黏液-纖毛標志物Mucin 5AC-acetylated alpha-tubulin在過敏性鼻炎患者鼻黏膜中的表達

郭沐濤， 周穗子， 邱前輝

過敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是當機體接觸過敏原后主要由IgE介導的鼻黏膜非感染性炎性疾病，典型的臨床癥狀包括鼻癢、打噴嚏、流鼻涕、眼癢和鼻塞[1]。如癥狀控制不佳不僅會增加哮喘的風險，還會降低學習、工作的效率，嚴重者還會引發(fā)睡眠質量不佳及情緒低落等問題[1-2]。鼻腔黏液-纖毛系統(tǒng)是上呼吸道的第一道防線，主要通過黏液分泌和纖毛擺動發(fā)揮清除功能。在正常呼吸過程中，空氣中被吸入的病原體會刺激鼻腔上皮細胞分泌黏液，隨后在鼻腔運動纖毛和黏液毯共同作用下將含有病原體的黏液排出，從而控制鼻腔炎癥的發(fā)生和發(fā)展[3]。已有文獻報道，鼻腔黏液-纖毛系統(tǒng)損傷是AR的重要病理現(xiàn)象，使過敏原和病原體在上呼吸道停留時間延長，加重AR癥狀及并發(fā)癥的嚴重程度[4]。然而在AR中，黏液-纖毛系統(tǒng)哪些成分損傷，損傷的分子表現(xiàn)及嚴重程度與AR的發(fā)生發(fā)展關系尚不清楚。通過文獻復習，Mucin 5AC(MUC5AC)在蛋白水平上定位在呼吸道上皮杯狀細胞分泌黏液中最常見、最經(jīng)典的標志物[5-6]。acetylated alpha-tubulin(acet. α-tubulin)是纖毛的微管結構的標志物，在蛋白水平上的表達水平直接反映了纖毛生長情況[7-8]。鑒此，本研究旨在通過檢測黏液-纖毛系統(tǒng)的核心標志物來闡明AR患者黏液、纖毛在分子水平上的損傷表現(xiàn)，并進一步探究該系統(tǒng)的損傷與AR的發(fā)生發(fā)展關系，為改善AR癥狀的治療提供研究基礎?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2021年3月至2022年3月期間在我院進行鼻中隔偏曲手術的40例患者的下鼻甲黏膜組織。其中AR 21例(AR組)，男13例，女8例；年齡(31.76±9.44)歲；過敏源為塵螨17例，其他4例；纖毛染色陽性樣本21例，黏液染色陽性樣本21例。非AR患者(對照組)19例，男13例，女6例；年齡(39.58±12.50)歲；纖毛染色陽性樣本19例，黏液染色陽性樣本19例。AR的診斷參照國際變應性鼻炎及其對哮喘的影響(Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma,ARIA)指南的診斷標準[9]，并且根據(jù)皮膚點刺實驗(Allergopharma,Reinbek,Germany)或血清敏篩過敏原檢測系統(tǒng)(Mediwiss Analytic GmbH,Moers,Germany)的結果對AR進行診斷，排除哮喘病史，并且不伴有急慢性鼻竇炎癥狀者。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學附屬廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(倫理號：KY-Z-2021-397-01)。

1.2免疫熒光染色方法 術中取鼻腔下鼻甲組織樣本，在室溫下用4%多聚甲醛固定液固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，烘干。常規(guī)脫蠟后置樣本于95 ℃高溫水浴修復10 min，自然冷卻60 min。經(jīng)過打孔、封閉之后，滴加一抗[鼠抗人acet. α-tubulin單克隆抗體，clone ab24610(Abcam,Cambridge,MA)]和兔抗人MUC5AC多克隆抗體[H160:sc20118(Santa Cruz Biotechology)]，兩者的工作濃度都是1∶800，4 ℃孵育過夜。隔日漂洗后滴加二抗[熒光488-(抗鼠)和熒光594-(抗兔)，Life Technologies,Carlsbad,CA]。兩者的工作濃度均為1∶500。最后滴加4′6-二氨基-2-苯基吲哚(4′6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(Life Technologies,Carlsbad,CA)進行細胞核染色，封片。置于熒光顯微鏡(Olympus IX51,Tokyo,Japan)下觀察，組織切片用400倍物鏡拍攝。

1.3黏液分泌程度和纖毛長度、密度、脫落的評估方法 所有樣本先不分組，在400倍物鏡下單獨、隨機選取5個視野拍攝。由2個實驗者用Image J軟件分別進行評估。黏液用MUC5AC陽性染色進行評估[6]。纖毛用acet. α-tubulin陽性染色進行評估，指標包括纖毛密度和長度[3]、纖毛脫落[10]。(1)黏液分泌程度和纖毛密度：每個視野用對應標志物的總免疫熒光強度進行評估，取5個視野的熒光強度平均值為該樣本的黏液分泌程度和纖毛密度。(2)纖毛長度：以20 μm(400倍物鏡下的比例尺)作為測量的標準。每個視野測量20次，取5個視野的平均測量值為該樣本的纖毛長度。(3)纖毛脫落：參看相關文獻[11]，細胞標志物陽性染色的截斷值設為70%。將>70%纖毛陽性染色的區(qū)域判定為纖毛完整，評為0分；≤70%纖毛陽性染色的區(qū)域判定為纖毛脫落，評為1分。5個視野評分的平均值為該樣本的纖毛脫落程度。

1.4統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism 7軟件進行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，對照組和AR組的纖毛和黏液的評估采用Mann-Whitney 2-tailed非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1兩組黏液分泌情況比較 對照組和AR組患者的下鼻甲上皮黏膜組織中杯狀細胞分泌黏液形態(tài)見圖1。黏液的標志物(MUC5AC)成顆粒狀分泌，形態(tài)、大小不固定，可存在于上皮杯狀細胞層以上，甚至在黏液分泌較多情況下會黏附于纖毛表面。對照組的黏液分泌排列較稀疏，形態(tài)較小并表達黯淡；AR組的黏液分泌排列緊密，形態(tài)肥厚、表達明亮并黏附于纖毛表面，其分泌量明顯高于對照組。對照組黏液分泌的總免疫熒光強度為2 536 685(1 643 296，5 059 862)，AR為3 750 531(2 263 503，6 435 619)。與對照組相比，AR組黏液分泌的總免疫熒光強度增加了32.365%。見圖2。由此可得，AR患者的黏液分泌相比對照組顯著增多(P<0.05)。

?對照組MUC5AC(黏液染色，比例尺為20 μm)；?對照組DAPI(細胞核染色)；?為??圖合并；?AR組MUC5AC(黏液染色)；?AR組DAPI(細胞核染色)；?為??圖合并

圖2 對照組與AR組黏液分泌量比較圖

2.2兩組纖毛長度、脫落和密度情況比較 對照組和AR組的下鼻甲組織的纖毛形態(tài)見圖3。與對照組相比，AR組纖毛較短小、稀疏且脫落明顯，排列不整齊。對照組的纖毛長度為3.931(2.876，4.341)μm；AR組的纖毛長度為2.642(2.399，2.951)μm(見圖4?)。與對照組相比，AR組的纖毛長度縮短了將近1/2，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 1)(見圖4?)。對照組纖毛脫落評分為0(0，0.2)分，AR組為0.33(0，0.55)分，AR組的得分上升了將近3倍，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.032)(見圖4?)。對照組和AR組纖毛的總免疫熒光強度分別為25 753(16 147，33 563)和19 429(13 530，27 560)，AR組纖毛的總免疫熒光強度相比對照組下降了24.555%(見圖4?)。由此可得，AR患者的纖毛密度相比對照組降低。AR患者鼻上皮黏液-纖毛清除功能損傷模式見圖5。

?對照組acet. α-tubulin(纖毛染色，比例尺為20 μm)；?對照組DAPI(細胞核染色)；?為??圖合并，箭頭指代纖毛脫落；?AR組acet. α-tubulin(纖毛染色)；?AR組DAPI(細胞核染色)；?為??圖合并，箭頭指代纖毛脫落

圖4 對照組與AR組纖毛評估圖

圖5 AR患者鼻上皮黏液-纖毛清除功能損傷模式圖

3 討論

3.1黏液-纖毛清除功能是呼吸道固有免疫的重要組成部分，它由黏液、氣道表面液體、纖毛細胞表面的纖毛構成[12]。黏液-纖毛清除系統(tǒng)通過分泌黏液捕獲入侵的過敏原和病原體，分泌炎癥介質和免疫細胞募集的趨化因子，再通過有效的纖毛擺動將包裹在黏液層的有害物質排出呼吸道[13-15]。在健康人體中，正常的黏液-纖毛系統(tǒng)可以有效保護上下呼吸道，維持呼吸道的自凈功能，減少抗原刺激和疾病感染的風險[16-17]。然而，在AR患者中，黏液-纖毛清除功能損傷會增加過敏原的停留時間，加重鼻腔黏膜的炎癥浸潤狀態(tài)，加重AR的癥狀，甚至導致哮喘等一系列過敏性疾病，降低患者的生活質量。

3.2臨床上評價黏液-纖毛清除功能主要通過糖精清除試驗來檢測。本文主要研究AR分子水平的損傷表達。acet. α-tubulin是纖毛細胞的微管結構的標志物，它表達在纖毛細胞頂端，與纖毛生長位置重合。Shah等[18]2009年發(fā)表在Science的研究中把acet. α-tubulin作為氣道上皮纖毛標志物。Kanamaru等[19]及Wang等[20]在2022年的研究報道中也沿用acet. α-tubulin作為纖毛運動的標志物。MUC5AC是在氣道上皮中表達的主要分泌黏蛋白，它在N端和C端具有富含半胱氨酸結構域的糖蛋白，可通過二硫鍵聚合。Song等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MUC5AC缺失會導致黏液纖毛運輸受損和不協(xié)調，進一步說明這種黏蛋白對氣道清除的重要性。Jiang等[22]報道了在AR小鼠模型及白細胞介素13(interleukin 13,IL-13)刺激體外分離的鼻上皮細胞中MUC5AC的表達上調。Wang等[23]采用低覆蓋率全基因組測序方法對漢族后裔AR患者的病例及其父母3人進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)MUC5AC拷貝數(shù)與AR易感性相關。而Peng等[24]通過基因芯片測序方法發(fā)現(xiàn)，相比對照組患者，AR患者鼻黏膜中纖毛基因表達廣泛下調，纖毛脫落增加，但纖毛長度是否改變尚未被報道。本研究直接取AR組和對照組患者的鼻黏膜樣本，進一步分析黏液蛋白MUC5AC、纖毛基因acet. α-tubulin的表達情況及纖毛長度的變化，為后續(xù)探究AR黏液-纖毛功能損傷提供分子基礎。黏液-纖毛清除功能損傷是AR的重要病理現(xiàn)象。Song等[25]的研究結果表明，成年人AR癥狀綜合評分越高，癥狀越重，鼻腔黏液-纖毛清除時間也相對延長。Mikolajczyk等[26]在兒童患者的研究中發(fā)現(xiàn)，黏液-纖毛清除時間與AR的嚴重程度以及鼻甲黏膜的嗜酸性細胞浸潤程度呈正相關。這些研究結果在宏觀上共同說明，AR病情越嚴重，黏液-纖毛清除功能損傷程度可能越高，清除病原體和過敏原所需的時間越長。本研究結果進一步提示黏液-纖毛清除功能損傷可能由黏液的分泌量顯著增加，纖毛長度變短、排列不齊、稀疏以及脫落增加引起。本研究結果首次從分子水平上揭示了AR患者鼻腔的黏液-纖毛系統(tǒng)功能成分損傷的具體變化及嚴重程度，為進一步探索黏液-纖毛清除功能損傷在AR發(fā)病的分子機制及作用的基因靶點提供研究基礎。

3.3越來越多的研究證據(jù)支持黏液-纖毛清除功能損傷是在發(fā)病機制上引起肺部慢性炎癥性疾病的重要因素。有學者在氣道上皮NA+通道過表達的小鼠模型上驗證了NA+通道過度開放、氣道表面脫水可能是氣道黏液分泌過多導致黏液-纖毛清除功能受損，繼而引起早期過敏性哮喘等2型過敏性疾病的病理生理機制[27-29]。還有研究認為，即使在沒有細菌感染情況下，氣道黏液分泌過多也可能會通過上皮缺氧壞死、潛在免疫調節(jié)作用等機制引起黏液-纖毛系統(tǒng)受損，觸發(fā)慢性氣道炎癥和肺部損傷的發(fā)生[30-31]。另外，Lam等[32]發(fā)現(xiàn)自噬依賴途徑可能與慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)中肺纖毛長度縮短、黏液-纖毛清除功能受損有密切關系，該作用途徑有望成為COPD治療的新靶點。有研究證實香煙煙霧會直接影響呼吸道纖毛長度，從而降低氣道的黏液-纖毛清除的能力，為長期吸煙導致COPD的發(fā)病提供了重要的實驗依據(jù)[33-35]。本研究結果顯示鼻腔黏膜的黏液分泌過多及纖毛結構破壞導致黏液-纖毛清除功能損傷也可能是參與AR發(fā)病的重要原因，但其中的發(fā)病機制目前尚不清楚。這將為我們未來深入研究黏液-纖毛功能損傷在AR等常見呼吸道疾病的發(fā)病機制中提供實驗依據(jù)及方向指引。

3.4Di Berardino等[36]的臨床研究表明，通過鼻腔沖洗來加強鼻腔黏液-纖毛清除功能的治療方法能有效緩解AR的癥狀。Mall和Galietta[37]在小鼠模型上驗證了使用NA+通道抑制藥物(阿米洛利特)可改善氣道表面水化和加速黏液排出，提高呼吸道的自凈能力，緩解過敏原刺激引起的氣道反應，如氣道嗜酸性細胞浸潤、IL-13分泌和氣道高反應性。由此可見，改善鼻腔黏液-纖毛清除功能可以有效緩解AR的癥狀。恢復黏液-纖毛清除功能可能為AR患者，甚至哮喘等過敏性疾病患者群體提供潛在的治療機會。

3.5盡管我們已經(jīng)在AR患者下鼻甲黏膜組織發(fā)現(xiàn)了黏液分泌增加和纖毛結構異常可能是導致AR黏液-纖毛清除功能損傷的直接原因，但個體差異是不可避免的。同時，樣本量不足也可能是導致黏液和纖毛總免疫熒光強度未達到統(tǒng)計學意義的限制因素，但其表達上調及下調的趨勢與相關文獻報道的數(shù)據(jù)具有一致性，因此認為其表達趨勢變化是真實可信的?；诖搜芯炕A，我們將用人鼻上皮干細胞模型以及動物實驗來驗證這一結論，并延續(xù)性探究黏液-纖毛系統(tǒng)損傷導致AR的發(fā)病機制，為臨床上AR診斷及治療策略提供新穎、有效和安全的理論依據(jù)。

綜上所述，本研究從分子水平上揭示了AR黏液的分泌量增加，纖毛排列不齊、變短、稀疏以及脫落增加，是導致AR患者鼻腔黏膜黏液-纖毛清除功能減弱，繼而加重AR癥狀嚴重程度的分子依據(jù)。根據(jù)文獻復習，黏液-纖毛系統(tǒng)的損傷可能是AR發(fā)病的重要原因。改善黏液-纖毛清除功能的治療有助于改善AR的癥狀嚴重性，可能為AR等過敏性疾病患者提供潛在的治療機會。