養(yǎng)殖鱖魚出血病病原的分離與鑒定

呂圓圓，周凱，房文紅，匡俊宇，趙姝，馬麗艷，王元，陳壽旭，高桂明，謝志強(qiáng)，周俊芳

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部低洼鹽堿地水產(chǎn)養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；3.上海市松江區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 201600）

鱖魚（Siniperca chuatsi）又稱桂花魚，肉嫩味美，養(yǎng)殖前景良好。2021年，上海市一養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的鱖魚（體長(zhǎng)11.0～13.4 cm）發(fā)生出血性疾病，初始典型癥狀為下頜出血，病死率為10%～20%。本研究通過細(xì)菌分離、分子鑒定、生化反應(yīng)以及致病性試驗(yàn)等，確認(rèn)鱖魚發(fā)病死亡是由維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）共同感染引起的。

維氏氣單胞菌對(duì)鹽度具有廣適性，廣泛分布于淡水、海水中，宿主眾多，不僅可以感染魚、蝦、蟹、貝、龍蝦和烏賊等[1-2]，還可感染人和陸生動(dòng)物，并可污染食物[3–6]。Hu等[7]研究表明，維氏氣單胞菌在健康或發(fā)病魚類以及養(yǎng)殖水環(huán)境中廣泛存在，在分離的氣單胞菌中的占比均在60%以上。上海市浦東新區(qū)疾病控制中心對(duì)排便次數(shù)和糞便性狀有改變的2 533 例患者采集樣本檢測(cè)，確定101 例感染了氣單胞菌，其中維氏氣單胞菌陽性樣本44 例，占比高達(dá)52.5%，并且有44 例患者還出現(xiàn)了氣單胞菌與其他病原體的共同感染[8]。

與維氏氣單胞菌類似，遲緩愛德華氏菌也具有分布廣、宿主多[9-10]等特點(diǎn)，可導(dǎo)致鯰魚（Ictalurus punctatus）、尼羅羅非魚（Oreochromis nilotica）、鲆鰈類、歐洲鰻魚（Anguilla anguilla）、日本鰻魚（Anguilla japonica）、鯉魚（Cyprinusspp.）和黃鱔（Monopterus albus）等多種魚類發(fā)病。2015年，養(yǎng)殖鱸鰻（Anguilla marmorata）暴發(fā)遲緩愛德華氏菌病，死亡率高，導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失較大[11]。遲緩愛德華氏菌除了導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病外，也可感染人，導(dǎo)致結(jié)腸炎癥、潰瘍，形成假息肉，癥狀類似克羅恩病[12–14]。

本研究對(duì)病死鱖魚進(jìn)行系列病原分離與鑒定，旨在確定引發(fā)鱖魚出血病的病原及其生化特性和抗生素敏感性等特征，為后續(xù)防治該病提供參考。

1 材料和方法

1.1 發(fā)病魚臨床癥狀

多數(shù)發(fā)病魚下頜出血，嚴(yán)重者整個(gè)嘴部和鰭條出血，體表出現(xiàn)潰瘍（圖1）。剖開后，腹腔內(nèi)充滿腹水，腹壁肌肉黃染；腸壁變薄，內(nèi)部充滿黃綠色液體，腸黏膜輕度出血；下頜處肌肉出血。

圖1 發(fā)病鱖魚臨床癥狀

1.2 材料

收集發(fā)病鱖魚，低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室；健康鱖魚幼魚[體長(zhǎng)（5.83±0.25）cm]，購(gòu)自廣東鱖魚養(yǎng)殖戶，充氧空運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室；細(xì)菌培養(yǎng)基（TSA、TSB、MH）和血瓊脂平板，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡（GN 卡，Merieux），購(gòu)自廷祿（北京）科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 試劑（Takara），購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司；抗生素（藥敏試驗(yàn)），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離與純化 將瀕死鱖魚體表用75%酒精棉消毒后解剖。用無菌接種環(huán)分別在鰓絲、腸道內(nèi)容物、潰瘍和肝臟剖面沾取組織或黏液，劃線接種于大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h；挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢(shì)菌落再次劃線培養(yǎng)分離，獲得純培養(yǎng)菌株，觀察菌落顏色及形態(tài)特征；同時(shí)，把純化后的菌株接種于含5%綿羊血的血平板，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察溶血特征。

1.3.2 分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析 挑取純化后的單菌落，28 ℃恒溫?fù)u菌培養(yǎng)24 h，參照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增引物及條件見表1。將PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序并經(jīng)BLAST 比對(duì)分析后，采用MEGA-X 10.0 軟件包中的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過自舉分析進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉數(shù)據(jù)集為1 000 次。

表1 本研究所用引物

1.3.3 細(xì)菌生化特征鑒定 在確定純化菌的革蘭氏染色特性后，將純化菌接種到血平板上，28 ℃培養(yǎng)20 h；挑取單菌落，按照革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡說明書，在梅里埃自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀上，分析菌株的各項(xiàng)理化指標(biāo)。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 首先制備菌懸液：將分離菌接種于2 mL TSB 液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床設(shè)置為28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)16 h；用TSB 液體培養(yǎng)基稀釋菌液，使懸菌液濃度在多功能酶標(biāo)儀上的吸光度OD600nm為1.0，備用；吸取100 μL 稀釋菌液加入到無菌的96 孔板中，以大腸桿菌ATCC25922 作為質(zhì)控菌株。然后制備瓊脂藥敏板：將抗菌藥稀釋后，使用移液器移取藥液，快速加入到50 ℃左右的MH 瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻，倒入平板，即成相應(yīng)濃度的瓊脂藥敏平板，未添加抗菌藥的MH瓊脂培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。最后將分離菌在藥敏平板上接種與培養(yǎng)：將已配置好的細(xì)菌懸濁液按順序各吸100 μL 分別加入96 孔板中，然后用滅菌后的自制釘板蘸取菌液，按順序按在已凝固的藥敏平板和空白MH 瓊脂平板上，待菌液晾干后將藥敏平板置于恒溫培養(yǎng)箱中，正面向上放置，同時(shí)每種藥物做3 個(gè)平行，28 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，將無菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度視為最小抑菌濃度（MIC）。

1.3.5 健康鱖魚感染試驗(yàn) 試驗(yàn)用鱖魚外觀健康，攝食正常，其分離細(xì)菌在TSA 瓊脂平板上沒有見到明顯優(yōu)勢(shì)菌和細(xì)小的針尖樣菌落，血平板培養(yǎng)也未見溶血菌落。根據(jù)感染要求，將試驗(yàn)用鱖魚隨機(jī)分到玻璃缸中。將純化后的菌株分別接種至TSB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)18 h，取1 mL 菌液用0.85%的無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，涂布TSA瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24 h 后計(jì)算活菌數(shù)，每個(gè)梯度做2 個(gè)平行。根據(jù)分離菌株各自生長(zhǎng)狀況和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用0.85%無菌生理鹽水分別將菌液稀釋到1×103～1×105cfu/μL，腹腔注射感染健康鱖魚幼魚，菌液注射量為100 μL/尾（GY2C2 攻毒15尾/梯度，GY2S1 攻毒7 尾/梯度），對(duì)照組注射等量0.85%無菌生理鹽水。試驗(yàn)組和對(duì)照組分別暫養(yǎng)于玻璃缸中，水溫控制在（27±1）℃；保持充氧和正常換水，觀察并記錄鱖魚的發(fā)病和死亡情況，持續(xù)觀察10 d。

2 結(jié)果

2.1 分離菌特點(diǎn)

初次分離培養(yǎng)24 h 后，發(fā)現(xiàn)每條魚組織均出現(xiàn)一種相似的優(yōu)勢(shì)菌落（圖2-A）——生長(zhǎng)快速，呈現(xiàn)表面光滑、濕潤(rùn)、輕微隆起的圓形乳白色優(yōu)勢(shì)菌落（藍(lán)色箭頭）；部分病情嚴(yán)重魚的腸道黏液中，除了前面的優(yōu)勢(shì)菌落外，還長(zhǎng)出一種生長(zhǎng)緩慢、光滑、隆起的針尖樣白色菌落（紅色箭頭），培養(yǎng)24 h 時(shí)小菌落數(shù)量少于大菌落，但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，小菌落數(shù)量逐漸增多，48 h 時(shí)數(shù)量與大菌落近似；其他形態(tài)或顏色的菌落極少。純化大菌落在綿羊血平板上出現(xiàn)清晰的β-溶血環(huán)（圖2-B），而小菌落不溶血。

圖2 患病鱖魚組織分離菌培養(yǎng)特點(diǎn)

2.2 分子鑒定

按照表1 中所列引物[15-16]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序和BLAST 分析，發(fā)現(xiàn)所有的大菌落均為維氏氣單胞菌；取其中一條魚的鰓絲培養(yǎng)菌（GY2S1）序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3），進(jìn)行同源性分析。由于所有針尖樣白色菌落均為遲緩愛德華氏菌，因此同樣取同一條魚的腸道培養(yǎng)菌（GY2C2）序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4）。

圖3 GY2S1 基于DnaJ 基因序列的分析聚類結(jié)果

圖4 GY2C2 基于16S rDNA 基因序列的分析聚類結(jié)果

2.3 生化特征

利用梅里埃自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀配套革蘭氏陽性G-細(xì)菌的GN 卡，獲得分離菌株GY2S1 和GY2C2的生化鑒定結(jié)果（表2）。從表中可見，GY2S1 的鳥氨酸脫羧酶（ODC）和賴氨酸脫羧酶（LDC）反應(yīng)均為陰性，表明其既不屬于維氏氣單胞菌維氏生物群（A.veroniibiogroupveronii），也不屬于維氏氣單胞菌溫和生物群（A.veroniibiogroupsobria），但在遺傳上與溫和生物群更近。GY2S1和GY2C2 均不產(chǎn)生H2S。

表2 菌株GY2S1 和GY2C2 的生化特征

2.4 藥敏試驗(yàn)

參考常用魚藥與最新禁用藥物名單，選了慶大霉素等6 種抗生素測(cè)試GY2S1 和GY2C2 的藥物敏感性。結(jié)果（表3）顯示：兩種菌株GY2C2和GY2S1 對(duì)不同藥物的敏感性不完全一致，菌株GY2S1 對(duì)環(huán)丙沙星和氟苯尼考高度敏感，而GY2C2 只對(duì)6 種藥物中的氟苯尼考敏感；兩種菌都對(duì)硫酸新霉素和紅霉素耐藥。

表3 菌株GY2S1 和GY2C2 對(duì)6 種抗菌藥物的MIC 結(jié)果

2.5 健康鱖魚感染試驗(yàn)

分離株GY2S1 和GY2C2 分別注射感染鱖魚幼魚后，被感染幼魚均出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象，死亡情況如表4 和圖5 所示。相同濃度下，GY2S1 引起的死亡率高于GY2C2。從發(fā)病死亡魚組織（腸道、肝臟）中分別分離到高度優(yōu)勢(shì)菌株；測(cè)序鑒定顯示，分離菌株分別與注射感染菌株同種。

圖5 人工感染病原菌后10 d 內(nèi)的鱖魚累積死亡數(shù)變化趨勢(shì)

表4 健康鱖魚幼魚感染GY2S1 和GY2C2 后的死亡情況

3 分析與討論

經(jīng)鑒定證實(shí)，引起該養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖鱖魚發(fā)病死亡的是維氏氣單胞菌與遲緩愛德華氏菌共感染導(dǎo)致的出血病。嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌已成為水產(chǎn)動(dòng)物，如淡水魚、淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦等的主要致病性細(xì)菌。Wang等[17]從我國(guó)南方發(fā)病和健康的養(yǎng)殖泥鰍中分離氣單胞菌，發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌的檢出率遠(yuǎn)高于其他氣單胞菌種類，104 株中分離出87 株，占比高達(dá)83%，而傳統(tǒng)的水生動(dòng)物病原嗜水氣單胞菌檢出率只有4%，豚鼠氣單胞菌沒有檢測(cè)到。類似地，Hossain等[18]從健康孔雀魚分離到52株氣單胞菌，其中維氏氣單胞菌最多，為34 株，占比高達(dá)65%，而嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌均為3株，檢出率都很低。但是，到食物和人攜帶層面，優(yōu)勢(shì)菌種略有變化。Wu等[5]從市場(chǎng)以及壽司和海鮮店的魚中分離到氣單胞菌128 株，其中豚鼠氣單胞菌最多，為43 株（33.6%），而該種菌在水生動(dòng)物中的檢出率卻很低[18]，甚至無[17]；檢出維氏氣單胞菌33 株（25.8%），雖然略低于豚鼠氣單胞菌，但仍然遠(yuǎn)高于其他菌種；但是，嗜水氣單胞菌檢出率仍然維持在較低水平，只有9 株（7.0%）。可見，食物來源氣單胞菌的菌種組成與水生養(yǎng)殖源氣單胞菌相比，變化最大的是豚鼠氣單胞菌，檢出率從很低甚至無躍升到最高，而其他菌種，如維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌等，相對(duì)檢出率變化較小，表現(xiàn)出動(dòng)物與產(chǎn)品較好的一致性。需要注意的是，人源氣單胞菌菌種組成與食物源具有較高的一致性：豚鼠氣單胞菌和維氏氣單胞菌在病人體內(nèi)占比也較高，唯一異常的是達(dá)克氣單胞菌，不僅占比與豚鼠氣單胞菌類似，而且比率高于其在魚源氣單胞菌中的占比，推測(cè)應(yīng)該與人的病例總數(shù)和人易感種類均較少有關(guān)。盡管維氏氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌均存在分布廣、宿主多的特點(diǎn)，且水產(chǎn)病原共感染甚至協(xié)同發(fā)病的報(bào)道[19–21]也越來越多，但是兩者感染鱖魚的報(bào)道并不多[22]，還未見到兩者協(xié)同感染發(fā)病的報(bào)道。

基于分子生物學(xué)鑒定方法，GY2S1 菌株被鑒定為維氏氣單胞菌。鑒于維氏氣單胞菌數(shù)量巨大，且具有生物學(xué)特性的多樣性，Wang等[23]建立了維氏氣單胞菌的生物群分類方法，即維氏氣單胞菌維氏生物群（A.veroniibiogroupveronii）特征是鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)陽性，而維氏氣單胞菌溫和生物群（A.veroniibiogroupsobria）的特征是鳥氨酸脫羧酶（ODC）反應(yīng)陰性、賴氨酸脫羧酶（LDC）反應(yīng)陽性。但是，根據(jù)GY2S1 的生化反應(yīng)結(jié)果，分離株GY2S1 的賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶的生化反應(yīng)均為陰性，因此根據(jù)上述生物群分類方法，鱖魚分離株GY2S1 既不屬于維氏生物群，也不屬于溫和生物群。當(dāng)然，基于DnaJ基因的進(jìn)化分析結(jié)果顯示，GY2S1 分離株與部分維氏氣單胞菌溫和生物群聚于一個(gè)大的分支，表明該分離株在遺傳水平上與維氏氣單胞菌溫和生物群更近。遲緩愛德華氏菌與維氏氣單胞菌類似，也存在非典型生化反應(yīng)的情況。例如，遲緩愛德華氏菌的大量生化反應(yīng)都表明其產(chǎn)生H2S[11，24]，以致把“H2S 陽性”作為其典型特征。然而，本研究從鱖魚獲得的分離株GY2C2 卻不產(chǎn)生H2S。另外，Shao等[25]也分離到1 株不產(chǎn)生H2S 的遲緩愛德華氏菌。

由于兩種菌株來源相同，因此兩者在敏感與耐受的藥物種類方面比較近似，都對(duì)硫酸新霉素和紅霉素耐藥，而對(duì)氟苯尼考都高度敏感，這為病魚的治療提供了方便。兩種菌株回感健康鱖魚的死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩者都是鱖魚出血病的病原，但是維氏氣單胞菌GY2S1 感染后發(fā)病迅速，死亡率高，是鱖魚出血病的主要病原，因此治療還可以輔以對(duì)維氏氣單胞菌高度敏感的環(huán)丙沙星。