豬源肺炎克雷伯菌熒光定量PCR 檢測方法的建立與應用

郭學波，邱振乾，張超，戰(zhàn)爽，吳瑤

1.漢唐和元（武漢）科技有限公司，湖北武漢 430070；

2.宜城市動物疫病預防控制中心，湖北宜城 441400）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）屬于革蘭氏陰性菌，為腸桿菌科成員，對多種動物致病，是重要的醫(yī)源性感染菌之一[1]。研究表明，醫(yī)源性Kp 與動物源性Kp 親緣關系較近，攜帶的毒力因子大致相同[2-4]，但后者具有較強的耐藥性和致病性[5]。Kp 的莢膜與致病力有關。當宿主免疫力降低時，Kp 能引起人呼吸道、泌尿道感染，有時可導致嚴重的腹膜炎、腦膜炎，甚至敗血癥[6-7]，尤其易引起兒童肺炎；此外，也可引起牛乳腺炎[8]、母馬子宮炎[9]、新生仔豬敗血癥等疾病，導致極高的致病率和死亡率[10-11]。

目前，Kp 常用的檢測方法有細菌分離鑒定、生化試驗、動物致病性試驗等，但這些方法均存在靈敏度較低、檢測耗時較長及費用較高等問題，因此建立一種快速準確靈敏的檢測方法已成為迫切需要。研究[12]表明，Khe基因具有溶血素活性，是Kp 高度保守且特異的基因序列，目前僅發(fā)現(xiàn)于Kp中。以Khe基因為靶標進行流行病學檢測，已應用于牛源Kp。本研究以Khe基因為靶標，建立了豬源Kp 的熒光定量PCR 快速檢測方法，以期為豬群肺炎克雷伯菌病的臨床診斷及防控提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株與臨床樣品 大腸桿菌標準株（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌標準株（ATCC29213）、化膿性鏈球菌標準株（ATCC19615），由杭州天和微生物試劑有限公司提供；豬源Kp、豬2 型鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬壞死桿菌、豬細胞內(nèi)勞森菌、豬丹毒桿菌，由華中農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)學實驗室提供；25 份肺炎癥狀病料，由湖北省各發(fā)病豬場送檢；115 份鼻咽拭子樣品，采自湖北省武漢市、宜城市、黃石市屠宰場。

1.1.2 主要儀器與設備 美國伯樂CFX96 PCR儀，西安天隆TL988 全自動PCR 分析系統(tǒng)，日本松下SANYO MIR-554-PC 恒溫培養(yǎng)箱，德國Eppendorf Centrifuge 5425R 高速冷凍離心機，英國Biochrom 超微量核酸/蛋白分析儀，武漢新縱科DS1000 Tissue Cell-destroyer 高效組織細胞樣品處理系統(tǒng)，上海申安LDZM-60KCS 全自動高壓蒸汽滅菌鍋。

1.1.3 主要試劑與耗材 麥康凱（MAC）培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基，購自Oxoid 公司；Taq酶、UNG 酶、酶稀釋液、膠回收試劑盒、細菌基因組DNA 提取試劑盒，購自武漢晟亞生物科技有限公司；腸桿菌科生化鑒定試劑盒，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 引物及探針設計 參考多株GenBank 上公布的豬源KpKhe基因序列，分析選定高度保守區(qū)域。利用Primer Express 3.0 和Beacon Designer 8軟件分別設計引物和探針，送至武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成（表1）。

表1 引物和探針序列

1.2 方法

1.2.1 陽性標準品制備 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取Kp DNA。通過PCR 擴增Khe基因，經(jīng)電泳鑒定目的片段大小正確后，回收并純化目的片段，連接至pUC18-T 載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞；測序結(jié)果與預期相符的作為陽性菌種，提取質(zhì)粒作為陽性質(zhì)粒，命名為pUC-Khe；采用超微量核酸分析儀測定陽性質(zhì)粒的濃度和純度，換算為拷貝數(shù)；對陽性質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，作為陽性標準品。

1.2.2 反應體系與擴增條件 以陽性質(zhì)粒pUC-Khe為模板，在熒光定量PCR 儀上依照反應體系進行反應。反應體系：2 × qPCR Mix 12.5 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，KheF00A（5 μmol/L）和KheR00A（5 μmol/L）各1.0 μL，KheP00A（2.5 μmol/L）1.0 μL，模板2.0 μL，雙蒸水補至總反應體系25.0 μL。PCR 反應條件：UNG 酶50 ℃活化2 min；Taq酶95 ℃活化5 min；95 ℃15 s，58 ℃ 30 s（收集熒光），共40 個循環(huán)。

1.2.3 標準曲線建立及靈敏性試驗 根據(jù)陽性質(zhì)粒實際濃度測定值，將pUC-Khe稀釋至拷貝數(shù)濃度為1.0×l07～1.0×103copies/μL 進行擴增反應，繪制標準曲線；建立標準曲線后，將pUC-Khe稀釋至拷貝數(shù)濃度為1.0×108～l.0×101copies/μL 進行熒光定量PCR 反應，確定該方法的最低檢測限。

1.2.4 特異性試驗 提取大腸桿菌標準株（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌標準株（ATCC29213）、化膿性鏈球菌標準株（ATCC19615）及豬2 型鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬壞死桿菌、豬細胞內(nèi)勞森菌、豬丹毒桿菌核酸，采用建立的熒光定量PCR 方法進行擴增，同時使用pUC-Khe質(zhì)粒為陽性對照，無菌無酶水為陰性對照，評價該方法的特異性。

1.2.5 重復性試驗 分別取同批次提取的4 份等量Kp DNA，按上述反應體系與擴增條件進行熒光定量PCR 檢測，每份樣品重復5 次，進行批內(nèi)重復性試驗；分別取3 個不同批次提取的4 份等量Kp DNA，在完全相同的反應條件與體系下進行熒光定量PCR 檢測，進行批間重復性試驗。每次試驗均彼此獨立，互不影響。

1.2.6 臨床樣品檢測 采用本研究建立的熒光PCR 方法和細菌分離鑒定方法，對25 份豬肺臟樣品病料及115 份豬鼻咽拭子樣品進行同步檢測，比較2 種方法的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 陽性標準品制備

選擇1.5%瓊脂糖凝膠進行PCR 產(chǎn)物電泳。結(jié)果（圖1）顯示，目的片段大小為257 bp，與預期大小相符。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)測序驗證，與預期目的基因序列相符，表明成功構(gòu)建陽性質(zhì)粒。

圖1 陽性質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

2.2 標準曲線建立及靈敏性試驗

采用建立的方法檢測系列稀釋的陽性質(zhì)粒，以水作為陰性對照。根據(jù)Ct 結(jié)果，建立標準曲線。結(jié)果顯示，當陽性質(zhì)粒的拷貝數(shù)濃度為1.0×l07～1.0×103copies/μL 時，模板濃度與檢測Ct值之間具有良好的線性關系（R2=0.995 9）（圖2）；當陽性質(zhì)粒濃度為101copies/μL 時，仍可見明顯擴增曲線（圖3）。

圖2 標準曲線

圖3 靈敏性試驗結(jié)果

2.3 特異性試驗

采用建立的方法檢測相關菌株的陽性核酸，以pUC-Khe為陽性對照，水為陰性對照（所有樣品均進行3 次重復試驗）。結(jié)果（圖4）顯示，對照菌株及陰性對照在反應中均無熒光信號出現(xiàn)，而陽性質(zhì)粒pUC-Khe具有較好的擴增動力學曲線，表明本方法特異性較強。

圖4 特異性試驗結(jié)果

2.4 重復性試驗

結(jié)果（表2）顯示，批內(nèi)變異系數(shù) 為0.54%～1.13%，批間變異系數(shù)為0.37%～1.27%，均不超過2%，表明該檢測方法具有較好的重復性。

表2 重復性試驗結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

結(jié)果（表3）顯示，在140 份待檢病料中，建立的熒光定量PCR 方法檢測出陽性31 份，陽性率為22.14%；細菌分離鑒定方法檢測出陽性27 份，陽性率為19.29%。相比可知，熒光定量PCR 方法的陽性檢出率高于細菌分離鑒定方法。

表3 兩種方法檢測臨床樣品結(jié)果比較

3 討論

針對Kp 的流行病學研究，目前多集中在人醫(yī)領域。對其耐藥性與致病性進行討論，其主要目的是為臨床用藥提供指導[13-15]。動物源性Kp 的流行病學研究相對較少，并且主要為牛源。豬源Kp 的研究大多集中于分離鑒定，有部分研究進行了分子生物學特性分析及流行病學調(diào)查。左偉等[16]對西藏林芝地區(qū)的60 份藏豬腹瀉糞便樣本進行Kp分離與生物學特性研究，結(jié)果分離出3 株藏豬源Kp，分離率為5%；李雪嵩[17]對吉林省部分規(guī)?；B(yǎng)豬場疑似受Kp 感染的病料進行致病性及致病基因分子生物學檢測，結(jié)果所有分離株都攜帶Khe基因；董萌萌等[18]對河南省疑似Kp 感染病例進行確診，其基因同源性與Kp 參考株均在98%以上。

目前動物源性Kp 常用的檢測方法有細菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化試驗以及動物致病性試驗等，但這些檢測方法都需對細菌進行培養(yǎng)。一方面對檢測場所的設施、環(huán)境、儀器以及人員有了更高的要求，另一方面增加了生物安全防護風險。近年來也有一些新的檢測方法，如付霞麗等[19]的16S rRNA 基因PCR 擴增，梁慧賢等[20]的全基因組測序等，但這些方法大都限于實驗室研究，未能推廣到養(yǎng)殖行業(yè)的現(xiàn)實應用中。本研究建立的熒光定量PCR 檢測方法，相比微生物學方法減少了二次污染的風險，并且檢出率更高；相比其他分子生物學方法，靈敏度更高，結(jié)果可直接觀察。本方法特異性強，能有效檢出Kp 分離株，并且和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、豬2 型鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬壞死桿菌、豬細胞內(nèi)勞森菌和豬丹毒桿菌等其他病原無交叉反應；靈敏度高，最低檢測限為10 copies/μL；重復性好，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于2%。經(jīng)過臨床樣本檢測驗證，本方法的陽性檢出率高于細菌分離鑒定方法，說明本方法具有較好的應用價值，能夠用于豬群肺炎克雷伯菌病的診斷和防治。