基于Web 服務(wù)的禽流感病毒基因分析軟件FluSoft 的創(chuàng)建與應(yīng)用

劉朔，蔣文明，彭程，尹馨，劉華雷

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物安全風(fēng)險預(yù)警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科α 流感病毒屬，其基因組由8 個單股負(fù)鏈RNA 片段組成，部分基因片段的表達(dá)涉及可變剪接機(jī)制，可編碼至少12 種病毒蛋白。根據(jù)病毒表面糖蛋白血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）的抗原性差異，AIV 可分為16 種HA（H1—H16）和9種NA（N1—N9）亞型。

AIV 廣泛存在于世界范圍內(nèi)的許多野禽和家禽中，水禽是其天然宿主。大多數(shù)AIV 會導(dǎo)致禽類無癥狀或輕度感染，癥狀輕重取決于病毒特性。在家禽中引起輕微疾病的病毒稱為低致病性禽流感病毒（LPAIV），引起嚴(yán)重疾病并導(dǎo)致高死亡率的病毒稱為高致病性禽流感病毒（HPAIV），該類病毒為H5 或H7 亞型。HPAIV 不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失，而且會導(dǎo)致野禽感染和發(fā)病，并隨著候鳥遷徙加速病毒在全球范圍內(nèi)的傳播[1]。AIV 有時也會突破種間屏障，感染豬、馬、貓、犬、海洋哺乳動物和人類等[2]。近年來，我國頻繁發(fā)生不同亞型AIV 感染人的公共衛(wèi)生事件[3]，引起社會廣泛關(guān)注。如2013年2 月我國首次報道H7N9 感染病例，累計導(dǎo)致1 568 人感染，616 人死亡；2013年江西和2021年江蘇報道人感染H10N8 和H10N3 AIV；2014年四川報告首例人感染H5N6 AIV 病例，至2021年底共報告65 例人間病例，死亡率達(dá)55%；2022年發(fā)生人感染H3N8 AIV 事件，再次引發(fā)人們對AIV 的關(guān)注。鑒于AIV 在野生鳥類和家禽中持續(xù)流行、人獸共患、病毒本身的高度變異性及傳播和進(jìn)化的復(fù)雜性，了解AIV 隱藏的生物學(xué)信息，對于疫病的診斷、風(fēng)險評估和早期預(yù)警具有重要意義。解讀病毒基因組信息是探明病毒分子生物學(xué)特性的重要步驟。本研究采用Perl 語言集成一系列軟件和數(shù)據(jù)集，創(chuàng)建了基于Web 服務(wù)的AIV 基因分析軟件（FluSoft），實現(xiàn)了AIV 基因組的快速批量注釋和分析，為禽流感監(jiān)測、研究和預(yù)警提供了有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集

FluSoft 數(shù)據(jù)集包括用于生物特性分析和遺傳進(jìn)化分析兩個方面的數(shù)據(jù)集。

1.1.1 用于生物特性分析數(shù)據(jù)集 用于生物特性分析的數(shù)據(jù)集由兩部分組成，即基礎(chǔ)比對分析的AIV 參考序列和標(biāo)記查詢序列生物學(xué)意義的數(shù)據(jù)集。用于基礎(chǔ)比對分析的AIV 基因組序列共34 條（表1）。其中，H5 基因、N1 基因和內(nèi)部基因序列選擇A/goose/Guangdong/1/1996（H5N1）毒株基因作為參考序列，除H5 基因外，其他H1—H16 基因序列參考文獻(xiàn)[4]，N2—N9 基因序列從GenBank檢索得到。用于標(biāo)記查詢序列生物學(xué)意義的數(shù)據(jù)集根據(jù)文獻(xiàn)[5]整理形成，內(nèi)容包括耐藥性、宿主受體特異性、毒力、糖基化位點、在家禽或哺乳動物中的傳播能力等信息。為保持與現(xiàn)有文獻(xiàn)的一致性，HA 基因突變位點注釋根據(jù)H3 亞型序列進(jìn)行編號，NA 基因突變位點注釋根據(jù)N2 亞型序列進(jìn)行編號，內(nèi)部基因和NA 缺失情況根據(jù)A/Goose/Guangdong/1/1996（H5N1）毒株的基因組片段進(jìn)行編號。

表1 用于基礎(chǔ)比對分析的參考序列

1.1.2 用于遺傳進(jìn)化分析數(shù)據(jù)集 用于遺傳進(jìn)化分析的數(shù)據(jù)集由四部分組成，包括用于基礎(chǔ)比對分析的AIV 參考序列、385 條H5 亞型AIV 核苷酸參考序列、1 300 條基于氨基酸序列分析的參考序列和對分支或亞分支進(jìn)行描述的數(shù)據(jù)集。H5亞型AIV 核苷酸參考序列的選擇參照流感研究數(shù)據(jù)庫（The Influenza Reasearch Database，IRD）的H5分支分類工具[6]，并補(bǔ)充新型亞分支的參考序列，如2.3.4.4a～2.3.4.4h、2.3.2.1d～2.3.2.1f；基于氨基酸序列分析的參考序列和對分支或亞分支描述的數(shù)據(jù)集，參照文獻(xiàn)[7]構(gòu)建。

1.2 軟件創(chuàng)建

基于以上數(shù)據(jù)集，設(shè)計出相應(yīng)的運算邏輯，使用Perl 語言集成Blast、Muscle、Phylip 等軟件和工具包，編寫程序語言，并轉(zhuǎn)變?yōu)榫W(wǎng)絡(luò)在線版界面。

1.2.1 AIV 基因生物特性分析與注釋 通過比對分析來獲知查詢序列攜帶哪些重要的基因突變，以及這些突變的生物學(xué)意義。用戶輸入FASTA 格式的AIV 核苷酸序列或氨基酸序列，系統(tǒng)將調(diào)用Blast 軟件，與生物特性分析數(shù)據(jù)集的參考序列進(jìn)行同源性搜索，將最佳比對氨基酸序列的翻譯產(chǎn)物作為輸入序列編碼的預(yù)測蛋白。輸出的分析結(jié)果包括查詢序列的病毒片段/亞型、相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和功能及位點突變的生物學(xué)意義等信息。生物特性分析邏輯運算的設(shè)計，充分考慮了AIV 部分基因片段（MP 和NS）的剪接機(jī)制，同時能夠處理由于缺失導(dǎo)致讀碼框漂移的核苷酸序列。

1.2.2 AIV 基因遺傳進(jìn)化分析與進(jìn)化樹展示 通過構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹來定位查詢序列屬于哪個譜系、分支或亞分支，了解病毒變異情況，預(yù)測新型或未知AIV 的進(jìn)化關(guān)系。用戶輸入FASTA 格式的AIV 核苷酸序列或氨基酸序列，系統(tǒng)將調(diào)用Blast軟件，與遺傳進(jìn)化分析數(shù)據(jù)集進(jìn)行序列同源比對；再根據(jù)比對結(jié)果調(diào)用Muscle（multiple sequence comparison by logexpectation）軟件來進(jìn)行同一基因或亞型的多序列比對；通過Phylip 軟件，采用鄰接算法（Neighbor-joining method）對集成的多序列比對結(jié)果進(jìn)行進(jìn)化樹繪制。遺傳進(jìn)化分析融合了兩個分支分類的命名系統(tǒng)：一是基于H5 亞型HA基因核苷酸序列差異的統(tǒng)一命名準(zhǔn)則，二是基于氨基酸序列差異的分支和亞分支命名系統(tǒng)。按照以下方案進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析：（1）用戶輸入的核苷酸序列若為H5 亞型HA 基因，則直接與H5 亞型AIV 核苷酸參考序列進(jìn)行多序列比對，繪制遺傳進(jìn)化樹；（2）若輸入的核苷酸序列不是H5 亞型HA基因，則將用戶的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，并與相應(yīng)基因或亞型的氨基酸參考序列進(jìn)行多序列比對，繪制遺傳進(jìn)化樹；（3）若輸入的序列為氨基酸序列，則與相應(yīng)基因或亞型的氨基酸參考序列進(jìn)行多序列比對，繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 FluSoft 軟件網(wǎng)頁界面

構(gòu)建形成的一體化AIV 基因分析軟件，具有中英文兩種界面。頁面內(nèi)容包含軟件的創(chuàng)建單位、簡要應(yīng)用說明和操作界面。用戶只需要輸入序列、指明序列類型、選擇分析類型，即可實現(xiàn)基于Web訪問的AIV 基因序列批量分析、注釋、可視化展示及下載等功能（圖1）。

圖1 FluSoft 主頁界面

2.2 AIV 基因序列生物特性分析與注釋

用戶在Web 頁面粘貼或上傳單條或多條FASTA 格式的AIV 核苷酸或氨基酸序列，依次選擇序列類型、“生物特性分析”，提交后系統(tǒng)將調(diào)用Blast 軟件，與生物特性分析數(shù)據(jù)集進(jìn)行同源性比對。在結(jié)果中將得到查詢序列的病毒基因片段/亞型、參考序列名稱、與參考序列的比對結(jié)果、突變的生物學(xué)意義及生物特性意義的文獻(xiàn)PMID 唯一標(biāo)識碼（圖2）。針對H5 和H7 亞型，進(jìn)一步展示其HA 基因裂解位點氨基酸序列及堿性氨基酸個數(shù)。此部分對于用戶輸入的核苷酸序列要求沒有那么嚴(yán)格，軟件能夠處理由于缺失導(dǎo)致讀碼框漂移的核苷酸序列。

圖2 生物特性分析輸出結(jié)果

2.3 AIV 基因序列遺傳進(jìn)化分析與進(jìn)化樹展示

用戶在Web 頁面粘貼或上傳單條或多條FASTA 格式的AIV 核苷酸或氨基酸序列，依次選擇序列類型、基因或亞型、“遺傳進(jìn)化分析”，提交后系統(tǒng)將調(diào)用Muscle、Phylip 等軟件、工具包和數(shù)據(jù)集，繪制進(jìn)化樹。在新窗口中輸出得到查詢序列的亞型或基因片段、與之最密切相關(guān)的譜系/分支及對該譜系/分支的描述、用Phylip 軟件制作的無根樹（圖3）。用戶可以在線查看進(jìn)化樹，也可以下載.tre 文件，用MEGA 等軟件打開或編輯。

圖3 遺傳進(jìn)化分析輸出結(jié)果

H5 亞型HA 基因遺傳進(jìn)化分析的命名系統(tǒng)，是基于H5 亞型HA 基因核苷酸序列差異的統(tǒng)一命名準(zhǔn)則制定的。由于H5 亞型HA 基因的氨基酸進(jìn)化樹和核苷酸進(jìn)化樹不完全一致，建議用戶分析H5 亞型HA 基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系時，使用核苷酸序列進(jìn)行分析。而其他亞型或基因片段遺傳進(jìn)化分支分類，是基于氨基酸序列的命名系統(tǒng)制定的，因此當(dāng)進(jìn)行除H5 亞型以外的核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析時，需要用戶確保輸入的核苷酸序列位于開放閱讀框內(nèi)，并且從第一個堿基開始可以正確翻譯，使之匹配對應(yīng)的氨基酸序列。

3 討論

AIV 是嚴(yán)重影響全球家禽養(yǎng)殖及野鳥健康的病原體之一。病毒的基因序列分析是疫病診斷和監(jiān)測的重要內(nèi)容，也是分析疫情發(fā)展態(tài)勢、評估風(fēng)險和更新疫苗毒株的重要依據(jù)。目前，國內(nèi)外AIV的基因序列分析，大多需要閱讀大量的文獻(xiàn)并開展復(fù)雜的手工運算。為簡化這一過程，國際上已經(jīng)開發(fā)出多個AIV 分析軟件。IBD 是為AIV 研究提供信息支持的生物信息學(xué)資源中心，可為用戶提供序列及其它相關(guān)數(shù)據(jù)的分析和可視化展示，具有預(yù)測新變異蛋白、注釋相關(guān)表型序列、自動轉(zhuǎn)換HA 亞型編號、H5 分支分類等功能，是重要的流感研究數(shù)據(jù)信息平臺，然而其H5 分支的分類數(shù)據(jù)已經(jīng)有4年未進(jìn)行更新。FLAN 是NCBI 用于AIV 基因組注釋的Web 服務(wù)器[8]，可提供A 型和B 型AIV 的序列預(yù)測，輸出預(yù)測蛋白序列、輸入序列長度、病毒類型、片段和亞型等信息，但其輸出結(jié)果過于簡單，不能滿足系統(tǒng)化和一體化的信息要求。Flusurver 是GISAID 流感數(shù)據(jù)庫提供的分析AIV變異問題的軟件，但該軟件很多時候受國際帶寬瓶頸的影響而無法登陸。本研究開發(fā)的基于Web 服務(wù)的AIV 基因分析軟件FluSoft，是業(yè)內(nèi)首個可視化AIV 基因分析軟件，具有簡單、高效、全面、無國際寬帶瓶頸限制和對用戶友好等特點，為我國從事禽流感調(diào)查監(jiān)測的基層動物疫病控制人員和開展禽流感研究的科研人員提供了高效的分析工具，有效提升了數(shù)據(jù)的分析效率。

關(guān)于AIV 的譜系/分支命名，國際上僅對全球比較關(guān)注的H5 亞型HPAIV HA 基因核苷酸的遺傳進(jìn)化有統(tǒng)一命名標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，其他基因或亞型沒有統(tǒng)一的命名標(biāo)準(zhǔn)。2019年本實驗室根據(jù)AIV 2 個外部基因（HA 和NA）和6 個內(nèi)部基因（PB2、PB1、PA、NP、MP 和NS）構(gòu)建大進(jìn)化樹，依據(jù)進(jìn)化樹的拓?fù)鋵W(xué)規(guī)則以及病毒的宿主、時間和空間分布特征及現(xiàn)實必要性，提出了基于蛋白質(zhì)序列的全新分支和亞分支命名系統(tǒng)。因此，F(xiàn)luSoft 的遺傳進(jìn)化分析融合了兩個命名系統(tǒng)。未來隨著AIV的不斷變異和進(jìn)化，研究成果的不斷呈現(xiàn)，我們也將根據(jù)國際和國內(nèi)禽流感監(jiān)測的最新研究成果，及時補(bǔ)充更新關(guān)鍵數(shù)據(jù)集，從而不斷適應(yīng)AIV 基因組大數(shù)據(jù)分析的需求。

目前，候鳥傳播引發(fā)的禽流感疫情在全球多個國家頻發(fā)，病毒溢出感染人和其他哺乳動物的事件時有發(fā)生，而AIV 是人類最難以預(yù)測和預(yù)防的病毒之一，時刻在不同物種間發(fā)生變異和重組，產(chǎn)生新的毒株。因而需要在同一健康的思路下，綜合考慮人、動物、環(huán)境，時刻保持警惕，加強(qiáng)監(jiān)測，做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)警。FluSoft 為禽流感的監(jiān)測和研究提供了強(qiáng)有力的先進(jìn)工具。