子宮頸癌及癌前病變中E6/E7 mRNA的表達(dá)水平及與HR-HPV感染的相關(guān)性分析

劉丹丹 孫健 鄔劍

子宮頸癌屬常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率、死亡率僅次于乳腺癌，隨著臨床對子宮頸癌的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)該疾病的發(fā)生與癌基因表達(dá)異常、病毒感染、性生活混亂、早婚早育、不良生活習(xí)慣等多種因素相關(guān)[1]。有報(bào)道稱，高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）感染在子宮頸癌中較為普遍，HR-HPV 持續(xù)感染會引發(fā)子宮頸細(xì)胞由正常狀態(tài)轉(zhuǎn)化為惡性病變，最終誘發(fā)子宮頸癌前病變、子宮頸癌[2]。HR-HPV 包括多種類型，其中以HPV16、HPV18 型最為常見，但臨床上對HPV 的檢測目的在于篩查出高危病變?nèi)巳?，并非篩查HR-HPV 感染[3]。因此尋找與HR-HPV感染相關(guān)的分析標(biāo)記物，對子宮頸癌及癌前病變預(yù)測較為重要。研究認(rèn)為，HPV 基因組中E6/E7 所編碼的E6、E7 蛋白具有誘發(fā)子宮頸上皮細(xì)胞癌變的作用[4]?；谏鲜霰尘?，本次研究分析了HPV 基因組E6/E7mRNA 和HR-HPV 感染的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年2 月-2021 年2 月于佳木斯市婦幼保健院確診的43 例子宮頸癌患者作為子宮頸癌組，66 例癌前病變患者作為癌前病變組，另外同期選取于本院首次確診的80 例慢性子宮頸炎患者作為子宮頸炎組。納入標(biāo)準(zhǔn)：子宮頸癌組符合子宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；癌前病變組符合子宮頸癌前病變診斷標(biāo)準(zhǔn)；子宮頸炎組符合單純子宮頸炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，且首次確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：處于月經(jīng)/妊娠期/哺乳期；合并心肺等功能障礙；合并其他惡性腫瘤；伴精神疾?。徽Z言表達(dá)、聽力異常。本項(xiàng)研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意，自愿參加。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有研究對象均做宮頸活檢，取子宮頸組織，備用。

1.2.2 E6/E7 mRNA 檢測 取子宮頸組織樣本，分離出宮頸上皮細(xì)胞；用2 mL 雙蒸水混懸細(xì)胞，加入3 μL 蛋白酶K、300 μL 組織裂解液，在65 ℃的環(huán)境溫度下孵育0.5 h，終止反應(yīng)；使用美國Diacarta 公司生產(chǎn)的QuantiVirus TM 便攜式冷光儀讀取E6/E7 mRNA 拷貝數(shù)。陽性標(biāo)準(zhǔn)：拷貝數(shù)＞0。取宮頸組織樣本，采用免疫組化法測定E6/E7 蛋白陽性表達(dá)情況。陽性標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.2.3 HR-HPV 感染測定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測HR-HPV 感染情況。陽性標(biāo)準(zhǔn)：病毒載量≥103copies/mL。

1.2.4 E6/E7 mRNA 與HR-HPV 感染的相關(guān)性 根據(jù)HR-HPV 載量高低分為中低載量（103copies/mL≤HR-HPV 載量≤106copies/mL）、高載量（106copies/mL＜HR-HPV 載量≤107copies/mL）、超高載量（HRHPV 載量＞107copies/mL）三個等級。將癌前病變組66 例患者、子宮頸癌組43 例患者根據(jù)HR-HPV載量高低分為中低載量組、高載量組、超高載量組三個亞組，對比三個亞組間E6/E7 mRNA 表達(dá)水平，并分析兩者的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以（x-±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料對比 子宮頸炎組平均年齡（39.22±3.65）歲，平均體重指數(shù)（body mass index，BMI）為（23.87±2.20）kg/m2，孕產(chǎn)次≥2 次23 例，＜2 次57 例。癌前病變組平均年齡（38.94±3.43）歲，平均BMI（23.01±2.31）kg/m2，孕產(chǎn)次≥2 次15 例，＜2 次51 例，子宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）分 期：Ⅰ期19 例，Ⅱ期25 例，Ⅲ期22 例。子宮頸癌組平均年齡（38.42±3.75）歲，平均BMI（23.26±2.17）kg/m2，孕產(chǎn)次≥2 次18 例，＜2 次25 例，臨床分期：Ⅰ期10 例，Ⅱ期8 例，Ⅲ期11 例，Ⅳ期14 例。三組年齡、BMI、孕產(chǎn)次等一般資料對比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 三組E6/E7 mRNA 表達(dá)情況對比 三組E6/E7 mRNA 陽性率、拷貝數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；子宮頸癌組E6/E7 mRNA 陽性率、拷貝數(shù)均高于癌前病變組、子宮頸炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；癌前病變組E6/E7 mRNA 陽性率、拷貝數(shù)均高于子宮頸炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 E6、E7免疫組化圖（SP，×100）

表1 三組E6/E7 mRNA表達(dá)情況對比

2.3 E6/E7 mRNA 與癌前病變組、子宮頸癌組患者疾病分期的關(guān)系分析 E6/E7 mRNA 與癌前病變組患者CIN 分期有關(guān)，Ⅲ期患者E6/E7 mRNA拷貝數(shù)高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=148.069，P＜0.001）。E6/E7 mRNA 與子宮頸癌組臨床分期有關(guān)，Ⅳ期患者E6/E7 mRNA 拷貝數(shù)高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=192.731，P＜0.05）。見表2。

表2 E6/E7 mRNA與癌前病變組、子宮頸癌組患者疾病分期的關(guān)系分析

2.4 三組HR-HPV 感染情況對比 子宮頸癌組HR-HPV 感染陽性率、病毒載量均高于癌前病變組、子宮頸炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。癌前病變組HR-HPV 感染陽性率、病毒載量高于宮頸炎組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 三組HR-HPV感染情況對比

2.5 癌前病變組、子宮頸癌組中HR-HPV 不同病毒載量分布情況分析 癌前病變組中HR-HPV 病毒中低載量11 例（24.44%）、高載量7 例（15.56%）、超高載量27 例（60.00%）；子宮頸癌組中HRHPV 病毒中低載量5 例（12.50%）、高載量11 例（27.50%）、超高載量24 例（60.00%）。兩組均以HR-HPV 超高載量占比最高。

2.6 子宮頸癌及癌前病變中E6/E7 mRNA 與HRHPV 感染的相關(guān)性分析 中低載量組、高載量組、超高載量組的HP-HPV 病毒載量和E6/E7 mRNA 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。超高載量組HP-HPV 病毒載量和E6/E7 mRNA 均高于高載量組、中低載量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。相關(guān)性分析顯示，E6/E7 mRNA 與HR-HPV之間關(guān)系為正相關(guān)（r=0.431，P＜0.001）。

表4 E6/E7 mRNA與HR-HPV感染的相關(guān)性（）

表4 E6/E7 mRNA與HR-HPV感染的相關(guān)性（）

*與超高載量組比較，P＜0.05。

3 討論

目前用于診斷子宮頸癌的生物標(biāo)志物較多，主要包括HR-HPV 核酸、HPV 蛋白等，部分學(xué)者認(rèn)為，子宮頸癌及癌前病變中應(yīng)用HR-HPV 診斷具有較高的敏感性[5]，但隨著其逐漸應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，因宿主免疫系統(tǒng)的清除作用，HR-HPV 感染多短暫，診斷準(zhǔn)確性并不理想[6-7]。為了彌補(bǔ)上述缺點(diǎn)，近幾年提出了多種診斷子宮頸病變的生物標(biāo)記物，包括特定蛋白檢測、特定基因甲基化檢測、HPV 病毒基因和宿主細(xì)胞基因組整合狀態(tài)檢測及HPV 相關(guān)基因組檢測等，其中以E6/E7 研究較多[8]。在上述背景下，本文進(jìn)一步分析驗(yàn)證，子宮頸癌及癌前病變中E6/E7 mRNA 表達(dá)水平及與HR-HPV 感染的相關(guān)性，以提高臨床對子宮頸病變診斷的準(zhǔn)確性。

HR-HPV 中主要的功能調(diào)節(jié)蛋白均位于基因組E 區(qū)，包 括E1、E2、E4、E5、E6、E7 等[9-10]。其中E6 具有致癌作用，引發(fā)子宮頸上皮細(xì)胞異常的途徑較多，其中最為經(jīng)典的途徑為與E6 蛋白結(jié)合，經(jīng)調(diào)解p53 癌基因的表達(dá)，促使p53 降解、失活，最終促進(jìn)細(xì)胞癌變[11-13]。在HR-HPV 感染后，E7可與pRb 蛋白發(fā)生結(jié)合作用，促進(jìn)細(xì)胞周期中G1進(jìn)入S 期所需基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而經(jīng)擾亂子宮頸上皮細(xì)胞正常的生物學(xué)行為，促使細(xì)胞惡性增殖[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，HR-HPV 感染后將E6/E7 DNA 整合至宮頸上皮細(xì)胞基因組中，誘導(dǎo)E6/E7 基因表達(dá)，激活對應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)子宮頸癌變[17]。因此臨床研究認(rèn)為，正常子宮頸轉(zhuǎn)變?yōu)樽訉m頸癌前病變、子宮頸癌共需要以下幾個階段，HR-HPV游離感染、整合感染、整合感染轉(zhuǎn)錄活動期、整合感染翻譯活動期及細(xì)胞形態(tài)改變期，E6/E7 全程參與上述過程[18-20]。本文結(jié)果顯示，E6/E7 在不同宮頸病變中表達(dá)不同，在子宮頸癌前病變、子宮頸癌中的表達(dá)明顯高于子宮頸炎患者，且子宮頸癌患者E6/E7 mRNA 表達(dá)高于癌前病變患者，此結(jié)果提示，E6/E7 參與子宮頸癌變過程，其表達(dá)升高可能與HR-HPV 持續(xù)感染后E6/E7 表達(dá)被激活有關(guān)。

臨床有報(bào)道稱，當(dāng)HR-HPV 感染子宮頸上皮細(xì)胞后，癌基因E6/E7 無限復(fù)制，處于活躍期，子宮頸癌變的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高[21-22]。本文結(jié)果顯示，HRHPV 載量不同E6/E7 mRNA 表達(dá)不同，其載量越高E6/E7 mRNA 表達(dá)水平越高，分析其原因可能與HR-HPV 持續(xù)感染過程中，子宮頸上皮細(xì)胞癌變，癌基因E6/E7 表達(dá)較為強(qiáng)烈，進(jìn)而促進(jìn)子宮頸癌的形成相關(guān)。本文進(jìn)一步分析兩者之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者表現(xiàn)為正相關(guān)，在一定程度上證實(shí)了上述結(jié)論。

雖然本文分析了子宮頸癌及癌前病變中E6/E7 mRNA 與HR-HPV 感染的關(guān)系，但并未具體研究兩者間相關(guān)的作用機(jī)制，且本次所納入的樣本量較少，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)可能存在一定的偏倚，因此還需進(jìn)一步加大樣本量深入研究分析，以期望為臨床上子宮頸癌及癌前病變的篩查提供參考。

綜上所述，E6/E7 mRNA 在子宮頸癌及癌前病變中表達(dá)水平明顯升高，與癌前病變相比，在子宮頸癌中表達(dá)更高，且與HR-HPV 感染密切相關(guān)。