商用BT 細(xì)胞中污染病毒的檢測(cè)及基因序列分析

桂亞萍，白藝蘭，劉健，王建，趙洪進(jìn)

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

作為重要的細(xì)胞基質(zhì)，動(dòng)物源性細(xì)胞系已在科學(xué)研究和生物制品生產(chǎn)方面獲得了廣泛應(yīng)用。但由于其所用細(xì)胞、血清等均為動(dòng)物源性材料，極易受到外源因子尤其是病毒的污染，導(dǎo)致潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)[1]。張志等[2]從14 個(gè)省份的豬瘟細(xì)胞疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗中檢出9份牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）陽(yáng)性樣品。有研究[3]對(duì)墨西哥6 批次單價(jià)疫苗、8 批次疫苗生產(chǎn)所用細(xì)胞系和10 批次胎牛血清進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，62.5%的樣本存在BVDV RNA 污染。

牛鼻甲骨（BT）細(xì)胞是用于多種牛病毒培養(yǎng)和檢測(cè)的重要牛源細(xì)胞系，對(duì)其外源病毒進(jìn)行檢測(cè)尤為重要。已有研究[4]表明，BVDV可污染BT細(xì)胞、牛腎細(xì)胞等多種牛源細(xì)胞，同時(shí)牛細(xì)小病毒（bovine parvovirus，BPV）、呼腸孤病毒3 型（mammalian orthoreovirus 3，Reo3）、牛腺病毒3 型（bovine adenovirus type 3，BAdV-3）、牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratorysyneytial virus，BRSV）和牛副流感病毒3 型（bovine parainfluenzavirus type 3，BPIV-3）也是造成牛源細(xì)胞系污染的重要病原。因此，對(duì)BT 細(xì)胞進(jìn)行以上病原的檢測(cè)，對(duì)于后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和防止?jié)撛诘牟《緜鞑ゾ哂兄匾饬x。本研究通過(guò)PCR 擴(kuò)增，細(xì)胞病變觀察，以及陽(yáng)性病原部分基因序列測(cè)序和分析，對(duì)商用BT 細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)病毒檢測(cè)，以期為商用BT 細(xì)胞的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 BT 細(xì)胞，購(gòu)自某生物公司。

1.1.2 主要試劑 0.25%的胰酶消化液（批號(hào)AU202111）、胎牛血清（批號(hào)AU204825），購(gòu)自BIOODIN 公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液（批號(hào)2467189）、PBS（批號(hào)8121484），購(gòu)自GIBCO 公司；核酸提取試劑盒（批號(hào)MDJL09-1），購(gòu)自Magen公司；Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)AL52736A）、PremixTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye，批號(hào)AI12330A），購(gòu)自寶生物工程（大連）公司。

1.2 方法

1.2.1 BT 細(xì)胞相應(yīng)病毒檢測(cè) 對(duì)BT 細(xì)胞收毒后反復(fù)凍融3 次，2 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。參考文獻(xiàn)[5-7]設(shè)計(jì)BVDV、BPV、Reo3、BAdV-3、BRSV 及BPIV-3 檢測(cè)引物（表1），由上海桑尼生物公司合成。按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求提取BT 細(xì)胞上清液總核酸，并以此為模板，根據(jù)Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，分別進(jìn)行BVDV、Reo3、BRSV 和BPIV-3 的RT-PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2×Buffer 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，模板2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。一步法RT-PCR 擴(kuò)增程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。按核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，提取離心后的BT 細(xì)胞上清液DNA，以此為模板，根據(jù)PremixTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye）說(shuō)明書(shū)要求，分別進(jìn)行BPV和BAdV-3 的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2×Buffer 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，PremixTaq1.0 μL，模板 2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送上海桑尼生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI 進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析。

表1 6 種病毒的檢測(cè)引物

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)原材料BVDV 檢測(cè) 各吸取200 μL DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS、胰酶、胎牛血清，按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求分別提取總核酸，以BT 細(xì)胞提取總RNA 為陽(yáng)性對(duì)照組，擴(kuò)增體系和程序同1.2.1，進(jìn)行BVDV RT-PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 BT 細(xì)胞中BVDV 增殖檢測(cè) 經(jīng)BT 細(xì)胞傳代培養(yǎng)7 d，每隔1 d 觀察細(xì)胞病變情況并吸取200 μL 細(xì)胞培養(yǎng)上清液備用；提取不同時(shí)間段的BT 細(xì)胞上清液總核酸，以BVDV-F/R 為引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 BVDVNpro和E2基因擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計(jì)并合成靶向BVDVNpro和E2基因的特異性引物（表2），以BT 細(xì)胞凍融離心后上清液所提總RNA 為模板，采用兩對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增Npro和E2基因片段，陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送上海桑尼生物公司測(cè)序。

表2 BVDV 特異性擴(kuò)增引物

1.2.5 序列比對(duì)分析 對(duì)獲得的5'UTR、Npro以及E2基因序列進(jìn)一步處理后，與GenBank 上發(fā)表的BVDV 參考序列（表3）進(jìn)行比對(duì)分析，利用MEGA 6.0 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表3 BVDV 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 BT 細(xì)胞中病毒的PCR 檢測(cè)

以提取的BT 細(xì)胞總RNA 為模板分別進(jìn)行BVDV、BPV、Reo3、BAdV-3、BRSV 及BPIV-3等6 種病毒的PCR 擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，僅BVDV 出現(xiàn)目的條帶，其他病毒未出現(xiàn)相應(yīng)條帶（圖1），進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 分析，確定為BVDV 基因序列。

圖1 BT 細(xì)胞BVDV PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 原材料BVDV 檢測(cè)

分別對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞所用原材料DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS、胎牛血清、胰酶進(jìn)行BVDV 檢測(cè)，結(jié)果均為陰性（圖2）。

圖2 原材料PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 細(xì)胞病變觀察

對(duì)BT 細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，分別在相應(yīng)時(shí)間段觀察細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果（圖3）顯示，7 d 內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，BT 細(xì)胞一直未出現(xiàn)明顯病變。

圖3 不同時(shí)間段BT 細(xì)胞生長(zhǎng)情況

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)

對(duì)提取的不同時(shí)間段的BT 細(xì)胞培養(yǎng)上清液總核酸進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，樣品在302 bp 處有一條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，且條帶的亮度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸增強(qiáng)，表明BT 細(xì)胞中存在BVDV 病毒，且該病毒可以在細(xì)胞內(nèi)增殖。

圖4 不同時(shí)間段BT 細(xì)胞上清液RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.5 BVDV Npro和E2 基因擴(kuò)增

分別利用BVDV的Npro以及E2基因特異性引物，對(duì)BT細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖5）顯示，2 對(duì)特異性引物均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的特異性條帶，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。

圖5 BVDV Npro和E2 基因RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.6 BVDV 5'UTR、Npro和E2 基因序列比對(duì)

BT 細(xì)胞中檢出的病毒被命名為BVDV202201，對(duì)其擴(kuò)增的部分基因序列進(jìn)行同源性以及遺傳進(jìn)化分析。同源性分析結(jié)果顯示：BVDV202201 的5'UTR 基因與USMARC-53875 株核苷酸同源性最高，為97.0%，與疫苗株Oregon C24V 株核苷酸同源性為96.4%，與BVDV-2型代表株 890 株的核苷酸同源性最低，僅為77.3%；Npro基因與Oregon C24V 株核苷酸同源性為90.7%，與BVDV-2 890 毒株的核苷酸同源性僅為70.7%；E2基因與Oregon C24V 株、USMARC-53875 株核苷酸同源性分別為89.7%和88.3%，與BVDV-2 890 毒株的核苷酸同源性僅為77.3%?；?'UTR 和Npro 構(gòu)建的遺傳進(jìn)化 樹(shù)（圖6～7）顯示，BVDV202201 與Oregon C24V 株親緣關(guān)系最近，同處于BVDV-1a 中的一個(gè)小分支；基于E2基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖8）顯示，BVDV202201 與Oregon C24V株、USMARC-53875 株親緣關(guān)系較近，同處于BVDV-1a 中的一個(gè)較大分支。以上結(jié)果表明，BVDV202201 屬于BVDV-1a 型。

圖6 BVDV 5'UTR 序列的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

圖7 BVDV Npro 序列的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

圖8 BVDV E2 序列的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

3 討論

BT 細(xì)胞不僅被廣泛用于牛病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，也可作為疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)，因此控制其外源病毒污染是保障生物安全的必要前提。本研究對(duì)可能污染BT 細(xì)胞的6 種病毒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中含有BVDV 病毒，在排除各原材料影響后，確定該細(xì)胞系中存在BVDV 污染。張超等[10]在對(duì)進(jìn)口胎牛血清和脫脂奶粉進(jìn)行檢測(cè)時(shí)均發(fā)現(xiàn)存在BVDV 的抗原和抗體污染；朱曉瑋等[11]從牛血清、牛睪丸細(xì)胞等牛源材料中均可檢出BVDV 病毒，甚至在后續(xù)產(chǎn)品加工過(guò)程中仍有部分陽(yáng)性檢出。以上研究表明，BVDV 在牛源材料中的污染情況可能廣泛存在。

本研究對(duì)BT 細(xì)胞進(jìn)一步傳代培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)檢出的BVDV 病毒可在BT 細(xì)胞中增殖但不產(chǎn)生細(xì)胞病變。BVDV 是引起牛消化、呼吸以及生殖系統(tǒng)疾病的重要病原體，不僅影響牛群生產(chǎn)性能造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，也是牛源材料中的主要污染物[12]。根據(jù)是否引起細(xì)胞病變，可將BVDV 分為致細(xì)胞病變和非致細(xì)胞病變兩種生物型，其中非致細(xì)胞病變的BVDV 可在細(xì)胞系中持續(xù)感染，是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞污染的重要傳染源[13]。

BVDV 病毒中的5'UTR、Npro以及E2基因多用于鑒定不同毒株的基因型[14]。根據(jù)5'UTR 等基因的差異，可將BVDV 分為BVDV-1、BVDV-2 和BVDV-3 3 種基因型，其中的BVDV-1 型作為主要流行株已報(bào)道了1a—1u 至少21 種基因亞型[15]。本研究從BT 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)BVDV 病毒，將其命名為BVDV202201，結(jié)合5'UTR、Npro和E2基因序列的遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該病毒與北美的Oregon C24V 株親緣關(guān)系較近，屬于BVDV-1a 型毒株。Oregon C24V 毒株屬于可引起MDBK 細(xì)胞病變的毒株，已作為BVDV 疫苗株被廣泛應(yīng)用。由于BVDV202201 與Oregon C24V 毒株位于同一分支，極有可能具有相似的生物學(xué)特性，提示其具有作為疫苗株研究的潛質(zhì)。

本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增、傳代培養(yǎng)、測(cè)序等方法，在商用BT 細(xì)胞中檢出不引起細(xì)胞病變的BVDV病毒，經(jīng)遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，其與BVDV-1a 經(jīng)典毒株Oregon C24V 親緣關(guān)系較近，這為商業(yè)化BT細(xì)胞用于生產(chǎn)和科研工作的質(zhì)量控制提出了重要污染警示。