雞球蟲病活疫苗實(shí)驗(yàn)室安全性試驗(yàn)

呂寧寧，王宗升，馬冬，邵三敏，許榮強(qiáng)，牛營，賈鑫玉

（青島易邦生物工程有限公司 山東青島 266113）

隨著生活水平不斷提高，雞肉的品質(zhì)也被大眾所要求。家禽飼養(yǎng)周期短，投資成本比較小，深受廣大畜牧行業(yè)投資者的喜歡。我國雞品種種類豐富多樣，雞肉脂肪含量少，肉質(zhì)鮮美，深受大眾喜歡。近幾年經(jīng)濟(jì)不斷地發(fā)展，規(guī)模化養(yǎng)殖場越來越多，伴隨著養(yǎng)殖場的雞球蟲病也越來越多，幾乎所有養(yǎng)殖場深受球蟲病的危害。球蟲病已經(jīng)給養(yǎng)殖場造成多達(dá)幾十億的損失。隨著科研水平不斷進(jìn)步提高，雞球蟲活疫苗的開發(fā)研究越來越多，可以有效解決家禽動(dòng)物的耐藥性問題并且能夠改善雞的肌肉品質(zhì)和蛋品質(zhì)，對人們來說可以減少藥物殘留食用的危害。目前市面上球蟲病的疫苗基本可以控制場內(nèi)雞球蟲病的侵害，但不能完全有效的控制。雞球蟲種類較多，會(huì)出現(xiàn)疫苗不對型，導(dǎo)致球蟲病無法控制。雞球蟲活疫苗從上市至今銷售量一直在增長，僅Coccivac 和Immucox 在10 年之間共銷售了上百億頭份[1]。本文主要對雞球蟲活疫苗的研究進(jìn)展以及球蟲疫苗實(shí)驗(yàn)室安全性試驗(yàn)評(píng)價(jià)等方面進(jìn)行概述。

1 雞球蟲病研究進(jìn)展

1.1 雞球蟲病

1）雞球蟲生物學(xué)特性及分類。

雞球蟲屬于艾美耳屬，有四個(gè)孢子囊，八個(gè)子孢子。球蟲的生活史可分三個(gè)階段：孢子生殖（sporogony）在宿主體外，裂殖生殖（merogony）、配子生殖（gametogony）在宿主體內(nèi)[2]。Sporogony 生殖需要在濕潤、有氧的條件下發(fā)育形成卵囊，未形成卵囊的孢子不具有傳染性。Merogony 生殖主要是家禽在采食吸入到消化道，通過胃內(nèi)容物碾磨、胃溶液、膽汁等消化釋放出子孢子，從而入侵到腸道上皮細(xì)胞進(jìn)行裂殖。Gametogony 生殖又叫有性生殖，裂殖子發(fā)育形成小配子體，小配子與大配子結(jié)合形成合子，發(fā)育形成卵囊，最終排出腸道。

全世界公布雞球蟲種類有14 種以上，我國大概有7 種，其中柔嫩艾美耳球蟲（eimeria tenella）、毒害艾美耳球蟲（eimeria necatrix）、巨型艾美耳球蟲（eimeria maxima）在我國占據(jù)較多[3]。該寄生蟲主要通過糞口傳播感染雞，傳染源主要有水、糞便、食物等。

2）雞球蟲病流行病學(xué)。

雞球蟲病是我國第二類動(dòng)物疫病，主要寄居在雞腸道內(nèi)的一種寄生蟲病。雞球蟲病廣泛分布于全球。發(fā)病不分季節(jié)、日齡段，各個(gè)日齡段均可發(fā)病，所有日齡均易感。雞場內(nèi)發(fā)病率高達(dá)50%，死亡率20%以上。迄今為止，大部分養(yǎng)殖戶還是在用抗生素進(jìn)行球蟲治療，導(dǎo)致球蟲病耐藥性越來越嚴(yán)重。

雞球蟲容易適宜外界環(huán)境，球蟲卵具有堅(jiān)硬且密度大的卵囊壁，可以在糞便和土壤中存在很長時(shí)間。常見的消毒劑（84 消毒液、75%酒精）常規(guī)配比無法殺死球蟲，10%的氨水、燒堿等可以殺死球蟲，40 ℃以上可以殺死蟲卵，在干燥不潮濕的地方球蟲不易生長。最常見的柔嫩艾美耳球蟲主要寄生于在30 日齡左右雞，急性聚集性暴發(fā)致死率可達(dá)100%。巨型艾美耳球蟲主要發(fā)病于蛋雞和大日齡雞，致死率不高。

3）雞球蟲病免疫機(jī)制。

感染雞球蟲病的主要臨床特征是精神沉郁、消瘦、蛋雞產(chǎn)蛋率下降、血痢、死亡等。解剖觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟腸道彌散性出血、盲腸腫大充血，嚴(yán)重時(shí)小腸發(fā)黑壞死。一般感染7 天后癥狀明顯。不同種類的球蟲對應(yīng)不同的抗原，其中巨型艾美耳球蟲的抗原性最強(qiáng)。機(jī)體感染后主要激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，抵抗球蟲對機(jī)體的侵害。

T 細(xì)胞介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌淋巴因子，通過吞噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞阻止寄生蟲入侵，吞噬細(xì)胞可以非特異性的吞噬子孢子和裂殖子并且參與機(jī)體免疫防御機(jī)制，做出免疫應(yīng)答。體液免疫主要是通過機(jī)體產(chǎn)生抗體，與抗原發(fā)生中和，從而抵抗入侵。體液免疫產(chǎn)生IgA、IgM 和IgG，最先抵御寄生蟲入侵的是IgM 但無記憶功能。當(dāng)臨床癥狀比較明顯時(shí)，IgG 抗體也開始出現(xiàn)，第14 天抗體達(dá)到高峰，之后開始下降，IgG 抗體有較強(qiáng)的免疫記憶功能。

1.2 雞球蟲病疫苗

雞球蟲活疫苗研究非常廣泛，目前有強(qiáng)毒活苗、弱毒活苗、基因亞單位疫苗和核酸DNA 疫苗。強(qiáng)毒活苗是自然收集蟲卵從糞便和腸道中，然后培養(yǎng)、純化所需的種類，按照不同球蟲比例混合制成。強(qiáng)毒苗的缺點(diǎn)在于采食量降低、飼料轉(zhuǎn)化率的降低，從而影響雞的生長速度。弱毒活苗可以通過冷卻、加熱、輻射、化學(xué)誘導(dǎo)劑等物理化學(xué)的方法對蟲卵進(jìn)行弱化，還有可以通過雞胚連續(xù)傳代獲得致病性低的活疫苗。弱毒活疫苗的缺點(diǎn)是傳達(dá)多次后毒力恢復(fù)，遺傳穩(wěn)定性差。

DNA 疫苗是通過篩選出球蟲的抗原基因插入到所表達(dá)的宿主載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，注射到動(dòng)物體內(nèi)，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。用E.tenella 的PET-TA4 重組蛋白表達(dá)的活菌免疫雞只，攻毒后免疫組的RWG 高于對照組、卵囊產(chǎn)量明顯低于攻毒組。DNA 疫苗自身免疫安全，制備高效簡單，缺點(diǎn)是可能出現(xiàn)基因突變與免疫耐受等?；騺唵挝灰呙缡侨コ乖杏泻?，只保留其抗原性，進(jìn)行母源免疫獲得抗體。亞單位疫苗可以通過肌肉免疫激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體。

2 雞球蟲病活疫苗安全性試驗(yàn)

2.1 試驗(yàn)方法

運(yùn)用一次單劑量接種試驗(yàn)、單劑量重復(fù)接種試驗(yàn)和一次超劑量接種試驗(yàn)三種類型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并設(shè)立空白對照組。注射疫苗種類方式、飼養(yǎng)方式、飼料品種、雞品種健康狀況嚴(yán)格執(zhí)行一致。不同組別分開飼養(yǎng)，按規(guī)定時(shí)間進(jìn)行接種。按照中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的《獸用生物制品實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行安全性檢測，為該疫苗的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

單劑量接種試驗(yàn)一般是在雛雞出生4 d 后接種一次，計(jì)量按照疫苗說明書最適量進(jìn)行注射，接種后每天觀察雞情況并記錄并且在第7 天和第14 天進(jìn)行稱重、剖檢。單劑量重復(fù)接種試驗(yàn)是在雛雞出生4 d 后接種第一次，間隔14 d 后接種第二次，接種后每天觀察雞情況并記錄并且在第7 天和第14 天進(jìn)行稱重、剖檢。一次超劑量接種試驗(yàn)是按照疫苗說明書最適劑量的10 倍、20 倍、40 倍、100 倍進(jìn)行接種，接種后每天觀察雞情況并記錄并且在第7 天和第14 天進(jìn)行稱重、剖檢。

2.2 安全性效果評(píng)價(jià)指標(biāo)

雞球蟲疫苗接種開始后，每日對雞的精神狀況、采食情況、接種部位情況、呼吸情況、糞便收集、雞死亡情況等進(jìn)行觀察并記錄。對試驗(yàn)期間雞的體重和體溫進(jìn)行記錄。接種后第7 天和14 天進(jìn)行剖檢，對內(nèi)臟器官（心、肝、脾、肺、腎、腸道）、免疫器官（法氏囊）、注射部位的肌肉進(jìn)行物理方法肉眼觀察。并取十二指腸、空腸、回腸、盲腸等相對應(yīng)的內(nèi)臟組織進(jìn)行切片染色觀察（10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察）。測定實(shí)驗(yàn)雞的生長性能以及肌肉品質(zhì)性狀。

2.3 雞球蟲病疫苗安全性評(píng)價(jià)結(jié)果

一次單劑量接種試驗(yàn)雞群表現(xiàn)正常，雞群不會(huì)出現(xiàn)死亡、體重下降現(xiàn)象。剖檢腸道病少見，一般會(huì)出現(xiàn)腸道增生出血，十二指腸個(gè)別會(huì)出現(xiàn)少量白色結(jié)節(jié)，盲腸極個(gè)別會(huì)出血；腸道黏膜內(nèi)能夠找到少量球蟲；其余器官未發(fā)生病變，在器官中未找到球蟲以及蟲卵[4]。與空白對照組相比較無差異。在對腸道組織進(jìn)行石蠟切片、包埋、HE 染色、顯微鏡下染色鏡檢觀察，并未發(fā)現(xiàn)腸道黏膜脫落，腸道正常，其余器官組織也無明顯病變。表明一次單劑量接種對雞無異常情況表現(xiàn)，對雞安全。

單劑量重復(fù)接種試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)過程中雞群表現(xiàn)正常，一般也不會(huì)出現(xiàn)死亡。第二次接種7 天后剖檢觀察，十二指腸出現(xiàn)少量白色結(jié)節(jié)、空腸脹氣、盲腸有出血點(diǎn)，其余器官組織無明顯可見病變。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，十二指腸出現(xiàn)黏膜斷裂、脫落，腸道內(nèi)出現(xiàn)大量的蟲體，并在小腸內(nèi)黏膜固有層看到蟲體和蟲卵。表明單劑量重復(fù)接種對雞無異常情況表現(xiàn)，無肉眼可見病變，對雞安全。

一次超劑量接種試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)中，100 倍超劑量接種后第二天就出現(xiàn)精神沉郁、采食量下降，一周出現(xiàn)死亡。其余倍數(shù)劑量無明顯癥狀，鏡檢下觀察十二指腸黏膜嚴(yán)重脫落，出現(xiàn)大量白色結(jié)節(jié)，腸黏膜出血。黏膜固有層出現(xiàn)大量球蟲和蟲卵，并有淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞出現(xiàn)。個(gè)別雞出現(xiàn)肝臟腫大、心肌纖維腫大、腎小管腫大壞死，采食量與日增重均下降。一次超劑量接種對雞出現(xiàn)肉眼可見生理反應(yīng)，出現(xiàn)臨床癥狀，同時(shí)機(jī)體出現(xiàn)防御抵抗炎癥反應(yīng)的嗜酸性淋巴細(xì)胞。

3 討論

安全性實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)疫苗的安全使用性，為生產(chǎn)臨床提供基礎(chǔ)評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前市面上出現(xiàn)的雞球蟲病三價(jià)活疫苗（柔嫩+毒害+巨型艾美耳球蟲三種）、雞球蟲病四價(jià)活疫苗（柔嫩+堆型+巨型+毒害艾美耳球蟲四種），通過分離、純化、培養(yǎng)、弱化后得到疫苗。

雞球蟲的免疫抗體水平在一定條件下會(huì)隨著接種雞球蟲活疫苗的劑量而增加[5]。球蟲抗體水平隨著時(shí)間的延長而降低，二次免疫會(huì)再次激發(fā)機(jī)體的免疫記憶，提升機(jī)體的抗體水平且持續(xù)時(shí)間長。選擇小日齡接種雞球蟲疫苗，由于幼禽免疫系統(tǒng)發(fā)育不夠完善，不能夠產(chǎn)生足夠的抵抗能力。選擇大日齡的雞，不能夠在球蟲高發(fā)期機(jī)體獲得高水平抗體水平，導(dǎo)致雞場球蟲大面積暴發(fā)。王麗[6]研究結(jié)果顯示，Eimeria Tenella 和Eimeria acervulina 活疫苗株兩次免疫間隔時(shí)間為7～11 d，雛雞能夠獲得很好的抗體免疫力?！?/p>