纖維素酶法提取油莎豆多糖及其抗氧化性

王旭升，吳瓊*，吳迪，于特，劉力齊，康立寧

（1.長春大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130022；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院加工中心，吉林 長春 130033）

油莎豆（Cyperus esculentus）別稱油莎草、地杏仁[1]，屬莎草科塊莖類植物[2]。油莎豆適應(yīng)能力強，并有改良土壤、固沙防風的作用，且產(chǎn)量可觀[3]，在我國許多省市得到了廣泛栽培[4]。油莎豆營養(yǎng)成分豐富，是一種優(yōu)質(zhì)、綜合應(yīng)用價值高的植物資源，具有多種生理功能[5]。油莎豆具有溫和腸胃、保護神經(jīng)的功效[6]，其提取物能夠預(yù)防心臟病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥等疾病[7-8]。多糖作為油莎豆的重要成分，其含量在15%～25%，因為多糖有著獨特的結(jié)構(gòu)且易被修飾[9-10]，故具有降血脂、調(diào)節(jié)免疫等多種生理功能。多糖可作為增稠劑應(yīng)用到蛋白飲料中[11]，還可作為生產(chǎn)嬰幼兒食品、保健產(chǎn)品的原料[12]。

目前對油莎豆的研究主要集中在油脂及淀粉的提取應(yīng)用[13-14]，鮮有對其多糖的研究。油莎豆多糖的提取方法有熱水浸提法、超聲輔助法等。熱水浸提法的優(yōu)點是操作簡單，提取多糖時安全、經(jīng)濟，但存在溫度高、耗時長、多糖得率低等缺點。超聲輔助法的優(yōu)勢在于提取時間短、耗能低；缺點是多糖得率不高。胡煒東等[15]以油莎豆粕為原料，探究提取條件對水溶性多糖提取率的影響，通過水浴浸提法獲得的油莎豆多糖提取率為10.36%；張莉弘等[16]采用超聲輔助法提取的油莎豆多糖得率為14.7%。酶法提取油莎豆多糖是通過酶解細胞壁使胞內(nèi)物質(zhì)溶出，以此來提高多糖的得率[17]。本文采用纖維素酶對油莎豆進行酶解來提取多糖，探究油莎豆多糖的最佳制備工藝及其抗氧化性，以期為油莎豆多糖的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎豆：市售；纖維素酶（酶活10 000 U/g）：深圳潤友化學有限公司；石油醚、苯酚、鹽酸、濃硫酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、氫氧化鈉、葡萄糖：北京化工廠；無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）： 上海麥克林生化科技有限公司；水楊酸：大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；3K15醫(yī)用離心機：曦瑪離心機（揚州）有限公司；JA2003電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；WJX-A1000高速多功能粉碎機：上海緣沃工貿(mào)有限公司；PHS-3C pH檢測計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油莎豆多糖的提取

無雜質(zhì)油莎豆洗凈→烘箱烘干→粉碎后過篩→石油醚脫脂后干燥、過篩[18]→油莎豆粉→加入纖維素酶→油莎豆粉和水按料液比1:25（g/mL）水浴加熱→沸水浴滅酶5 min→離心（6 000 r/min）→取上清液→過濾→油莎豆粗多糖溶液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→加入乙醇于4℃冰箱中靜置24 h→離心（4 000 r/min）得沉淀→真空冷凍干燥→油莎豆多糖。

1.3.2 多糖含量的測定

分別以葡萄糖濃度（x，μg/mL）和490 nm處吸光度（y）為橫坐標和縱坐標繪制標準曲線，葡萄糖標準曲線方程為 y=0.015 5x+0.083 5；R2=0.998。取 2.5 μL 0.1 mg/mL的油莎豆多糖溶液，進行多糖含量的測定[19]。

1.3.3 多糖得率的計算

多糖得率按下式計算。

油莎豆多糖得率/%=（T×10-6×W×P）/M×100

式中：M為原材料質(zhì)量，g；T為回歸方程計算得到的油莎豆多糖濃度，μg/mL；W為定容的體積，mL；P為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素試驗

稱取2 g油莎豆粉，以油莎豆多糖得率為指標，進行單因素試驗。

1）控制酶解溫度為60℃，加酶量為1.5%，pH值為 4.5，酶解時間設(shè)置為 10、20、30、40、50 min，考察酶解時間對油莎豆多糖得率的影響。

2）控制酶解時間為30 min，加酶量為1.5%，pH值為 4.5，酶解溫度設(shè)置為 40、50、60、70、80 ℃，考察酶解溫度對油莎豆多糖得率的影響。

3）控制酶解時間為30 min，酶解溫度為60℃，pH值為4.5，加酶量設(shè)置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察加酶量對油莎豆多糖得率的影響。

4）控制酶解時間為30 min，酶解溫度為60℃，加酶量為 1.5%，pH 值設(shè)置為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，考察pH值對油莎豆多糖得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

以酶解時間、酶解溫度、加酶量、pH值為考察因素，以多糖得率為響應(yīng)值，運用Design-Expert8.0.6進行四因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計，優(yōu)化油莎豆多糖提取工藝條件。因素水平見表1。

表1 試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of test design

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定

分別配制濃度為 0.5、2.5、4.5、6.5、8.5 mg/mL 5 個梯度的油莎豆多糖溶液，各取2mL不同濃度樣品溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液[20]，室溫下避光靜置30 min后，于517 nm波長下測得吸光度A1，同時做空白對照，測定2 mL蒸餾水和2 mL DPPH溶液吸光度為A0，2 mL無水乙醇和2 mL多糖溶液測得吸光度為A2，以VC為參比，各樣品測3次后取平均值，DPPH自由基清除率計算公式如下。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.3.7 羥自由基清除能力的測定

分別配制濃度為 0.5、2.5、4.5、6.5、8.5 mg/mL 5 個梯度的油莎豆多糖溶液，取2 mL不同濃度樣品溶液與2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液、2 mL H2O2混合，37℃下反應(yīng)1 h，于517 nm波長下測得吸光度 A1，2 mL樣品加入 2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液、2 mL蒸餾水，避光反應(yīng)后測得吸光度A2，2 mL蒸餾水加入2 mL FeSO4溶液、2 mL H2O2、2 mL水楊酸溶液，避光反應(yīng)后測得吸光度A0，以VC為參比[21]。各樣品測3次后取平均值，羥自由基清除率計算公式如下。

羥自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)3次，使用Origin 8.5進行繪圖，采用Design-Expert8.0.6進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶解時間對多糖得率的影響

酶解時間對油莎豆多糖得率的影響見圖1。

圖1 酶解時間對多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on the yield of polysaccharide

從圖1中可以看出，油莎豆多糖得率隨酶解時間的延長先升高后降低，在酶解30 min時，多糖得率達到最大值。原因可能是在酶的催化作用下，多糖從細胞內(nèi)溶出，含量逐漸增加；但隨酶解時間的延長，會導(dǎo)致酶的活性降低[22]。因此，選擇酶解時間中心水平為30 min進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.1.2 酶解溫度對多糖得率的影響

酶解溫度對油莎豆多糖得率的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on the yield of polysaccharide

由圖2可以看出，隨酶解溫度升高，油莎豆多糖得率呈先升高后降低的趨勢，在酶解溫度60℃時多糖得率達到最大值。低溫時，酶解反應(yīng)速率較慢且酶的活力低，溫度過高會弱化酶的活性，活性物質(zhì)亦可能會發(fā)生降解[23]。因此，選擇酶解溫度中心水平為60℃進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.1.3 加酶量對多糖得率的影響

加酶量對油莎豆多糖得率的影響見圖3。

圖3 加酶量對多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the yield of polysaccharide

從圖3可以看出，隨加酶量增大，多糖得率先升高后在加酶量1.5%時趨于平緩，原因是加酶量越多，酶與底物的結(jié)合率會變大，促進酶解反應(yīng)的進行，使胞內(nèi)多糖擴散到溶劑中，多糖得率上升；當加酶量大于1.5%后，趨勢較為平緩，說明加酶量充足，反應(yīng)已達飽和狀態(tài)[24]。因此，選擇加酶量中心水平為1.5%進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.1.4 pH值對多糖得率的影響

pH值對油莎豆多糖得率的影響見圖4。

圖4 pH值對多糖得率的影響Fig.4 Effect of pH value on the yield of polysaccharide

由圖4可以看出，隨著pH值的增大，多糖得率呈先上升后下降的趨勢。pH值為4.5時得率達到峰值，之后隨pH值增大，多糖得率逐漸減少。因為酶在一定pH值范圍內(nèi)發(fā)揮作用，超出此范圍可能會使酶的催化效率降低，故多糖得率下降。因此，選擇pH值中心水平為4.5進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface optimization

運用Design-Expert8.0.6對表2的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到多糖得率（R）與酶解時間（A）、酶解溫度（B）、加酶量（C）、pH 值（D）之間的二次多項回歸方程為R=15.41+1.71A+0.73B+0.80C+0.18D-0.32AB-0.39AC-0.13AD-1.29BC+1.50BD+1.06CD-2.33A2-2.79B2-0.27C2-1.27D2。

根據(jù)表3可知，模型P＜0.000 1，表明模型極顯著。決定系數(shù) R2為 0.931 0，R2Adj為 0.862 0，變異系數(shù)（C.V）為6.97%。精密度為13.201，大于4，說明該模型可以用來對試驗結(jié)果進行擬合，可以用此模型說明各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。失擬項P值=0.170 9＞0.05，失擬項不顯著。 A、C、BD、A2、B2、D2的影響極顯著（P＜0.01），B、BC、CD 的影響顯著（P＜0.05）。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用的響應(yīng)面圖見圖5～圖7。

圖5 酶解溫度和加酶量的交互作用對多糖得率的影響Fig.5 Effect of interaction between enzymolysis temperature and enzyme dosage on polysaccharide yield

圖6 酶解溫度和pH值的交互作用對多糖得率的影響Fig.6 Effect of interaction between temperature and pH value on polysaccharide yield

圖7 加酶量和pH值的交互作用對多糖得率的影響Fig.7 Effect of interaction between enzyme dosage and pH value on polysaccharide yield

從圖5可以看出，當酶解溫度不變時，隨著加酶量的增大，油莎豆多糖得率呈先上升后下降的趨勢；加酶量不變時，隨酶解溫度的升高，油莎豆多糖得率呈先上升后下降的趨勢。從圖6可以看出，當酶解溫度不變時，隨著pH值的提高，油莎豆多糖得率呈先上升后降低的趨勢；當pH值不變時，隨酶解溫度的升高，油莎豆多糖得率呈先上升后下降的趨勢。從圖7可以看出，當加酶量不變時，隨著pH值的提高，油莎豆多糖得率呈先上升后降低的趨勢；當pH值不變時，隨加酶量的升高，油莎豆多糖得率呈先上升后下降的趨勢。由圖5～圖7可知，響應(yīng)曲面坡度均較為陡峭，各因素之間的交互作用對多糖得率的影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗證試驗

利用Design-Expert8.0.6軟件，對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到油莎豆多糖最佳工藝為酶解時間33.87min、酶解溫度60.39℃、加酶量1.7%、pH4.55，此時多糖得率預(yù)測值為15.98%。根據(jù)試驗的實際可操作性，將工藝條件調(diào)整為酶解時間34 min、酶解溫度61℃、加酶量1.7%、pH4.55，進行3次平行驗證試驗，實際得到多糖得率為15.86%，與預(yù)測值基本接近。

2.3 抗氧化能力結(jié)果分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力

不同濃度油莎豆多糖和VC對DPPH自由基清除能力的對比見圖8。

由圖8可知，油莎豆多糖對DPPH自由基的清除能力較強。濃度為0.5 mg/mL～8.5 mg/mL時，油莎豆多糖對DPPH自由基的清除率與其濃度呈正相關(guān)，清除效果低于相同濃度條件下VC對DPPH自由基的清除能力。當濃度為8.5 mg/mL時，油莎豆多糖對DPPH自由基清除能力可達到VC對DPPH自由基清除能力的2/3左右[25]，說明油莎豆多糖具有良好的清除DPPH自由基的能力。

圖8 油莎豆多糖和VC對DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH radical scavenging activities of Cyperus esculentus polysaccharide and VC

2.3.2 羥自由基清除能力

不同濃度油莎豆多糖和VC對羥自由基清除能力的對比見圖9。

圖9 油莎豆多糖和VC對羥自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl radical scavenging activities of Cyperus esculentus polysaccharide and VC

由圖9可知，濃度為0.5 mg/mL～8.5 mg/mL時，油莎豆多糖對羥自由基的清除率隨濃度的增加而增大；當多糖濃度從0.5mg/mL增長到8.5mg/mL時，羥自由基的清除率從11.97%增長到72.82%，VC對羥自由基的清除率始終維持在極高水平。在濃度為8.5 mg/mL時，油莎豆多糖對羥自由基清除率達到VC對其清除率的50%以上，表明油莎豆多糖具備較強的清除羥自由基的能力。

3 結(jié)論

本研究采用纖維素酶法提取油莎豆中的多糖，利用響應(yīng)面分析法進行優(yōu)化，以多糖得率為指標，得到油莎豆多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)為酶解時間34 min、酶解溫度61℃、加酶量1.7%、pH4.55，此時多糖得率為15.86%。各因素對多糖得率影響的先后順序為酶解時間＞加酶量＞酶解溫度＞pH值。通過測定油莎豆多糖清除DPPH自由基、羥自由基能力來評價其抗氧化性，油莎豆多糖的DPPH自由基和羥自由基清除率分別達到60.54%、72.82%，說明其具有較好的抗氧化性。選取作用條件溫和的酶法提取多糖，可破壞細胞壁，并有效地保留油莎豆多糖活性，為油莎豆多糖資源的綜合利用及多糖的活性、結(jié)構(gòu)分析等提供依據(jù)。