基于NF-κB/NLRP3通路的芍藥苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的影響

孔令春，鄒紅，李景景，楊宇琴，唐慧新，繆晚虹

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203

視網(wǎng)膜缺氧性損傷可發(fā)生在多種視網(wǎng)膜血管性疾病中，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞及年齡相關(guān)性黃斑病變等。缺氧可造成視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能損傷，特別是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少或死亡，導(dǎo)致視力不可逆性喪失。因此，保護(hù)視網(wǎng)膜缺氧損傷尤為重要。目前，有關(guān)視網(wǎng)膜缺氧造成組織破壞的機(jī)制研究較多，包括氧化應(yīng)激損傷、谷氨酸興奮毒性損傷、凋亡基因表達(dá)、神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)、炎癥損傷、病理性血管新生等[1-2]。缺氧可導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)增加，從而增加視網(wǎng)膜血管滲透性，引起視網(wǎng)膜水腫[3]。研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺氧損傷過(guò)程伴有炎癥因子釋放[4]，NLRP3炎癥小體作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過(guò)感知組織損傷、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等參與多種眼部疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。研究顯示，激活NLRP3炎癥小體既可促進(jìn)VEGF生成[6]，也可促進(jìn)多種炎癥因子釋放[7]。

芍藥苷是赤芍和白芍的共有成分，具有抗自由基損傷、抑制炎癥、抗纖維化、神經(jīng)保護(hù)等作用[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體延緩視網(wǎng)膜缺血性損傷大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[10]。Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜細(xì)胞的主要大型特化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，參與血-視網(wǎng)膜屏障的形成，在視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中起重要作用。有研究表明，芍藥苷可通過(guò)降低大鼠血糖及抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低視網(wǎng)膜谷氨酸含量，保護(hù)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞[11]。但芍藥苷是否能通過(guò)抑制VEGF產(chǎn)生和炎癥發(fā)揮對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的保護(hù)作用尚不清楚?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞rMC-1缺氧模型，觀察芍藥苷的保護(hù)作用及對(duì)NF-κB/NLRP3通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，為芍藥苷治療視網(wǎng)膜血管性疾病提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞及藥物

大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞rMC-1，美國(guó)Kerafast公司。芍藥苷，美國(guó)Selleck公司，批號(hào)S241006。將芍藥苷粉末溶于二甲基亞砜，制成0.5 mol/L貯備液，-20 ℃避光保存，臨用前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司，批號(hào)2366072；胎牛血清（FBS），美國(guó)Gibco公司，批號(hào)2021472；CCK8試劑盒，日本DOJINDO公司，批號(hào)CK04；白細(xì)胞介素（IL）-1β、VEGF ELISA試劑盒，上海司鼎生物科技有限公司，批號(hào)分別為SDR0004、SDR0041；Trizol RNA提取試劑，美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)15596018；qPCR試劑盒，日本TAKARA，批號(hào)RR420A；BCA蛋白定量試劑盒，上海司鼎生物科技有限公司，批號(hào)SD0012；兔核因子（NF）-κB p65單克隆抗體，美國(guó)CST公司，批號(hào)#8242；NLRP3抗體、半胱氨酸蛋白酶-1前體（pro-Caspase-1）+p10+p12單克隆抗體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）抗體，英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab263899、ab179515、ab180799；β-actin抗體，上海司鼎生物科技有限公司，批號(hào)SD0034。

CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司，型號(hào)MCO-15AC），三氣培養(yǎng)箱（中國(guó)華儀寧創(chuàng)公司，型號(hào)Smartor 118），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)CX41），qPCR儀（瑞士Roche公司，型號(hào)LightCycler?480II），SDS-PAGE微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)1645050），低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)5810R），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)Multiskan FC）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

rMC-1細(xì)胞用含10% FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 d換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至85%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基終止消化后，以1∶3比例傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 造模及給藥條件篩選

將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種至96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)移至缺氧培養(yǎng)箱（1%O2）缺氧處理6、24、48 h，另設(shè)對(duì)照組正常培養(yǎng)相同時(shí)間，每組6個(gè)復(fù)孔，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力，確定造模條件。

確定造模條件后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和不同濃度芍藥苷組，對(duì)照組正常培養(yǎng)，模型組缺氧培養(yǎng)48 h，芍藥苷組造模同時(shí)加入終濃度分別為0、10、100、200、600、1 200 μmol/L的芍藥苷處理細(xì)胞，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力，確定芍藥苷給藥濃度。

2.3 分組干預(yù)

將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和芍藥苷高、低濃度組，根據(jù)確定的造模和給藥條件對(duì)照組正常培養(yǎng)，模型組缺氧培養(yǎng)48 h，芍藥苷高、低濃度組缺氧培養(yǎng)同時(shí)加入1 200、600 μmol/L芍藥苷處理，干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞和上清液進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.4 CCK8法檢測(cè)

細(xì)胞按分組處理后，每孔加入CCK8溶液10 μL，置于培養(yǎng)箱孵育3 h，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞活力（實(shí)驗(yàn)組OD值÷對(duì)照組OD值×100%）。

2.5 ELISA檢測(cè)

收集細(xì)胞上清液，按試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)VEGF、IL-1β含量。

2.6 Western blot檢測(cè)

收集細(xì)胞，按蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取20 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后分別加入NF-κB p65一抗（1∶1 000）、NLRP3一抗（1∶1 000）、ASC一抗（1∶2 000）、pro-Caspase-1一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記二抗（1∶20 000），37 ℃孵育1 h，顯影后用Image J 1.8.0軟件分析目的蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 RT-PCR檢測(cè)

收集細(xì)胞，Trizol提取總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照qPCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行 IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上、下游引物各 1 μL，2×Green Mix 10 μL，去離子水 7 μL；反應(yīng)條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由上海司鼎生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 實(shí)驗(yàn)條件建立

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，缺氧培養(yǎng)6、24 h，rMC-1細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），缺氧培養(yǎng)48 h，rMC-1細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.001），見圖1。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇缺氧培養(yǎng)48 h為造模條件。

圖1 缺氧不同時(shí)間對(duì)rMC-1細(xì)胞活力的影響（，n=6）

不同濃度芍藥苷處理細(xì)胞后，與模型組比較，0～200 μmol/L芍藥苷對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響（P＞0.05），600、1 200 μmol/L芍藥苷可顯著提高rMC-1細(xì)胞活力（P＜0.05，P＜0.01），見表2。故選擇芍藥苷濃度600和1 200 μmol/L用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同濃度芍藥苷對(duì)rMC-1細(xì)胞活力的影響（，%）

表2 不同濃度芍藥苷對(duì)rMC-1細(xì)胞活力的影響（，%）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

濃度/（μmol/L） 細(xì)胞活力100 77.48±13.86*77.14± 9.93 81.13±10.10 84.55± 8.93 83.66±13.06 89.84±11.45#98.59±10.34##組別對(duì)照組模型組芍藥苷組0 10 100 200 600 1 200 n 6 6 6 6 6 6 6 6

4.2 芍藥苷對(duì)模型細(xì)胞上清液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和白細(xì)胞介素-1β含量的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液VEGF、IL-1β含量顯著增加（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，芍藥苷低、高濃度組細(xì)胞上清液VEGF、IL-1β含量顯著減少（P＜0.01，P＜0.001）。見圖2。

圖2 各組rMC-1細(xì)胞VEGF、IL-1β含量比較（，n=3）

4.3 芍藥苷對(duì)模型細(xì)胞NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，芍藥苷高濃度組細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.001）。見圖3、表3。

表3 各組rMC-1細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組rMC-1細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

pro-Caspase-1 0.090±0.007 0.195±0.011***0.053±0.008###0.115±0.003###組別對(duì)照組模型組芍藥苷高濃度組芍藥苷低濃度組n 3 3 3 3 NF-κB p65 0.347±0.033 0.462±0.052*0.250±0.012###0.354±0.037#NLRP3 0.320±0.030 0.581±0.021***0.278±0.026###0.451±0.027##ASC 0.023±0.003 0.118±0.027**0.028±0.004##0.127±0.036

圖3 各組rMC-1細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白免疫印跡

4.4 芍藥苷對(duì)模型細(xì)胞白細(xì)胞介素-1β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和NF-κB/NLRP3通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1基因表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組比較，芍藥苷高濃度 組 細(xì)胞 IL-1β、VEGF、NF-κB、 NLRP3、 ASC、Caspase-1基因表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。見表4。

表4 各組rMC-1細(xì)胞IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1 基因表達(dá)比較（）

表4 各組rMC-1細(xì)胞IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1 基因表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

Caspase-1 1.013±0.202 2.752±0.250***1.454±0.125###2.096±0.188#組別對(duì)照組模型組芍藥苷高濃度組芍藥苷低濃度組n 3 3 3 3 IL-1β 1.004±0.114 9.938±2.693***1.070±0.323###2.347±0.602###VEGF 1.001±0.073 5.352±0.097***0.545±0.073###1.275±0.066###NF-κB 1.000±0.024 2.235±0.261***1.609±0.227##1.787±0.076#NLRP3 1.034±0.338 7.005±0.708***3.331±0.605###5.903±0.315 ASC 1.003±0.103 1.641±0.080***1.004±0.071###1.265±0.091##

5 討論

Müller細(xì)胞自內(nèi)界膜貫穿整個(gè)視網(wǎng)膜到達(dá)外界膜，是視網(wǎng)膜內(nèi)最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，占視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的90%。它能維持視網(wǎng)膜組織及結(jié)構(gòu)的完整，并參與神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸，在維持滲透壓穩(wěn)定、調(diào)節(jié)突觸發(fā)育、維持電解質(zhì)平衡及調(diào)節(jié)血-視網(wǎng)膜屏障等方面有至關(guān)重要的作用[12]。Müller細(xì)胞參與多種視網(wǎng)膜疾病[13]，是許多生長(zhǎng)因子和炎癥因子產(chǎn)生的重要來(lái)源[14-15]。視網(wǎng)膜缺氧引起一系列應(yīng)激反應(yīng)，使Müller細(xì)胞激活，異常分泌VEGF，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加血管通透性，使毛細(xì)血管閉塞，進(jìn)而加重視網(wǎng)膜缺血缺氧和促進(jìn)新生血管生成[16]。此外，炎癥在缺血缺氧性視網(wǎng)膜疾病中的作用近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。缺氧和視網(wǎng)膜炎癥密切相關(guān)[16-17]，當(dāng)視網(wǎng)膜受到缺氧刺激時(shí)，Müller細(xì)胞活化，表現(xiàn)為反應(yīng)性膠質(zhì)激活，分泌大量炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α等參與視網(wǎng)膜局部炎癥發(fā)展[18]。本研究選用Müller細(xì)胞rMC-1為研究對(duì)象，用缺氧培養(yǎng)方式模擬人體視網(wǎng)膜缺氧，發(fā)現(xiàn)缺氧培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞活力明顯受到抑制，ELISA和PCR結(jié)果顯示，缺氧培養(yǎng)后，模型組rMC-1細(xì)胞分泌VEGF、IL-1β較對(duì)照組顯著增加，而芍藥苷高、低濃度組細(xì)胞IL-1β、VEGF較模型組減少，且相應(yīng)基因表達(dá)顯著降低，表明芍藥苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)的rMC-1細(xì)胞VEGF、IL-1β分泌有抑制作用。

NLRP3炎癥小體作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是由核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體蛋白3（NLRP3）、ASC和pro-Caspase-1組成的多蛋白復(fù)合物[19]。NLRP3炎癥小體活化包括啟動(dòng)和激活2個(gè)步驟，啟動(dòng)階段由Toll樣受體或細(xì)胞因子受體誘導(dǎo)，它們識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），使NF-κB活化，促進(jìn)NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18轉(zhuǎn)錄和翻譯，PAMPs和DAMPs則促進(jìn)NLRP3、ASC及pro-Caspase-1相結(jié)合，形成炎癥小體，活化Caspase-1，活化的Caspase-1將pro-IL-1β和pro-IL-18剪切為成熟形式，從而誘導(dǎo)下游炎癥反應(yīng)，加重視網(wǎng)膜局部炎癥[20]。

研究發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3炎癥信號(hào)通路可改善VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管新生和滲漏[21]；激活的NLRP3炎癥小體通過(guò)上調(diào)HIF-1α/VEGF軸促進(jìn)人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF分泌[6]；缺氧可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞NLRP3炎癥小體啟動(dòng)和激活，促進(jìn)VEGF基因表達(dá)和分泌[22]。也有研究指出，高糖誘導(dǎo)能顯著提高人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平，且與高糖活化NF-κB和激活NLRP3炎癥小體有關(guān)[23]。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)，慢性高眼壓大鼠NLRP3炎癥小體激活同時(shí)，TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-18等促炎因子含量增加?？梢姡谝暰W(wǎng)膜病變中，NLRP3炎癥小體與VEGF表達(dá)關(guān)系密切。

芍藥苷為水溶性單萜糖苷，具有鎮(zhèn)靜、護(hù)肝、抗炎和調(diào)節(jié)免疫等多種作用[24]。芍藥苷的抗炎作用研究尤為廣泛，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[25]、神經(jīng)炎癥[26]、糖尿病足潰瘍[27]等。本研究結(jié)果顯示，芍藥苷能降低缺氧rMC-1細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1基因及蛋白表達(dá)，提示其可能通過(guò)抑制NF-κB/NLRP3通路，抑制NLRP3炎癥小體激活，進(jìn)而抑制視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)。

綜上所述，芍藥苷可能通過(guò)抑制NF-κB/NLRP3通路下調(diào)細(xì)胞因子VEGF、IL-1β表達(dá)，減輕缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞損傷。但其與該通路的具體結(jié)合方式及其他作用途徑尚不清楚，有待后期進(jìn)一步深入探究。本研究結(jié)果可為缺氧性視網(wǎng)膜血管疾病的防治提供一定參考。