細胞衰老分子機制的研究進展

王學 任麗君 張英為 周玉皆 (南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

細胞衰老現象最早在1961年被報道〔1〕，美國生物學家Leonard Hayflick 在體外培養(yǎng)正常人的成纖維細胞時發(fā)現，即使細胞在最適宜的條件，細胞分裂至一定代數時也會發(fā)生停滯，由此細胞周期進入了一種“不可逆”的停滯狀態(tài)。Hayflick 基于這種現象提出了細胞衰老的概念。因此，細胞增殖的能力極限也被稱為 Hayflick 極限。研究表明〔2〕，這種現象是隨著復制次數的增多，染色體兩端端粒的逐步縮短伴隨端粒酶活性降低所致。后來，隨著研究的深入，研究人員發(fā)現許多因素均可導致細胞衰老，常見的包括活性氧自由基的產生、癌基因的激活或抑癌基因的失活、輻射及各種細胞因子和細胞信號轉導等。本文就細胞衰老分子機制的研究進展進行綜述。

1 細胞衰老

根據發(fā)生機制的不同，細胞衰老可分為兩大類，第一種由生理性原因引起的細胞衰老，稱之為復制性衰老。第二種是指細胞在達到 Hayflick極限之前，細胞就開始了衰老過程，被稱之為過早性衰老。衰老細胞可表現出一系列類似且特異性的特點，這些特點可以作為判斷細胞衰老的標準。這些特征包括：①細胞長久地處于細胞周期阻滯或永久退出細胞周期，增殖標志(如Ki67)缺失;②形態(tài)上，衰老細胞通常變得扁平，胞體和胞核的體積變大;③衰老細胞的細胞質內顆粒增加，即形成衰老相關異染色質集落(SAHF)。在衰老細胞內，SAHF主要表現為染色質凝集，DNA凝結成散在、致密、大小不均一的異染色質顆粒;④端?？s短;⑤衰老相關分泌表型(SASP)：衰老細胞可以分泌多種細胞因子，如胰島素樣生長因子(IGF)、轉化生長因子(TGF)-β、白介素(IL)、Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1等，這些因子通過自分泌或旁分泌的方式作用于衰老細胞本身或周圍其他細胞，從而改變衰老細胞及其周圍的微環(huán)境;⑥表達腫瘤抑制因子P16，P21，P53等;⑦表達衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)， SA-β-gal是一種催化β-半乳糖苷水解為單糖的水解酶，在衰老細胞中過度積累和表達。

2 細胞衰老的機制

2.1端粒參與細胞衰老的發(fā)生機制 端粒是由DNA(5'-TTAGGG-3')重復序列和6種特異性蛋白質組成的環(huán)構象的特殊結構，位于染色體兩端，其功能是保護染色體的末端免受DNA修復過程的侵蝕或融合〔2〕。細胞分裂周期中端粒逐漸縮短，當縮短至Hayflick 極限時，端粒末端暴露、染色體觸發(fā)經典的DNA損傷修復(DDR)反應，細胞周期進入衰老停滯狀態(tài)〔3〕。且隨著年齡的增長端?？s短和衰老細胞的數量均會增加〔4〕。端粒酶是合成端粒DNA的核糖核蛋白，由端粒酶逆轉錄酶(TERT)和非編碼RNA端粒酶(TERC)組成，負責維持端粒長度，還可影響線粒體功能〔5〕。CCHC域含多克隆抗體(ZCCHC)8是脊椎動物的一種含鋅關節(jié)蛋白，調節(jié)端粒酶3'末端成熟。TERT、TERC或ZCCHC8的雜合突變均可表現為經典的短端粒綜合征，從而導致細胞進入衰老狀態(tài)〔6〕。

2.2抑癌基因參與的細胞衰老發(fā)生機制 磷酸酶基因(PTEN)位于十號染色體，為一種抑癌基因，具有磷酸酯酶的活性。在各種細胞中通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/ 蛋白激酶B(AKT)途徑來調節(jié)細胞的生長、增殖、凋亡和黏附。核轉錄因子(NF)-κB是PI3K/AKT信號通路的重要靶標，且NF-κB信號傳導途徑可促進SASP的出現。體外實驗表明，用博來霉素處理肺泡上皮細胞(AEC)觀察到AEC出現細胞衰老的同時PTEN基因表達也降低。進一步研究發(fā)現，敲除PTEN基因可加速AEC衰老，而敲低NF-κB的表達或通過藥理抑制NF-κB信號可逆轉AEC衰老。在肺纖維化動物模型中，上調PTEN基因表達可延長小鼠的壽命，其下調可加速小鼠衰老。這些結果表明，PTEN基因經由NF-κB信號通路負性調控細胞衰老，PTEN基因下調/缺失與肺泡上皮細胞衰老相關〔7〕。

2.3線粒體參與的細胞衰老發(fā)生機制 線粒體是負責產能的雙膜細胞器，其完整性是通過生物合成和吞噬等多個過程協(xié)調維持，統(tǒng)稱為線粒體質量控制(MQC)。MQC失調和炎癥發(fā)生是細胞衰老和衰老相關性疾病的主要特征之一，稱為線粒體功能障礙〔8〕。眾多學者認為線粒體功能障礙導致細胞內線粒體活性氧(ROS)持續(xù)增加，使得線粒體DNA突變積累，氧化磷酸化、抗氧化防御能力受損加重DDR，導致細胞衰老的發(fā)生〔9〕。

此外，研究發(fā)現在衰老的AEC中雷帕霉素/過氧化物酶體增殖物激活的受體-γ復合物1α/β(mTOR/PGC-1α/β)軸明顯上調。在肺纖維化小鼠模型中發(fā)現，隨著該軸的激活細胞中線粒體數目、氧化磷酸化過程、ROS產量均增加。抑制mTOR復合物1的功能不僅恢復了線粒體的穩(wěn)態(tài)，同時也降低了AEC的衰老。Summer等〔10〕將線粒體特異性超氧化物清除劑MitoTempo處理暴露于博萊霉素后的細胞發(fā)現mTOR /PGC-1α/β軸的活性、線粒體耗氧量、細胞衰老標志物的表達均顯著降低。由此推測，mTOR /PGC-1α/β軸在線粒體參與細胞衰老的過程中起到了重要的參與和調控作用。

2.4輻射參與的細胞衰老發(fā)生機制 放射治療是現在多種腫瘤的基本治療手段，放療產生的電離輻射(IR)卻是細胞衰老的強力誘導劑。一方面，IR會導致腫瘤細胞DNA受損，抑制腫瘤細胞的增殖，激活腫瘤免疫監(jiān)視；另一方面，IR可誘導周圍正常細胞衰老，導致正常組織纖維化和器官功能障礙〔11〕。同時IR刺激免疫系統(tǒng)迅速消除這些衰老細胞。如果衰老細胞產量超過免疫系統(tǒng)清除能力或免疫系統(tǒng)受損而無法有效清除這些衰老細胞，則衰老細胞會積累。Palacio等〔12〕發(fā)現將小鼠暴露于IR后脾臟T細胞的增殖反應降低，脾細胞種群中SASP和p16的表達增加。通過消除p16陽性細胞的小鼠發(fā)現受損的T細胞增殖會部分逆轉。此外，從受輻射的脾臟中分離出的巨噬細胞在體外吞噬活性也降低，該活性也通過消除p16表達而得以恢復。這表明IR所導致的衰老細胞被清除后，免疫細胞功能可得到一定的恢復。

2.5其他因素參與的細胞衰老發(fā)生機制

2.5.1DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)參與的細胞衰老發(fā)生機制 DNA-PK是PI3K相關酶家族的成員，由DNA-PK催化亞基(DNA-PKcs)和Ku80、Ku70亞基組成的Ku異二聚體，是DNA損傷反應的主要調控因子，在DNA雙鏈斷裂修復和有絲分裂中起作用〔13〕。最近的證據表明，DNA-PK活性隨年齡增長而增加，從而促進線粒體丟失和體重增加〔14〕。 Liu等〔15〕研究發(fā)現從正常衰老個體分離的成纖維細胞DNA中DNA-PKcs、Ku70、Ku80的表達水平均降低，且抑制DNA-PKcs的表達可使原代血管平滑肌細胞的增殖降低，研究結果顯示DNA-PK表達降低可導致細胞增殖能力下降。Habiel等〔16〕用DNA-PKCs抑制劑Nu7441處理肺成纖維細胞，通過流式細胞儀分析發(fā)現，與未處理的細胞相比，經Nu7441處理的肺成纖維細胞在形態(tài)上變得扁平，體積變大。同時對經Nu7441處理的肺成纖維細胞進行RNA分析，發(fā)現與衰老相關的轉錄本也增加。因此作者推測DNA-PKCs也參與了肺成纖維細胞的衰老。DNA-PK參與細胞衰老發(fā)生的可能原因有二。其一，DNA-PK可維持端粒的功能，Ku亞單位可與端粒結合，缺乏Ku70、Ku80或DNA-PKcs的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)具有更高數量的端粒融合〔17〕。其二，端粒長度的調控是由端粒和端粒酶共同控制。人類細胞系HCT116中DNA-PK的失活縮短了端粒，表明DNA-PK在端粒長度維持中也起一定作用〔18〕。為了確定DNA-PKCs在端粒長度控制中的作用是否依賴于端粒酶，Espejel等〔19〕將DNA-PKCs和端粒酶雙重缺陷的小鼠與單純端粒酶缺陷的小鼠相比，發(fā)現DNA-PKCs和端粒酶雙重缺陷的小鼠端粒縮短的速度更快、程度更重，研究結果表明DNA-PKCs在端粒長度的調控中是依賴于端粒酶的。

2.5.2IL參與的細胞衰老發(fā)生機制 IL-18屬于IL-1 基因家族，是一種促炎性細胞因子，在機體免疫中起作用〔20〕。用IL-18處理肺成纖維細胞72 h后發(fā)現表達β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)陽性細胞顯著增加，且進入G1期細胞比例大幅上升，同時在成纖維細胞中P21、P53和P27的表達也急劇增加。P27蛋白介導細胞G1期阻滯、減緩或阻止細胞分裂。這些結果表明IL-18觸發(fā)肺成纖維細胞的衰老。Klotho是一種新型的抗衰老基因，編碼具有多個多效作用的單程跨膜蛋白；降低Klotho的蛋白水平或活性可導致年齡性相關疾病的發(fā)生甚至降低壽命〔21〕。Zhang等〔22〕發(fā)現IL-18處理肺成纖維細胞72 h后，細胞中Klotho的表達降低；上調Klotho表達水平可減弱IL-18誘導的上述細胞衰老效應，抑制SASP產生。綜上，這些研究提示IL-18可能通過下調Klotho表達促進成纖維細胞衰老。

2.5.3纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1參與的細胞衰老發(fā)生機制 PAI-1是組織型和尿激酶型纖溶酶原激活物的主要抑制劑，可將纖溶酶原轉化為纖溶酶促進纖維蛋白溶解〔23〕。多項實驗發(fā)現〔24，25〕，衰老細胞中PAI-1的表達增加。證據表明〔26〕PAI-1不僅是細胞衰老的標志物，更是細胞衰老的媒介。當細胞處于非分裂狀態(tài)時，細胞內的視網膜母細胞瘤(Rb)抑癌基因處于非磷酸化的狀態(tài)，非磷酸化的Rb和轉錄因子E2F結合，從而綁定E2F、抑制E2F轉錄活性使細胞周期發(fā)生停滯。PAI-1可以誘導P53的活性，激活后的P53可入核誘導P21表達，其調控下游細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子(CDKN1A)基因的轉錄表達。細胞周期素依賴性蛋白激酶(CDK)和細胞周期蛋白(cyclin)是細胞周期調控中起重要作用的兩類蛋白，CDK/cyclin 復合物促使非磷酸化Rb和E2F分離調控細胞進入細胞增殖周期。CDKN1A的表達抑制了 CDK/cyclin 復合物活性，使得磷酸化Rb蛋白轉變?yōu)榉橇姿峄疪b蛋白從而綁定E2F(P53-P21-PRb細胞周期途徑)，細胞發(fā)生周期阻滯，啟動細胞衰老進程。

2.5.4microRNA(miRNA)參與的細胞衰老發(fā)生機制 miRNA是非編碼RNA，可在轉錄后水平調節(jié)基因表達，在多種病理中起著重要的作用。研究報道m(xù)iRNA介導細胞衰老過程〔27〕。P53可誘導miR-34家族miRNA的表達，其已被確定為P53調控細胞周期的下游介質，上調miR-34可導致參與細胞周期的關鍵靶基因包括E2F1、c-Myc和周期蛋白(CCN)E2的表達下調。miR-34表達上調直接抑制c-Myc及其下游P16基因的表達，P16下游CDK/cyclin 復合物活性降低阻止非磷酸化Rb和E2F分離，細胞周期進入阻滯；miR-34上調可直接抑制E2F基因表達，阻止細胞增殖。miRNA通過參與P16-PRb細胞周期增殖途徑，抑制周期中各種靶基因的表達，在轉錄后水平調節(jié)細胞衰老〔28〕。

DNA質量控制和蛋白質質量控制對維持動物生理的年輕化至關重要。因此，DNA質量控制和蛋白質質量控制機制被認為是細胞衰老和衰老的關鍵靶點。然而，這兩種質量控制機制的性能都受到線粒體和胞質中產生的ROS影響〔29〕。已知miRNAs可導致ROS的產生，據報道〔30〕miR-24通過直接靶向DNA拓撲異構酶(TOP)Ⅰ來加劇ROS的產生，破壞DNA質量控制和蛋白質質量控制誘導細胞衰老的發(fā)生。Yu等〔31〕發(fā)現miR-141在復制型和組蛋白去乙?；敢种苿?HDACI)誘導的人骨髓間充質干細胞衰老中的過度表達，ZMPSTE24人源重組蛋白(Q01)是其直接靶標，它參與了層黏連蛋白A的翻譯后成熟，并導致與細胞衰老相關的重組核纖層蛋白前體A的積累，促使細胞進入衰老停滯階段。

2.5.5Wnt信號通路參與的細胞衰老發(fā)生機制 Wnt信號通路控制細胞的遷移、增殖、分化等過程，配體是分泌糖蛋白，可通過作用于各種跨膜受體來激活β-catenin依賴性經典或非經典WNT途徑〔32〕。缺乏Wnt2/2B或β-catenin的小鼠無法形成肺這一事實說明了Wnt信號對于肺發(fā)育的重要性。迄今為止，有關Wnt信號和肺衰老的報道很少。但Lehmann等〔33〕探索了衰老小鼠肺中Wnt相關轉錄本的差異表達，發(fā)現經典的Wnt信號隨著年齡的增長而減少，而在老年肺中非經典Wnt5A的表達增加，并且在老化的造血干細胞(HSC)中Wnt5A的表達也增加。此外，與3個月大的小鼠相比，在12個月大的小鼠肺中Wnt2和β-catenin基因表達被下調。因此，科學家認為肺衰老一定程度上是由Wnt信號通路的異?；顒铀寗?，這個過程也被叫做拮抗多效性或發(fā)育漂移。有研究顯示，秀麗隱桿線蟲中不同Wnt配體的敲除或突變可影響蠕蟲壽命，表明Wnt微環(huán)境的變化也可直接影響衰老〔33〕。

2.5.6TGF-β TGF-β是一種多效性細胞因子，可調節(jié)多種細胞過程〔34〕。證據表明〔35〕，TGF-β信號傳導與衰老相關疾病之間存在多方面的關聯。TGF-β信號轉導受損或表達上調均可導致細胞變性、組織纖維化、再生能力降低、代謝功能異常。TGF-β與細胞表面的配體結合后通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活誘導Smad2和Smad3蛋白磷酸化，形成特異性R-Smads，激活的R-Smads與共同伙伴Smad4形成復合體，該復合物易位至細胞核并通過以下幾種方式參與細胞衰老的過程：①TGF-β上調P15、P21、P27等蛋白的表達及抑制增殖基因c-Myc的轉錄使得細胞進入衰老周期；②TGF-β誘導細胞線粒體產生ROS，觸發(fā)經典的DDR反應，細胞進入衰老停滯狀態(tài)；③TGF-β下調細胞中TERT的表達來抑制端粒酶活性，引起端?？s短，細胞隨即進入衰老周期；④TGF-β使PAI-1的活性、細胞外基質(ECM)的表達均增加，且PAI-1和ECM均可使SASP表達增加，SASP以自分泌或旁分泌方式誘導和維持細胞衰老表型。

綜上，細胞衰老無時無刻不在機體發(fā)生，其既有積極一面，也有消極一面。復制性衰老可保護機體的新陳代謝，阻止受損及衰老細胞的繼續(xù)增殖。過早性衰老參與機體許多病理過程，與衰老相關疾病的發(fā)生密不可分，比如癌癥和纖維化。本文總結了參與細胞衰老發(fā)生的不同機制，為細胞衰老的發(fā)生過程及抗衰老靶向藥物的研究提供了依據。