IBRV 重組gD 蛋白的真核表達(dá)與間接ELISA檢測方法的建立

郭宇，楊波，蘭德松，郁茵，楊冬梅，王旭紅，云濤，牧仁，李雷斌，孫雨

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010051；2.鄂爾多斯市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017000；3.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164；4.北京市密云區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，北京 101500；5.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；6.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600）

牛傳染性鼻氣管炎（IBR）又稱牛病毒性鼻氣管炎（BVR）、壞死性鼻炎（NR）或紅鼻?。≧ND），是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）引起牛的一種急性、熱性傳染病。病毒學(xué)上，將IBRV 命名為牛皰疹病毒1 型，歸屬于皰疹病毒科皰疹病毒甲亞科水痘病毒屬。IBR 臨床上以呼吸困難、鼻漏，以及上呼吸道及氣管黏膜水腫發(fā)炎、淋巴結(jié)腫大、消瘦、產(chǎn)乳量大幅度降低等為主要特征。IBR 的危害在于病毒侵入牛體后可潛伏在一定部位，導(dǎo)致持續(xù)性感染，延緩育肥牛群的生長和增重，降低產(chǎn)奶量甚至停乳，使懷孕動物流產(chǎn)[1-2]，因而給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大危害，給本病的控制與消滅帶來不小困難。本研究旨在建立一種靈敏的IBRV 檢測方法，以推動該病的凈化、控制進(jìn)程。

IBRV 基因組為線性雙股DNA 分子?；蚪M分成特異長區(qū)（UL，106 kb）和短區(qū)（US，10 kb），其中短區(qū)被兩個反向重復(fù)序列（IRS、TRS 各11 kb）包圍，因此能夠反轉(zhuǎn)方向，使病毒DNA 具有兩種異構(gòu)體[3]。IBRV 基因組可編碼約70 個蛋白質(zhì)，其中有15 個非結(jié)構(gòu)蛋白和33 個結(jié)構(gòu)蛋白，蛋白結(jié)構(gòu)和功能目前大部分已知。研究[4]表明，IBRV 的12個囊膜蛋白中有10 個是糖蛋白（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL 和gM），還有2 個未進(jìn)行糖基化修飾。其中g(shù)B、gC、gD 和gE 4 個主要糖蛋白已完成測序并已在哺乳動物中表達(dá)。病毒糖蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生具有中和活性的抗體，并在病毒感染細(xì)胞過程中發(fā)揮十分重要的作用[5-7]。gD 蛋白位于基因組的短特異區(qū)，是病毒的一個重要結(jié)構(gòu)蛋白。gD 蛋白被認(rèn)為是病毒粒子表面和病毒感染細(xì)胞的主要分子，參與病毒吸附、侵入細(xì)胞的過程，是病毒復(fù)制的必需蛋白。gD 蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，并使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體來中和病毒。

為獲得在Sf9 細(xì)胞中高效表達(dá)的IBRV gD 蛋白，本研究通過優(yōu)化IBRV gD 密碼子序列，瞬時轉(zhuǎn)染Sf9 昆蟲細(xì)胞，改進(jìn)抗原制備純化條件，使用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備出病毒的gD 抗原。以純化的抗原為基礎(chǔ)，成功建立了相關(guān)抗體檢測方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（DH10Bac）、Sf9 昆蟲細(xì)胞、IBRV gD pFastBacHTA 質(zhì)粒，由中國動物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒，購自Promega 公司；SF900昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，購自GIBCO 公司；CellfectinTMII Reagen 轉(zhuǎn)染試劑、BCA 蛋白定量試劑盒，購自Thermo Fisher公司；Casein Tryptone、Yeast extract、酶標(biāo)兔抗牛二抗、Ni-Berpharose FF 純化試劑盒等，購自北京康為世紀(jì)公司。

1.3 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的設(shè)計與構(gòu)建

利用TMHMM 跨膜區(qū)在線預(yù)測系統(tǒng)、SignalIP在線預(yù)測系統(tǒng)等生物信息學(xué)分析軟件，分析并預(yù)測經(jīng)典IBRV（GenBank 登錄號AFH08294.1）gD 蛋白的跨膜區(qū)序列、疏水區(qū)序列和稀有密碼子。優(yōu)化目的序列密碼子并使用化學(xué)合成方法合成IBRVgD核苷酸序列，構(gòu)建重組IBRV gD-pFastBacHTA 質(zhì)粒。使用DNAman 軟件設(shè)計IBRVgD基因擴(kuò)增引物gD-F 和gD-R。上述引物序列由生工生物工程股份有限公司合成。

表1 IBRV gD 基因引物與M13 通用引物序列信息

1.4 重組質(zhì)粒PCR 擴(kuò)增與鑒定

合成上游引物gD-F 及下游引物gD-R，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增后對目的序列產(chǎn)物進(jìn)行測序并鑒定。

1.5 重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建與藍(lán)白斑篩選

將重組質(zhì)粒以三線法的方式劃線接種于LB平板，挑單克隆、搖菌，提取重組質(zhì)粒IBRV gDpFastBacHTA，利用1.3 中構(gòu)建的IBRVgD基因上、下游引物進(jìn)行驗證，將PCR 鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測序并鑒定。

1.6 包裝重組桿粒病毒并傳代

將生長狀態(tài)良好的Sf9 昆蟲細(xì)胞平鋪于細(xì)胞六孔板中，待貼壁1～2 h 后，按照CellfectinTMII Reagen 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染；細(xì)胞培養(yǎng)96 h后，反復(fù)凍融收集上清，將其命名為第1 代病毒；從第2 代病毒開始，加入第1 代病毒液和Sf9 細(xì)胞培養(yǎng)基，覆蓋細(xì)胞，1～2 h 后棄去上清，加入2 mL的SF900 II 型細(xì)胞培養(yǎng)基；病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)72 h，傳至第5 代后，反復(fù)凍融離心收集上清，分裝于無菌管做好標(biāo)記，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 目的抗原表達(dá)與鑒定

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Sf9 細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。使用PBS 對收集的細(xì)胞沉淀進(jìn)行洗滌，并加入細(xì)胞裂解液，冰浴離心后收集上清，使用鎳原料純化試劑盒對抗原進(jìn)行初步純化；純化后，利用SDSPAGE 進(jìn)行電泳鑒定，同時使用BCA 蛋白定量試劑盒測定純化的蛋白濃度。

1.8 重組蛋白Western-blot 鑒定

利用Western-blot 進(jìn)一步鑒定目的蛋白表達(dá)情況。以Anti-6x HisTagAntibody 為一抗，室溫孵育1.5 h，用TBST 洗滌3 次；以抗鼠二抗作為二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，用TBST 洗滌3 次；加入DAB顯色液，觀察條帶的相對分子質(zhì)量大小、清晰度及有無非特異條帶。

1.9 gD 抗體間接ELISA 檢測方法研究

1.9.1 ELISA 檢測方法建立 將制備純化后的gD抗原，按照8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/mL 的梯度稀釋后，包被于96 孔酶標(biāo)板中；將IBRV 標(biāo)準(zhǔn)抗體陽性血清及陰性血清分別按1:10、1:20、1:50、1:100、1:200 的稀釋度稀釋后加入包被好的酶標(biāo)板中，按照棋盤滴定法驗證抗原的最優(yōu)包被濃度與血清稀釋度。使用不同濃度稀釋后的牛血清白蛋白（BSA）封閉ELISA 酶標(biāo)板，并通過不同稀釋濃度確定最優(yōu)封閉濃度。酶標(biāo)二抗的最佳稀釋濃度與作用時間，使用棋盤滴定交叉方法驗證。按照IBRV 標(biāo)準(zhǔn)抗體陽性樣本與陰性樣本的OD450計算P/N值，將P/N最大值對應(yīng)的ELISA 檢測條件作為gD 抗體間接ELISA 檢測方法的最佳反應(yīng)條件。

1.9.2 Cut-off臨界值確定 為確定IBRV gD ELISA 抗體檢測方法的臨界值，使用經(jīng)血清抗體中和試驗鑒定的223 份臨床陰性牛血清，通過本研究建立的IBRV gD ELISA 抗體檢測方法進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測出相應(yīng)血清抗體OD450值分析檢測出的結(jié)果，計算血清抗體的平均OD450值（X）及對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值（SD）。Cut-off臨界值按公式計算：Cut-off臨界值=陰性牛血清平均OD450（X）+4SD。當(dāng)OD450＞X＋4SD 判定為陽性，否則判定為陰性。

1.9.3 特異性檢測 使用本研究建立的間接ELISA 方法，對牛病毒性腹瀉病毒抗體陽性血清、牛A 型口蹄疫病毒抗體陽性血清、牛O 型口蹄疫病毒抗體陽性血清、牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒抗體陽性血清進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測的OD450，計算Cut-off臨界值，以此判定建立的間接ELISA 檢測方法與其他牛類病毒是否存在非特異性交叉反應(yīng)。

1.9.4 敏感性檢測 使用采購的IBRV 標(biāo)準(zhǔn)抗體陽性血清，對本研究建立的間接ELISA 檢測方法進(jìn)行敏感性驗證。將IBRV 標(biāo)準(zhǔn)抗體陽性血清按1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512的比例進(jìn)行倍比稀釋后檢測，根據(jù)檢測的OD450計算結(jié)果，得出陽性臨界值時的最大血清稀釋度，并將結(jié)果同血清中和試驗的中和效價結(jié)果進(jìn)行比對。

1.9.5 重復(fù)性檢測 使用上述完善的ELISA 方法，對10 份不同中和效價的臨床陽性血清進(jìn)行批內(nèi)與批間重復(fù)性測試，每個陽性血清樣本做5個重復(fù)，根據(jù)檢測的OD450計算批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）。

1.9.6 臨床血清樣品測試 使用本研究建立的ELISA 抗體檢測方法與血清中和試驗，對農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心保存的480 份臨床樣本進(jìn)行比對檢測，并計算兩種檢測方法的總符合率（包括特異性符合率、敏感性符合率）。

2 結(jié)果與分析

2.1 gD-pFastBacHTA 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

使用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到了與預(yù)期大小一致的PCR 產(chǎn)物片段（305 bp，圖1）。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，PCR 產(chǎn)物序列與目的基因序列相同（圖2），表明IBRV gD-pFastBacHTA 重組質(zhì)粒初步構(gòu)建成功。

圖1 gD 片段PCR 擴(kuò)增鑒定結(jié)果

圖2 Bacmid-IBRV-G 測序比對結(jié)果

2.2 重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-IBRV gD 的PCR 擴(kuò)增

使用通用引物與目的序列特異性引物進(jìn)行交叉PCR 鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 對交叉引物均擴(kuò)增出清晰、明確的目的條帶，由此證明除正確目的基因外，連接上的穿梭載體也是正確的，表明IBRV gDpFastBacHTA 重組質(zhì)粒完全構(gòu)建成功（圖3）。

圖3 Bacmid-IBRV gD 的PCR 擴(kuò)增鑒定結(jié)果

2.3 Bacmid-IBRV gD 致細(xì)胞病變觀察

對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染接毒后，在顯微鏡下觀察第3代次細(xì)胞。結(jié)果（圖4）顯示：陰性對照組的Sf9細(xì)胞生長正常，且在高營養(yǎng)培養(yǎng)基環(huán)境下出現(xiàn)部分疊加生長而導(dǎo)致的輕微聚堆現(xiàn)象；感染病毒組的Sf9 細(xì)胞發(fā)生了特異性細(xì)胞病變，出現(xiàn)了明顯的增殖抑制、細(xì)胞外觀變圓、細(xì)胞核變大、細(xì)胞分散間隙大、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒及雜質(zhì)等特征。

圖4 轉(zhuǎn)染Bacmid-IBRV gD 細(xì)胞病變（40×）

2.4 不同代次桿狀病毒目的基因檢測

將第3～5 代重組桿狀病毒感染的Sf9 細(xì)胞提取基因組后，使用桿狀病毒的gD-F/gD-R 為上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測各代次病毒基因組有無突變等特殊情況。檢測發(fā)現(xiàn)，每個代次的擴(kuò)增片段均一致，且條帶明確（305 bp），說明gD序列已成功進(jìn)入桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，并持續(xù)穩(wěn)定存在于各代次的細(xì)胞中（圖5）。

圖5 不同代次桿狀病毒目的基因PCR 擴(kuò)增鑒定結(jié)果

2.5 重組蛋白表達(dá)與Western Blot（WB）鑒定

純化后的重組IBRV gD 蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳鑒定后，結(jié)果在大小約為40 kDa 位置處存在一清晰條帶，且前后沒有明顯雜質(zhì)，表明純度非常高（圖6）；進(jìn)行WB 試驗，結(jié)果在與染色膠圖目的條帶的相同位置出現(xiàn)了明顯棕色印記（圖7），說明重組IBRV gD 可溶性蛋白成功表達(dá)，并且具有較好的反應(yīng)原性。

圖6 重組IBRV gD 蛋白SDS-PAGE 鑒定結(jié)果

圖7 重組IBRV gD 蛋白Western-blot 檢測結(jié)果

2.6 IBRV gD 間接ELISA 檢測方法的建立與優(yōu)化

2.6.1 抗原包被濃度與樣品稀釋度優(yōu)化 對抗原包被濃度與樣品稀釋度進(jìn)行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗原濃度為0.5 μg/mL、4℃條件下作用18 h，2.5%BSA、4 ℃條件下封閉24 h，一抗血清稀釋度為1:20 倍時，反應(yīng)45 min，計算得出的P/N值最大。當(dāng)酶標(biāo)二抗的稀釋度為1:30 000、二抗37 ℃條件下反應(yīng)45 min，底物反應(yīng)10 min 條件下的P/N值最高（表2）。

表2 IBRV gD 間接ELISA 檢測方法的建立與優(yōu)化結(jié)果

2.6.2 陰陽性臨界值（Cut-off值）確定 使用本研究建立的IBRV gD ELISA 抗體檢測方法，對經(jīng)血清抗體中和試驗鑒定的223 份臨床陰性牛血清進(jìn)行檢測，結(jié)果223 份陰性血清平均OD450值（）為0.118，SD 為0.061，Cut-off值為+4SD=0.362。

2.7 ELISA 檢測方法各指標(biāo)驗證

2.7.1 特異性驗證 使用建立的IBRV gD ELISA抗體檢測方法，分別檢測了牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒抗體陽性血清、牛O 型口蹄疫病毒抗體陽性血清、牛A 型口蹄疫病毒抗體陽性血清、牛病毒性腹瀉病毒抗體陽性血清，檢測到的OD450值分別為0.093、0.086、0.107、0.094，均小于Cut-off值0.362，表明重組IBRV gD 抗原對上述牛病毒的抗體陽性血清無任何非特異性交叉反應(yīng)，證明本研究所建立的方法特異性較好。

2.7.2 敏感性驗證 使用購自英國WOAH 參考實驗室的IBRV 標(biāo)準(zhǔn)抗體陽性血清（血清中和效價為1:256），對建立的IBRV gD ELISA 抗體檢測方法對進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，建立的IBRV gD ELISA 檢測方法在稀釋度1:512 時仍為陽性，表明檢測敏感性高于傳統(tǒng)的血清中和試驗方法。

2.7.3 重復(fù)性驗證 使用建立的間接ELISA 檢測方法，將10 份不同中和抗體效價的IBRV 抗體陽性血清分別在同批次板（批內(nèi)）和不同批次（批間）的酶標(biāo)板上進(jìn)行重復(fù)性驗證，結(jié)果批內(nèi)、批間檢測的重復(fù)性變異系數(shù)均小于10%，表明所建立的ELISA 檢測重復(fù)性好、變異較小，抗原穩(wěn)定性較高，可用于不同抗體效價樣本不同批次的IBRV 抗體檢測（表3）。

表3 間接ELISA 檢測方法的重復(fù)性驗證結(jié)果

2.7.4 臨床血清樣品測試 使用建立的間接ELISA 檢測方法結(jié)合血清中和試驗，對中國動物疫病預(yù)防控制中心（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心）保存的480 份臨床血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法的敏感性符合率為98.18%，特異性符合率為93.33%，總符合率為96.67%（表4）。

表4 臨床血清樣品的測試結(jié)果 單位：份

3 討論

IBR 作為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的二類動物疫病，長久以來給養(yǎng)殖戶以及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展都帶來了不小的影響，其一旦發(fā)病，尚無有效的藥物治療方法。對于本病的防控，主要采取疫苗免疫、抗體與病原監(jiān)測，配合種畜群凈化等綜合措施。檢測IBR 疫苗免疫后的中和抗體是評價疫苗免疫效果的重要途徑。WOAH《陸生動物診斷檢測與疫苗手冊》（Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals）11.11章有關(guān)于IBR的診斷方法，涉及病毒中和試驗、病毒分離、電鏡觀察、常規(guī)PCR、間接免疫熒光抗體等，國內(nèi)只有行標(biāo)《牛傳染性鼻氣管炎診斷技術(shù)》（NY/T 575—2019）[8]。這些方法為我國現(xiàn)有疫情防控提供了技術(shù)支撐。

分子生物學(xué)檢測方法相較于病毒分離、中和試驗等檢測方法，具有檢測速度快，檢測結(jié)果量化、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但存在病毒血癥期短、動物機(jī)體樣本取樣困難、臨床檢測中不利于大面積監(jiān)測推廣等問題。血清中和試驗作為傳統(tǒng)的經(jīng)典檢測技術(shù)，是檢測IBRV 的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但其檢測周期長、檢測成本高、操作繁瑣、判據(jù)復(fù)雜，不適于檢測大量樣本。本研究選用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)gD 蛋白，保留了蛋白原有的糖基化、乙酰化、磷酸化位點(diǎn)。蛋白折疊、二硫鍵形成更接近于天然蛋白，且表達(dá)量高。在此基礎(chǔ)上，建立的IBRV 抗體間接ELISA 方法具有諸多優(yōu)勢，其中試驗材料獲取途徑簡單，檢測速度快、結(jié)果準(zhǔn)確，對試驗環(huán)境、設(shè)備及人員的要求較低，并且相較于血清抗體中和試驗敏感性更高，特異性更強(qiáng)、準(zhǔn)確性極佳，可以客觀評價IBR 疫苗免疫動物后的抗體免疫保護(hù)水平，對臨床樣本可實現(xiàn)大批量檢測，對基層樣本可進(jìn)行大批量篩查，從而可以加快IBR 防控凈化進(jìn)程[8-10]。

目前檢測IBRV 抗體的ELISA 試劑盒大多依賴于國外品牌，成本較高，且進(jìn)口周期長，給基層動物防疫檢測工作帶來了較大困難。本研究建立的IBRV gD 抗體間接ELISA 檢測方法與傳統(tǒng)的血清中和試驗方法相比，符合率可達(dá)96.67%，在保證檢測方法特異性的同時，檢測敏感性比血清中和檢測方法更有優(yōu)勢，臨床陽性血清樣品檢出率也更高，所以檢測性能更具優(yōu)勢，具有較好的市場應(yīng)用前景。同時本研究所建立的方法適合臨床樣本的大批量檢測，可以用于基層IBRV 疫苗免疫效果評價、疫情監(jiān)測等工作，應(yīng)用前景廣闊。