鴨坦布蘇病毒E 蛋白Domain III 單克隆抗體膠體金試紙條的創(chuàng)制及應用

闞瑩，張淼，盧奇，呂炫，于勝祖，王習強，姜雅倩，王蓓，朱英奇，王晴，王桂軍

（安徽農業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥 230036）

鴨坦布蘇病毒病是由黃病毒屬鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus，DTMUV）引起的一種禽類傳染病，主要導致病鴨出現(xiàn)精神沉郁、產蛋下降、四肢麻痹、共濟失調等臨床癥狀[1-2]。隨著DTMUV 疫苗的上市，鴨坦布蘇病毒病目前主要在我國養(yǎng)禽地區(qū)呈散在點狀暴發(fā)態(tài)勢[3]。盡管鴨坦布蘇病毒病未有大規(guī)模暴發(fā)趨勢，但越來越多的研究報道發(fā)現(xiàn)新的DTMUV 突變毒株。相較于以往的流行毒株，新發(fā)現(xiàn)的DTMUV 突變株在禽類中的致病性更強[4]，同時其感染宿主范圍也在進一步擴大，在雞、鵝等禽類中也發(fā)現(xiàn)了DTMUV[5]。因此，針對鴨坦布蘇病毒病的預防和控制仍需要持續(xù)關注。

目前針對鴨坦布蘇病毒病主要以預防和監(jiān)測為主。常用的DTMUV 檢測方法比較耗時耗力，診斷效率不高[6]。因此需要建立一種特異性強、靈敏度高，能快速檢測DTMUV 的方法，以滿足臨床樣本檢測的需要[7]。膠體金免疫層析是以膠體金為標記物，利用抗原抗體反應的專一性而衍生的一種快速檢測方法[8-9]。該方法具有檢測效率高、安全性好、敏感性與特異性強、經(jīng)濟實用等優(yōu)點，可用于DTMUV 的快速診斷[10]。囊膜蛋白（E 蛋白）是黃病毒的重要結構蛋白之一，其第三個結構域（Domain III）包含很多中和表位，是抗體結合區(qū)域，可以阻止黃病毒與其宿主細胞受體結合，同時也是檢測該病毒特異性抗體的靶抗原，對于黃病毒病的控制及其診斷試劑開發(fā)具有重要作用[11-12]。

本研究以 DTMUV 重組 E 蛋白Domain III 為免疫原制備的兩株單克隆抗體為基礎，以純化的B9D7B8G10 株抗DTMUV 單克隆抗體作為標記抗體，純化的B9D10C7 株單克隆抗體作為檢測抗體，山羊抗小鼠IgG 作為對照，構建一種雙抗夾心DTMUV 膠體金免疫層析試紙條。隨后對試紙條敏感性、特異性，重復性和穩(wěn)定性進行檢驗，并利用RT-PCR 方法與建立的試紙條方法對200 份疑似DTMUV 感染的鴨外周血和組織樣品進行檢測比較，探究試紙條的準確性。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

DTMUV AH-F10 株、番鴨細小病毒（muscovy duck parvoriru，MDPV）、禽白血病病毒（avian leucosis virus，ALV）、鴨瘟病毒（duck plague virus，DPV）、鵝星狀病毒（goose astrovirus，GAstV），均由獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室保存；分泌抗DTMUV 單克隆抗體的雜交瘤細胞B9D10C7 及B9D7B8G10，由獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室保存。

rProtein G 親和層析凝膠、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG，均購自北京索萊寶科技有限公司；四氯金酸，購自北京伊諾凱科技有限公司；試紙條組裝材料，購自杭州布陸斯貿易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體金溶液制備 在錐形瓶中加入100 mL超純水和磁性攪拌粒子，然后加入1.0 mL 1%的HAuCl4溶液，攪拌均勻后，開啟加熱模式煮至沸騰；一次性加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液；加熱至溶液變?yōu)榫萍t色后，繼續(xù)煮10 min；冷卻后加超純水定容至100 mL，4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆?。通過分光光度計檢測吸收峰的變化。

1.2.2 單克隆抗體純化與鑒定

1.2.2.1 單克隆抗體純化 選取8 周齡BALB/c雌性小鼠，隨機分為2 組，腹腔注射已滅菌的液體石蠟；間隔7 d 后，每組分別腹腔注射適量分泌抗DTMUV 單克隆抗體的B9D10C7 株和B9D7B8G10株雜交瘤細胞懸液；每日觀察小鼠狀態(tài)，7 d 左右小鼠腹部明顯膨大時，立即收取小鼠腹水；利用rProtein G 親和層析凝膠，對制備的兩株單克隆抗體腹水進行純化，并進行SDS-PAGE 檢測；最后將純化后的單克隆抗體在PBS 中透析，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定濃度。

1.2.2.2 單克隆抗體Western Blot（WB）鑒定 對純化的兩株單克隆抗體進行WB 檢測，取10 μL 純化的單克隆抗體進行SDS-PAGE，隨后轉0.22 μm PVDF 膜，轉膜結束后將PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉的TBST 中封閉；封閉結束后洗滌，將PVDF膜置于1:2 000 稀釋的HRP 標記山羊抗小鼠IgG中，室溫孵育1 h；孵育結束后，再洗滌3 次，按照DAB 顯色試劑盒說明書對其進行顯色觀察。

1.2.2.3 單克隆抗體IFA 鑒定 將BHK-21 細胞鋪到6 孔細胞板中，待細胞密度約為80%時，以MOI=0.1 DTMUV 病毒液孵育2 h，棄去病毒孵育液更換維持培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2中培養(yǎng)48 h后棄去維持液，用預冷的甲醛固定細胞；將純化后的兩株單克隆抗體作為一抗，孵育后加入FITC 標記的山羊抗小鼠IgG，DAPI 核染，熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.3 膠體金探針制備

1.2.3.1 最佳結合pH 確定 在9 管EP 管中分別加入1 mL 膠體金溶液，第1 管為空白對照，其余8 管分別加入1、3、5、7、9、11、13、15 μL 的0.2 mol/L K2CO3溶液調節(jié)pH；加入20 μL 純化后的B9D7B8G10 株單克隆抗體，混勻后4 ℃靜置15 min；加入100 μL 10%的NaCl 溶液，混勻后4 ℃靜置3 h，觀察溶液顏色變化，通過分光光度計檢測吸收峰變化。

1.2.3.2 最佳抗體用量確定 在9 管EP 管中分別加入1 mL 膠體金溶液，第1 管作為空白對照，用0.2 mol/L K2CO3溶液調節(jié)至最佳pH。按表1 所示，加入純化后的B9D7B8G10 株單克隆抗體，4 ℃條件下反應15 min；每管再分別加入100 μL 10%的NaCl 溶液，混勻后4 ℃靜置3 h；觀察溶液顏色變化，通過分光光度計檢測吸收峰變化。

表1 膠體金標記單抗最佳抗體用量

1.2.3.3 膠體金探針制備及純化 在錐形瓶中加入10 mL 膠體金溶液，再加入0.2 mol/L K2CO3溶液調至最佳pH，混勻后加入適量純化后的單克隆抗體B9D7B8G10 攪拌30 min，再加入適量的10%BSA 溶液攪拌20 min，最后加入適量的10% PEG-20000 溶液攪拌10 min；將溶液等量分裝于潔凈的EP 管中，4 ℃條件下離心，2 000 r/min，10 min；離心后吸取上清，在4 ℃條件下離心，9 000 r/min，30 min，棄去上清；每管加入1 mL 0.01mol/L pH 8.0 的Tris-HCl 溶液，4 ℃條件下離心，9 000 r/min，30 min；保留沉淀，重復上一步，最后將留存沉淀用100 μL 0.01 mol/L pH 8.0 的Tris-HCl 混勻，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 膠體金試紙條制備 將膠體金探針均勻鋪在玻璃纖維素膜上，在NC 膜T 線位置包被純化后的B9D10C7 株單克隆抗體，C 線位置包被山羊抗小鼠IgG；按順序組裝試紙條，在樣品孔分別滴加150 μL PBS 以及感染DTMUV 的BHK-21 細胞培養(yǎng)上清液，靜置15 min，觀察結果。

1.2.5 膠體金試紙條特性試驗

1.2.5.1 敏感性試驗 將感染DTMUV 的BHK-21 細胞培養(yǎng)上清液分別按照1:10、1:50、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500 比例稀釋，每個試紙條滴加150 μL 稀釋后樣品檢測。

1.2.5.2 特異性試驗 將實驗室保存的DTMUV、MDPV、DPV、ALV、GAstV 稀釋后離心取上清，在樣品孔滴加150 μL 樣品檢測。

1.2.5.3 重復性試驗 取不同批次制備的膠體金試紙條，在每個試紙條樣品孔滴加150 μL 陽性樣品檢測。

1.2.5.4 穩(wěn)定性試驗 將包裝好的膠體金試紙條分別存放于4 ℃和37 ℃，分別于不同時間取出，每個膠體金試紙條樣品孔滴加150 μL 陽性樣品檢測。

1.2.6 膠體金試紙條臨床應用 利用本研究制備的試紙條，對200 份疑似DTMUV 感染的鴨外周血和組織樣品反復凍融，離心后，每孔滴加150 μL 樣品進行檢測，并與RT-PCR 方法作比較，探究試紙條的準確性。

2 結果

2.1 膠體金溶液鑒定

通過檸檬酸三鈉還原法得到膠體金溶液如圖1-A 所示，顏色為酒紅色，質地均一，液面上無油狀物質；經(jīng)分光光度計檢測，膠體金溶液在520 nm 處出現(xiàn)單一的吸收峰（圖1-B）。

圖1 膠體金溶液及400～700 nm 波段間的吸光曲線

2.2 單克隆抗體鑒定

2.2.1 單克隆抗體純化 純化結果（圖2）顯示，純化后兩株單克隆抗體均在目標區(qū)域處有特異性條帶出現(xiàn)，表明其純化效果較好。經(jīng)儀器檢測后，B9D10C7 株單克隆抗體純化后質量濃度為1.32 mg/mL，B9D7B8G10 株單克隆抗體為0.17 mg/mL。

圖2 純化后的兩株DTMUV 單克隆抗體SDS-PAGE 分析結果

2.2.2 單克隆抗體WB 鑒定 鑒定結果（圖3）顯示，兩株純化后單克隆抗體均可產生特異性條帶，可用于后續(xù)膠體金試驗。

圖3 純化后的兩株DTMUV 單克隆抗體WB 分析結果

2.2.3 單克隆抗體IFA 鑒定 鑒定結果（圖4）顯示，試驗組能觀察到特異性的綠色熒光，而對照組無熒光，表明兩株單克隆抗體反應原性較好，能夠識別DTMUV 的天然E 蛋白，可用于后續(xù)制備膠體金試驗。

圖4 純化后的兩株DTMUV 單克隆抗體IFA 檢測結果

2.3 膠體金探針制備

2.3.1 最佳結合pH 試驗結果顯示，與原液相比，在K2CO3最低加入量為5 μL 時，溶液顏色保持紅色（圖5-A）；經(jīng)分光光度計測量，當加入K2CO3量為5 μL 時，溶液的吸光值在波長524 nm 時最大，為0.591 5（圖5-B）。綜合考慮膠體金溶液最佳標記pH 的條件為0.2mol/L K2CO3溶液加入量5 μL。

圖5 單克隆抗體與膠體金最佳結合pH 試驗結果

2.3.2 最佳抗體用量 試驗結果顯示，與原液相比，在單克隆抗體最低加入量為3.5 μg 時，溶液顏色保持紅色（圖6-A）；經(jīng)分光光度計測量，當抗體加入量為4.2 μg 時，溶液的吸光值在波長為524 nm 時最大，為0.599 2（圖6-B）。綜合考慮膠體金溶液最佳標記抗體用量為4.2 μg/mL。

圖6 單克隆抗體與膠體金結合最佳抗體用量試驗結果

2.3.3 膠體金探針制備及純化 將保存的膠體金探針過夜取出，結果發(fā)現(xiàn)，膠體金溶液顏色保持不變，性狀穩(wěn)定（圖7-A）；通過分光光度計檢測發(fā)現(xiàn)，膠體金溶液OD 值增大，吸收峰明顯右移（圖7-B）。結果說明純化后的B9D7B8G10 株單克隆抗體成功標記在膠體金顆粒表面。

圖7 純化的膠體金探針及在400～700 nm 波段的吸光曲線

2.4 膠體金試紙條初步組裝及鑒定

初步組裝的試紙條鑒定結果如圖8 所示，感染DTMUV 的BHK-21 細胞培養(yǎng)上清液在試紙條檢測線（T 線）、質控線（C 線）均呈現(xiàn)紅色條帶，而PBS 僅C 線有紅色條帶，說明試紙條制備成功。

圖8 膠體金免疫層析試紙條鑒定結果

2.5 試紙條特性試驗

2.5.1 敏感性試驗 該試紙條在DTMUV 細胞病毒1:50 稀釋時，在C 線和T 線均出現(xiàn)紅色條帶（圖9），說明該試紙條具有良好的敏感性。

圖9 試紙條敏感性試驗結果

2.5.2 特異性試驗 結果（圖10）顯示，僅滴加DTMUV 的試紙條呈陽性結果，其他病毒檢測均為陰性結果，說明該試紙條具有較強的特異性。

圖10 試紙條特異性試驗結果

2.5.3 重復性試驗 選出不同批次試紙條檢測感染DTMUV 的BHK-21 細胞上清，結果發(fā)現(xiàn)不同批次試紙條檢測均呈陽性（圖11），說明該試紙條具有較好的重復性。

圖11 試紙條重復性試驗結果

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 將包裝好的膠體金試紙條分別存放于4 ℃和37 ℃，于不同時間取出用來檢測感染DTMUV 的BHK-21 細胞上清，結果均呈陽性（圖12），說明該試紙條具有較好的穩(wěn)定性。

圖12 試紙條穩(wěn)定性試驗結果

2.5.5 膠體金試紙條與RT-PCR 方法比較 利用制備的試紙條與RT-PCR 方法對200 份疑似DTMUV 感染的鴨外周血和組織樣品進行檢測。結果（表2）顯示，試紙條檢出陽性30 份、陰性170份，PCR 檢出陽性34 份、陰性166 份，兩者符合率為98%（196/200）。

表2 PCR 與試紙條檢測臨床樣品結果比較 單位：份

3 討論

DTMUV 是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病病原之一，對其進行快速檢測仍然是防控鴨坦布蘇病毒病的有效方法[13]。近年來，DTMUV 宿主范圍不斷擴大，不僅在動物身上分離到病原，在養(yǎng)鴨場管理人員體內也曾發(fā)現(xiàn)該病毒的RNA，因而DTMUV 可能對我國公共衛(wèi)生安全造成一定威脅[14]。同時DTMUV 在感染宿主的過程中，毒力也在不斷增強，尤其是變異株的出現(xiàn)，更加大了我國對于該病防控的難度[15-16]。

DTMUV 主要抗原蛋白（E 蛋白）編碼區(qū)的基因序列與其他禽源DTMUV 同源性較高[16]，提示我國流行的黃病毒病均由同一基因型的DTMUV引起。同時E 蛋白是誘導保護性免疫的主要抗原，而本實驗室制備的兩株單克隆抗體能特異性識別DTMUV 的E 蛋白，是建立DTMUV 檢測方法的靶蛋白。建立快速診斷方法有利于及早發(fā)現(xiàn)疫病，控制疫病帶來的損失[17]。當前對于DTMUV 的常規(guī)檢測方法都比較費時費力，診斷效率低，不利于疫病的快速診斷[18]。膠體金免疫層析技術具有檢測效率高、特異性與敏感性好、實用性高等優(yōu)點，非常適用于疫病的快速診斷[19]。

膠體金免疫層析技術是20 世紀20年代興起的一種免疫學檢測方式[20]。膠體金溶液是利用四氯金酸溶液在還原劑的作用下生成大小不等的金顆粒，而金顆粒可以與多種凝集素、酶、核酸、毒素、磷酸鹽化合物等生物大分子物質結合，形成探針[21-22]。因膠體金探針的形成是通過靜電吸附作用，因而不會喪失標記物活性，在免疫標記中被用作示蹤劑[23]。1961年Palade 首先將膠體金用作檢測毛細血管通透性的超微結構示蹤劑，此后膠體金在受體和示蹤劑方面運用越來越廣泛[24]。與其他方法相比，運用膠體金探針制備的膠體金試紙條特異性高，穩(wěn)定性好，結果易判斷[25]。在實際應用中，膠體金免疫層析試紙條已被廣泛應用于各種細菌、病毒、寄生蟲檢測以及毒品、食品檢測等[26-27]。

本研究利用純化的兩株DTMUV 單克隆抗體分別作為標記抗體與捕獲抗體，山羊抗小鼠IgG作為對照，構建了檢測DTMUV 的膠體金免疫層析試紙條。試驗結果表明制備的膠體金試紙條只能特異性檢測DTMUV，不與MDPV、DPV、ALV、GAstV 等病原發(fā)生交叉反應，在4 ℃與37 ℃各保存3 個月，檢測DTMUV 仍有效，制作的不同批次試紙條都可以檢測到病毒，說明制備的試紙條敏感性高，特異性強，穩(wěn)定性與重復性好。

雖然RT-PCR 方法比較費時費力，但其靈敏度高，特異性好，是檢測DTMUV 的最常用方法。為了探究制備試紙條檢測臨床樣本的準確性，利用RT-PCR 方法與試紙條同時對200 份臨床DTMUV疑似感染樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)兩者符合率較高，證明制備的試紙條可以用于DTMUV 檢測，從而為DTMUV 快速檢測提供了有效工具。