貓?jiān)粗夤軘⊙ㄊ暇姆蛛x與鑒定

沈莉萍，徐鋒，王曉旭，齊新永，王建

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

支氣管敗血波氏菌（Bordetella bronchiseptica，B.bronchiseptica）可引起許多哺乳動(dòng)物呼吸道疾病，是貓?jiān)l(fā)細(xì)菌性呼吸道疾病病原之一。臨床健康貓群中的支氣管敗血波氏菌流行率為1%～10%，在具有呼吸道癥狀貓群中的分離率為21%[1]。但目前國內(nèi)關(guān)于豬、兔感染該菌的報(bào)道很多，而從貓上分離到該菌的報(bào)道很少。這可能是該菌常與其他呼吸道病原，如貓杯狀病毒、貓皰疹病毒、貓衣原體、貓支原體等發(fā)生混合或繼發(fā)感染，再加上上呼吸道內(nèi)雜菌多，菌含量少，因而忽視了對(duì)該菌的檢測(cè)。管飄萍等[2]報(bào)道，在貓鼻腔拭子樣品分離到該菌需6 d 時(shí)間；Van den Bossche等[3]報(bào)道，從病人的氣管吸出物、支氣管肺泡液、鼻咽吸出物等分離該菌也需4 d 以上。這說明該菌分離時(shí)間較長，分離較困難。2021年7 月，上海市一寵物診所接診了1 只6 月齡有咳嗽癥狀的德文貓，采集鼻拭子樣品進(jìn)行病原檢測(cè)，結(jié)果成功分離到1 株支氣管敗血波氏菌，隨后對(duì)分離菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 材料

哥倫比亞瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，由美國BD 公司提供；麥康凱瓊脂、三糖鐵瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、半固體動(dòng)力培養(yǎng)基等，均由北京陸橋技術(shù)有限公司提供；脫纖維羊血，由上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司提供。所有培養(yǎng)基按說明自行配制。

GN 革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡（批號(hào)2411651403），由法國梅里埃公司提供；阿莫西林、氨芐西林、卡那霉素等24 種藥敏紙片，由杭州濱和微生物試劑有限公司提供。豬源支氣管敗血波氏菌參考菌株CVCC718，來自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。DL 2 000 DNA Marker、Taqremix等，購自寶生物工程（大連）有限公司；引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成。體質(zhì)量25～30 g ICR小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

恒溫培養(yǎng)箱（BD115），購自德國BINDER公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（371），購自賽默飛世爾科技公司（Thermo）；全自動(dòng)微生物鑒定儀（VITEK 2 Compact），購自法國梅里埃公司；基因擴(kuò)增儀（Biometra Tadvanced 96 SG），購自德國耶拿公司；熒光PCR 儀（ViiATM7 Dx），購自美國ABI 公司。貓皰疹病毒熒光PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20201213）、貓杯狀病毒熒光PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20201213）、貓衣原體結(jié)膜炎熒光PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20201213），購自書扁科技（上海）有限公司；貓支原體（MF）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法，批號(hào)21050601），購自維伯鑫公司；磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒（批號(hào)MDKI 21-01），購自美吉公司。

1.2 方法

1.2.1 病原檢測(cè) 將鼻拭子樣品在渦旋震蕩儀上充分混合后，4 ℃ 3 000 r/min 離心5 min，取上清液，轉(zhuǎn)入1.5 mL 滅菌離心管中，4 ℃保存?zhèn)溆?。按照磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書提取DNA/RNA，按試劑盒說明書分別對(duì)貓杯狀病毒、貓皰疹病毒、貓衣原體、貓支原體進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定 將無菌采集的貓鼻拭子樣品先接種到含0.4%萬古霉素的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)48 h，取10 μL 分別接種于哥倫比亞血瓊脂、麥康凱瓊脂，36 ℃培養(yǎng)48 h，挑取可疑菌落涂片鏡檢并純培養(yǎng)；將純培養(yǎng)物接種于三糖鐵瓊脂、半固體動(dòng)力培養(yǎng)基，觀察其培養(yǎng)特性。對(duì)分離的細(xì)菌純培養(yǎng)物，按照GN 細(xì)菌鑒定卡操作規(guī)程操作，并在VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀上讀取細(xì)菌鑒定結(jié)果。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 將細(xì)菌純培養(yǎng)物采用K-B 紙片法進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)方法及判讀標(biāo)準(zhǔn)，參照杭州濱和微生物試劑有限公司提供的抗生素類藥敏紙片說明書。

1.2.4 支氣管敗血波氏菌PCR 檢測(cè) 參照《豬傳染性萎縮性鼻炎診斷技術(shù)》（NY/T 546—2015）中的支氣管敗血波氏菌引物序列合成引物，擴(kuò)增長度230 bp，引物工作濃度20 pmol/L，-20 ℃冷凍保存。用煮沸法制備DNA 模板，從36 ℃過夜培養(yǎng)的血瓊脂平板中挑取數(shù)個(gè)菌落于含100 μL ddH2O的EP 管中，100 ℃水浴10 min，12 000 r/min 離心5 min，吸取上清作為模板，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR 反應(yīng)體系25.0 μL：Taqremix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性94 ℃30 s，復(fù)性55 ℃ 30 s，72 ℃延伸20 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取8.0 μL PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3 致病性試驗(yàn)

取分離菌肉湯培養(yǎng)物，配制菌液濃度為6×108CFU/mL，然后將其腹腔注射ICR 小鼠2 只，注射劑量為0.2 mL/只，同時(shí)設(shè)立普通肉湯空白對(duì)照，接種后1 周持續(xù)觀察小鼠臨床表現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)病原熒光PCR 檢測(cè)

對(duì)貓鼻拭子樣品提取DNA/RNA，按相應(yīng)病原試劑盒說明書進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果貓杯狀病毒、貓皰疹病毒、貓衣原體、貓支原體均為陰性。

2.2 分離菌株培養(yǎng)特性

從貓鼻拭子樣品中分離到1 株細(xì)菌。該菌株菌落在哥倫比亞羊血瓊脂平板上為灰白色、表面光滑、圓形、隆起、β 溶血，直徑為1 mm（圖1），革蘭氏染色為G-桿菌；在麥康凱瓊脂平板上，菌落呈圓形、光滑，對(duì)光觀察呈淡藍(lán)灰色，培養(yǎng)基呈琥珀色（圖2）；在三糖鐵瓊脂上，培養(yǎng)基斜面和底部均不變色，不產(chǎn)生硫化氫（圖3）；在半固體動(dòng)力培養(yǎng)基上有厚菌膜，20 ℃培養(yǎng)分離菌沿穿刺線擴(kuò)散生長，36 ℃培養(yǎng)則沿穿刺線不擴(kuò)散生長（圖4）。

圖1 分離菌株在哥倫比亞血瓊脂上的菌落形態(tài)

圖2 分離菌株在麥康凱瓊脂上的菌落形態(tài)

圖3 分離菌株在三糖鐵瓊脂上生長情況

圖4 分離菌株在半固體動(dòng)力培養(yǎng)基上生長情況

2.3 分離菌株生化特性

分離菌在VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀上鑒定結(jié)果為支氣管敗血波氏菌（B.bronchiseptica），鑒定準(zhǔn)確率為99%（表1）。

表1 支氣管敗血波氏菌分離株生化特性

2.4 藥敏試驗(yàn)

分離菌株對(duì)頭孢拉定、頭孢西丁、頭孢噻肟、氨芐西林、強(qiáng)力霉素、壯觀霉素等9 種抗生素耐藥，對(duì)阿莫西林、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、氟哌酸、復(fù)方新諾明、美羅培南等15 種抗生素均敏感（表2）。

表2 支氣管敗血波氏菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 支氣管敗血波氏菌PCR 檢測(cè)

對(duì)分離菌株進(jìn)行支氣管敗血波氏菌PCR 檢測(cè)，結(jié)果在230 bp 處出現(xiàn)特異性條帶，為支氣管敗血波氏菌陽性（圖5）。

圖5 貓?jiān)捶蛛x株P(guān)CR 擴(kuò)增結(jié)果

2.6 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)鼠攻毒后3 d 內(nèi)表現(xiàn)精神沉郁、被毛聳立、呼吸急促，行動(dòng)遲緩等癥狀，1 周后恢復(fù)正常，未出現(xiàn)死亡；空白對(duì)照組正常。結(jié)果表明，該分離株的致病性并不強(qiáng)。

3 討論

支氣管敗血波氏菌是引起貓呼吸道疾病的重要病原，也可混合或繼發(fā)感染貓杯狀病毒、貓皰疹病毒、衣原體、支原體等其他呼吸道病原[1]。因此，當(dāng)貓發(fā)生傳染性上呼吸道疾病時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行多種病原檢測(cè)，以便找出病因，進(jìn)行對(duì)癥治療。本研究對(duì)送檢的鼻拭樣品首先進(jìn)行貓杯狀病毒、貓皰疹病毒、衣原體、支原體等4 種病原的熒光PCR 檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，從而排除了這4 種病原感染的可能性；同時(shí)對(duì)鼻拭樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果確定分離細(xì)菌為支氣管敗血波氏菌。有資料[4]表明，支氣管敗血波氏菌感染小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可引起急性或慢性呼吸道炎癥，致病性試驗(yàn)也證實(shí)了分離菌符合支氣管敗血波氏菌的致病特性。貓不常發(fā)生咳嗽，本病例持續(xù)咳嗽1 周以上，應(yīng)懷疑發(fā)生支氣管敗血波氏菌感染[1，5]。綜合判定，引起該德文貓咳嗽的病原為支氣管敗血波氏菌。

貓鼻腔是一個(gè)開放的通道，鼻拭子樣品中支氣管敗血波氏菌量少，且常有雜菌污染，加上支氣管敗血波氏菌生長緩慢，因而增加了支氣管敗血波氏菌假陰性檢出的可能性。因此，最好采集貓鼻腔后部的分泌物，使用選擇性培養(yǎng)基或小鼠傳代的方法來進(jìn)一步純化細(xì)菌[6]，以提高菌株分離率。因萬古霉素能抑制革蘭氏陽性菌生長，革蘭氏陰性菌在鼻咽共生菌群中少見，本研究參考Van den Bossche等[3]發(fā)表的文章，將無菌采集的貓鼻拭子樣品先接種到含萬古霉素的胰蛋白胨大豆肉湯中進(jìn)行增菌，再取增菌液分別接種于哥倫比亞血瓊脂和麥康凱瓊脂，每種培養(yǎng)基接種2 塊平板，其中一塊作濃厚涂抹接種，另一塊作劃線接種，36 ℃需氧培養(yǎng)48 h，以防漏檢。本研究發(fā)現(xiàn)，分離菌在麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)24 h 形成無色細(xì)小菌落，培養(yǎng)48 h 形成表面光滑，直徑約1 mm 的圓形、淡粉色菌落，對(duì)光觀察菌落呈淡藍(lán)灰色，這與管飄萍等[2]描述的中等大小、粉色菌落不同。經(jīng)典教材[4]顯示，支氣管敗血波氏菌在麥康凱瓊脂平板上生長的菌落周圍有狹窄紅色環(huán)，而本研究分離的菌株菌落周圍無狹窄紅色環(huán)，其原因有待于分析。

資料[4]表明，支氣管敗血波氏菌為專性需氧菌。此次分離的菌株在含5% CO2的條件下也能生長，但生長貧瘠，需培養(yǎng)48 h 以上。因此，此次分離的貓?jiān)粗夤軘⊙ㄊ暇⒎菍Ｐ孕柩?，這與之前資料所述不同，其原因需要進(jìn)行后續(xù)研究。

資料[1]表明，強(qiáng)力霉素為首選治療支氣管敗血波氏菌感染的藥物。但本次分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果為強(qiáng)力霉素耐藥，因此臨床實(shí)踐中建議先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，再選擇敏感藥物進(jìn)行治療。

支氣管敗血波氏菌的毒力因子主要包括黏附素和毒素兩大類[4]。管飄萍等[2]對(duì)分離的3 株貓?jiān)粗夤軘⊙ㄊ暇?07～109CFU/mL 等3 種不同的菌液濃度攻毒小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠在72 h內(nèi)均死亡；利用VFDB 數(shù)據(jù)庫對(duì)基因組測(cè)序所得的蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行功能注釋，預(yù)測(cè)了66種毒力相關(guān)基因。而本研究的貓?jiān)捶蛛x株只用108CFU/mL 的菌液濃度攻毒小鼠，后續(xù)應(yīng)選擇不同濃度的菌液進(jìn)行致病性試驗(yàn)。Nevine等[7]報(bào)道，2011—2014年，從同一名持續(xù)咳嗽的患者痰液中分離到4 株支氣管敗血波氏菌，多位點(diǎn)序列分析（MLST）發(fā)現(xiàn)，4 株分離株同屬于一個(gè)序列類型（ST），與最后3 個(gè)分離株相比，第1 個(gè)分離株不產(chǎn)生任何毒力因子。本分離株是否也不產(chǎn)生任何毒力因子，后續(xù)應(yīng)補(bǔ)充進(jìn)行相關(guān)毒力基因檢測(cè)，以了解該菌的致病機(jī)制。

目前飼養(yǎng)寵物的家庭越來越多，寵物犬貓已經(jīng)成為家庭的一份子，成為人們的親密伙伴。支氣管敗血波氏菌可經(jīng)氣溶膠傳播[4]，可感染多種宿主[8]，能在貓與人之間傳播，有些貓?jiān)诩毙愿腥竞罂沙蔀橹夤軘⊙ㄊ暇膸Ь?，感染后持續(xù)排出病原菌長達(dá)數(shù)周，也可能無癥狀帶菌，只在應(yīng)激時(shí)排出病原菌[1]。Wernli等[9]在日內(nèi)瓦大學(xué)醫(yī)院對(duì)1993—2008年8 例確診感染支氣管敗血波氏菌的病例進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有3 例患者感染前記錄過與貓有接觸史，而且這些患者免疫功能低下；Registe等[10]報(bào)道了從一名囊性纖維化患者的痰液樣本中分離出支氣管敗血波氏菌，傳染源是一只患有急性呼吸道疾病的小貓；Gil Redelman-Sidi等[11]報(bào)道了一名56 歲的骨膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在接受替莫唑胺治療過程中因接觸了已感染支氣管敗血波氏菌的小貓而被診斷為支氣管敗血波氏菌病。因此，免疫功能低下的人感染支氣管敗血波氏菌的風(fēng)險(xiǎn)很高。Ducours等[12]建議，貓和老人只要感染了支氣管敗血波氏菌，都應(yīng)進(jìn)行抗生素治療。Herman Egberink等[5]在貓支氣管敗血波氏菌病防治指南中建議，貓感染后即使癥狀輕微，也需要進(jìn)行抗生素治療。目前，由于新冠疫情防控需要，飼養(yǎng)犬、貓等寵物的家庭成員在密閉空間與寵物呆在一起時(shí)間長，當(dāng)人與犬貓親密接觸，尤其人抵抗力下降時(shí)，發(fā)生支氣管敗血波氏菌感染的風(fēng)險(xiǎn)很高，這給公共衛(wèi)生安全帶來了極大挑戰(zhàn)。

歐洲和美國有貓支氣管敗血波氏菌鼻內(nèi)活疫苗。鼻內(nèi)免疫接種易于實(shí)施，接種后有的貓會(huì)表現(xiàn)中度的暫時(shí)性打噴嚏或流出清亮的眼分泌物等癥狀[1]。但免疫接種不能阻止感染，只能減輕貓的臨床癥狀。由于支氣管敗血波氏菌可傳染給人，因此在注射活疫苗后，應(yīng)將貓隔離1 周。

本研究對(duì)上海市有咳嗽癥狀的貓病例進(jìn)行呼吸系統(tǒng)相關(guān)病原檢測(cè)及細(xì)菌分離培養(yǎng)，除分離到支氣管敗血波氏菌外，其他病原均為陰性，因而確定該病例為支氣管敗血波氏菌感染；分離株致病力不強(qiáng)，但對(duì)免疫力低下人群具有潛在感染風(fēng)險(xiǎn)；分離菌株對(duì)首選治療藥物強(qiáng)力霉素產(chǎn)生耐藥，因此臨床需要選用敏感藥物進(jìn)行防治。本研究為貓?jiān)粗夤軘⊙ㄊ暇〉脑\斷與防治提供了參考。