲硝唑長(zhǎng)期不正當(dāng)?shù)氖褂茫蜗x對(duì)其耐藥性日益顯著，治愈率逐漸下降，并有一定的復(fù)發(fā)性[4]，同時(shí)使得藥物殘留也成為突出問題。雖然中草藥沒有一些西藥見效快，但是由于中草藥都是天然和毒副作用小的藥物，因此，中草藥越來越受到人們的青睞?？姑蜗x中藥種類多，包括白頭翁、千里較光、大蒜素、茜草、五倍子等，對(duì)于其研究報(bào)道也較多[5]，但至今仍未見大蒜素抗鴿毛滴蟲效果觀察的報(bào)道。本試驗(yàn)選用大蒜素以及茜草素進(jìn)行體外殺鴿毛滴蟲的研究，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蟲株及病鴿的準(zhǔn)備

鴿毛滴蟲分離株，該蟲株分離自六合區(qū)東溝鎮(zhèn)養(yǎng)鴿場(chǎng)1月齡患病幼鴿，從其口腔中分離而得。3月齡感染毛滴蟲白羽王鴿病鴿200只（南京市六合區(qū)東溝鎮(zhèn)養(yǎng)鴿場(chǎng)提供）

1.2 試驗(yàn)藥品及試劑

大蒜素（山東聚德藥業(yè)有限公司，純度＞25%），茜草素（南京澤朗醫(yī)藥公司，純度＞50%），無水乙醇（分析純AR，上海國(guó)藥集團(tuán)），蛋白胨（生化試劑，中國(guó).天津布巴斯夫化工有限公司），麥芽糖（純度＞98%），氯化鈉（分析純，西隴化工股份有限公司），L-半胱氨酸鹽（純度＞98%），青霉素（注射用青霉素鉀，恒通獸藥），鏈霉素（注射用硫酸鏈霉素，恒通獸藥）。

1.3 主要試驗(yàn)儀器

FA1204B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司），BHC-13004A/B3型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司），麥克奧迪SFC-100FL生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 大蒜素、茜草素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察試驗(yàn)

（1）樣品制備

取一定質(zhì)量大蒜素、茜草素，分別配制成含有8mg/ml大蒜素原液、12mg/ml茜草素原液以及大蒜素-茜草素混合原液（包含8mg/ml大蒜素以及12mg/ml茜草素），置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）含藥培養(yǎng)基制備

將已經(jīng)配置好的8mg/ml大蒜素、12mg/ml茜草素溶液及大蒜素-茜草素混合液與肝浸湯培養(yǎng)液按倍比稀釋，稀釋倍數(shù)分別為1：1、1：2、1：4、1：8、1：16。

（3）蟲體純化與計(jì)數(shù)

取培養(yǎng)24h含有鴿毛滴蟲培養(yǎng)液，將其在2000r/min的條件下離心10min，吸出上清液，丟棄，將1ml培養(yǎng)基加入沉淀中，反復(fù)吹打使其混勻，備用。用吸管吸取上述懸浮液20μl，置于380μl培養(yǎng)液中，稀釋20倍。取稀釋好的液體少許，滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，利用白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)（計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右，團(tuán)體按單個(gè)計(jì)算），最終將鴿毛滴蟲數(shù)用培養(yǎng)液調(diào)整為1×105個(gè)/ml，吸取0.2ml含蟲液分別加入每個(gè)試管中，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。分別在2h、4h、8h、12h、24h時(shí)取樣觀察，計(jì)算鴿毛滴蟲蟲體死亡率。

（4）蟲體死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)

蟲體由梨形或者橢圓形變?yōu)閳A形，邊緣從光滑變?yōu)椴徽喞：?，蟲體內(nèi)含有數(shù)量不一的空泡，胞質(zhì)內(nèi)充滿大量顆粒。蟲體死亡率公式為死亡鴿毛滴蟲數(shù)/觀察總鴿毛滴蟲數(shù)×100%。

（5）數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.2 大蒜素、茜草素體內(nèi)抗鴿毛滴蟲初步應(yīng)用

（1）大蒜素-茜草素混合液準(zhǔn)備

配制低、中、高三種不同濃度的大蒜素-茜草素混合液，備用。

（2）分組與給藥

將感染毛滴蟲病鴿隨機(jī)分成4組，每組50只，分別標(biāo)記為1、2、3、4。第一組喂低濃度混合液（40mg/ml），第二組飼喂中濃度混合液（60mg/ml），第三組飼喂高濃度混合液（100mg/ml），第四組為空白對(duì)照組。連續(xù)飼喂5d。

（3）數(shù)據(jù)處理

計(jì)算5d后鴿毛滴蟲病治愈率。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察

蟲的平均殺蟲率是100%，可見大蒜素最低有效殺蟲濃度（MLCs）為0.5mg/ml。但隨著藥物濃度的增加，各試驗(yàn)組達(dá)到100%殺蟲率所需時(shí)間大大減少。1：2濃度組（2mg/ml）殺蟲率達(dá)100%只需4h，1：1濃度組（4mg/ml）所需時(shí)間更少，為2h?？瞻自囼?yàn)組殺蟲率比較低，與大蒜素試驗(yàn)組比較有顯著性（P＜0.05）。當(dāng)藥物濃度相同時(shí)，鴿毛滴蟲死亡率隨著時(shí)間的推移而逐漸增加（表1）。

表1 大蒜素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察（n=3）

2.2 茜草素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察

茜草素1：8濃度組，即0.75mg/ml在24h時(shí)對(duì)鴿毛滴蟲的平均殺蟲率是100%，得知茜草素殺滅鴿毛滴蟲的最低有效殺蟲濃度（MLCS）為0.75mg/ml。但隨著藥物濃度的增加，各試驗(yàn)組達(dá)到100%殺蟲率所需時(shí)間大大減少。1：2濃度組（3mg/ml）殺蟲率達(dá)100%只需4h，1：1濃度組（6mg/ml）所需時(shí)間更少，為2h?？瞻自囼?yàn)組殺蟲率比較低，與大茜草素試驗(yàn)組比較有顯著差異性（P＜0.05）。當(dāng)藥物濃度相同時(shí)，鴿毛滴蟲死亡率隨著時(shí)間的推移而逐漸增加（表2）。

表2 茜草素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察（n=3）

2.3 大蒜素-茜草素混合液體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察

大蒜素-茜草素混合液在1：8濃度組時(shí)，能在24h內(nèi)達(dá)到100%殺蟲率；1：4濃度組時(shí)，4h即可將鴿毛滴蟲殺蟲率達(dá)到100%。1：1，1：2濃度組殺蟲所需時(shí)間最短，都在2h內(nèi)達(dá)到100%殺蟲率。將大蒜素-茜草素混合液殺蟲率與空白試驗(yàn)組比較，差異顯著（P＜0.05）（表3）。

表3 大蒜素-茜草素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察（n=3）

2.4 大蒜素-茜草素鴿場(chǎng)初步應(yīng)用

大蒜素1：8濃度組，即0.5mg/ml在24h時(shí)對(duì)鴿毛滴

結(jié)果顯示，中高濃度組、中濃度組感染率降低至10%以下，效果與甲硝唑組接近，而低濃度組降低至感染率達(dá)36%，空白組感染率依舊為100%。這表明，在使用了大蒜素、茜草素組合添加劑后，大大降低了毛滴蟲的感染率，完全可以替代肉鴿養(yǎng)殖違禁藥物甲硝唑（表4）。

表4 大蒜素-茜草素初步應(yīng)用

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，無論大蒜素還是茜草素都具有明顯的殺蟲效果。大蒜素藥物濃度在0.5mg/ml～4mg/ml時(shí)，具有明顯抗毛滴蟲作用，在上述藥物濃度范圍內(nèi)，鴿毛滴蟲的死亡率隨著藥物濃度增加以及作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高，大蒜素24h100%最低殺蟲濃度為0.5mg/ml，4h完全殺蟲濃度為2mg/ml。茜草素藥物濃度在0.75～6mg/ml時(shí)，具有明顯抗毛滴蟲作用，在上述藥物濃度范圍內(nèi)，鴿毛滴蟲的死亡率隨著藥物濃度增加以及作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高，茜草素24h100%最低殺蟲濃度為0.75mg/ml，4h完全殺蟲濃度為3mg/ml。

通過組合試驗(yàn)表明，茜草素與大蒜素組合也能很好地抑殺鴿毛滴蟲，且具有明顯的協(xié)同作用。如大蒜素-茜草素混合液在比例為1：2時(shí)，2h殺蟲率即可達(dá)到100%，而單獨(dú)的大蒜素或者茜草素溶液在1：2時(shí)未能在2h完全殺死毛滴蟲；再如，茜草素與大蒜素組合物在1：4的稀釋度時(shí)，2h抑殺效果達(dá)到80%以上，4h后即可100%抑殺鴿毛滴蟲，效果與單獨(dú)使用1：2的大蒜素或茜草素的相似，甚至混合物稀釋度至1：8時(shí)，至24h殺蟲率仍然能達(dá)到100%。這些結(jié)果均證明了二者之間存在協(xié)同作用。但混合物的協(xié)同作用是以何種方式破壞毛滴蟲的結(jié)構(gòu)并最終殺死毛滴蟲還有待于進(jìn)一步研究。

在鴿場(chǎng)的初步應(yīng)用中，大蒜素和茜草素具有明顯的抑制鴿毛滴蟲效果。高濃度與中濃度組治愈率均在90%以上，低濃度的治愈率也達(dá)64%，未用藥組感染率達(dá)96%，說明在使用了大蒜素、茜草素組合后大大降低了鴿毛滴蟲的感染率，從而可以替代違禁藥物甲硝唑，為肉鴿標(biāo)準(zhǔn)化、無害化生產(chǎn)提供有效的方法。

近年來，肉鴿養(yǎng)殖業(yè)速度發(fā)展，但由于養(yǎng)殖技術(shù)的不足以及飼養(yǎng)環(huán)境、方式的不合理，導(dǎo)致鴿群中毛滴蟲感染率一直處于較高位置并呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。因此，這就導(dǎo)致抗生素以及抗鴿毛滴蟲藥物使用較為頻繁。目前，在臨床運(yùn)用中抗毛滴蟲藥物主要有甲硝唑、替硝唑等硝唑類藥物，雖然硝唑類藥物具有十分明顯的抗毛滴蟲效果，但鴿毛滴蟲耐藥性顯著增加，并且復(fù)發(fā)率有一定的提高，較大的副作用如致癌以及致基因突變也嚴(yán)重威脅人類健康[6]。大蒜素和茜草素作為防治鴿毛滴蟲感染的新藥，擁有綠色環(huán)保、毒副作用小等優(yōu)越性，可作為硝唑類藥物的替代藥物，值得深入研究。