小檗胺對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響及其機(jī)制

陶荔，嚴(yán)佳棟

蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇張家港 215600

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率和致死率均位居第一，對(duì)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)造成巨大影響。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的類型。目前對(duì)肺癌的治療主要包括傳統(tǒng)化療、放療、靶向藥物治療，近年來免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用取得了一定的療效，但是仍然存在腫瘤耐藥、易復(fù)發(fā)以及不良反應(yīng)重的難題。因此，尋找有效、安全的治療藥物是臨床迫切需要解決的問題。小檗胺是小檗科植物中提取的雙芐基異喹啉類生物堿，鹽酸小檗胺片可治療各種原因引起的白細(xì)胞減少，還具有抗心律失常、抗心肌缺血、降低心率、抗血栓等作用［1］。近年研究表明，小檗胺對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，能夠通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)胃癌AGS 細(xì)胞凋亡［2］；抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［3］；在體外將細(xì)胞周期阻滯在S 期，從而抑制膀胱癌的增殖和轉(zhuǎn)移［4］。目前關(guān)于小檗胺在肺癌中的研究較少，其具體作用機(jī)制尚不明確。2019 年10 月—2020 年6 月，我們通過觀察小檗胺對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株A549購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。小檗胺購于上海麥克林生化科技有限公司，純度＞98%，加入DMSO 配制成終濃度為100 μmol/L的儲(chǔ)存液。培養(yǎng)基RPMI-1640購于美國Corning公司；胎牛血清購于美國Gibco公司；青霉素—鏈霉素溶液購于生工生物工程（上海）有限公司；MTT 試劑盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫染色液購于北京索萊寶科技有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 購于美國Cell Signaling 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。多功能酶標(biāo)儀購于美國Thermo 公司；流式細(xì)胞儀購于美國BD 公司；凝膠成像系統(tǒng)購于美國BIO-RAD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取A549 細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 天更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%時(shí)，PBS 洗滌，加入含EDTA 的胰酶消化，然后加入10% RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打使得細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT 法。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按1.0×105/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和小檗胺組，小檗胺組分別加入10、20、40 μmol/L 小檗胺，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基。分別于培養(yǎng)24、48、72 h 后，取細(xì)胞加入MTT 溶液，37 ℃孵育4 h，加入100 μL DMSO 振蕩混勻。上酶標(biāo)儀，在450 nm 波長處測(cè)定每孔的OD 值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=小檗胺處理組OD 值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞克隆形成能力觀察 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按1×103/孔接種于6 孔板中，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和小檗胺組，小檗胺組分別加入含10、20、40 μmol/L 小檗胺，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，加入結(jié)晶紫染色液染色10 min。滅菌水洗滌，室溫晾干。用數(shù)碼相機(jī)拍照，光學(xué)顯微鏡下觀察含有50個(gè)以上細(xì)胞的克隆，計(jì)算克隆形成率。克隆形成率=細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按1.0×105/mL 接種于6孔板中，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和小檗胺組，小檗胺組分別加入含10、20、40 μmol/L 小檗胺，對(duì)照組加入同等體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，收集各組細(xì)胞，PBS 洗滌，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸，再加入5 μL Annexin VFITC，最后加入10 μL PI 染色液，室溫孵育20 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3 以及PI3K/AKT 信號(hào)通路蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按2.0×105/mL 接種于6 孔板，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和小檗胺組，小檗胺組分別加入含10、20、40 μmol/L 小檗胺，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，收集各組細(xì)胞，PBS 洗滌，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解20 min，12 500 r/min 離心15 min，收集上清，BCA法對(duì)各組細(xì)胞總蛋白定量。每組取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 抗體（Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 稀釋比例為1∶1 000，GAPDH 稀釋比例為1∶5 000），4 ℃孵育過夜。第2 天TBST 洗3 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。TBST 洗3 次，將1∶1 混合的ECL 發(fā)光液均勻滴至PVDF 膜上，用BioRad 凝膠成像儀獲取圖像。用Image J 軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH 的灰度比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K表示蛋白磷酸化水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。采用Shapiro-Wilk法對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖情況比較 小檗胺組經(jīng)10、20、40 μmol/L 小檗胺處理24、48、72 h 的細(xì)胞存活率均較對(duì)照組降低，40 μmol/L 小檗胺處理48、72 h的細(xì)胞存活率較24 h降低，20 μmol/L小檗胺處理72 h 的細(xì)胞存活率較24、48 h 降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較（%，± s）

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較（%，± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與24 h 比較，#P＜0.05；與48 h 比較，△P＜0.05。

組別小檗胺組 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L對(duì)照組細(xì)胞存活率24 h 86.91 ± 4.95*71.36 ± 2.66*64.68 ± 2.10*100.00 ± 1.76 48 h 89.29 ± 6.29*67.02 ± 2.29*53.05 ± 4.03*#100.00 ± 2.53 72 h 79.00 ± 3.22*56.54 ± 4.20*#△47.10 ± 1.57*#100.00 ± 3.19

2.2 各組細(xì)胞克隆形成情況比較 小檗胺組經(jīng)10、20、40 μmol/L 小檗胺處理后的細(xì)胞克隆數(shù)和克隆形成率較對(duì)照組降低，其中20 μmol/L 處理后較10 μmol/L 降低，40 μmol/L 處理后較10、20 μmol/L降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞克隆數(shù)及克隆形成率比較（ ± s）

表2 各組細(xì)胞克隆數(shù)及克隆形成率比較（ ± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與10 μmol/L 小檗胺組比較，#P＜0.05；與20 μmol/L小檗胺組比較，△P＜0.05。

組別小檗胺組 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L對(duì)照組細(xì)胞克隆數(shù)（個(gè)）203 ± 12*136 ± 16*#85 ± 9*#△310 ± 15克隆形成率（%）65.65 ± 5.95*43.88 ± 3.09*#27.37 ± 1.87*#△100.00 ± 5.19

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 小檗胺組經(jīng)10、20、40 μmol/L小檗胺處理后的細(xì)胞凋亡率分別為11.01% ± 0.09%、29.32% ± 0.18%、39.52% ± 0.29%，對(duì)照組為5.48% ± 0.23%。10、20、40 μmol/L 小檗胺處理后細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組增加，其中20 μmol/L 處理后較10 μmol/L 升高，40 μmol/L 處理后較10、20 μmol/L升高（P均＜0.05）。

2.4 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，小檗胺組經(jīng)10、20、40 μmol/L小檗胺處理后細(xì)胞Bax、Caspase-3表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低；其中高濃度小檗胺處理后的細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平較低濃度小檗胺升高，Bcl-2表達(dá)水平較低濃度小檗胺降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 （% ± s）

表3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 （% ± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與10 μmol/L 小檗胺組比較，#P＜0.05；與20 μmol/L小檗胺組比較，△P＜0.05。

組別小檗胺組 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L對(duì)照組Bax 117.50 ± 2.02*122.31 ± 3.94*147.64 ± 2.08*#△100.00 ± 2.01 Bcl-2 80.19 ± 5.58*42.84 ± 6.37*#22.80 ± 4.94*#△100.00 ± 3.91 Caspase-3 108.43 ± 2.39*130.50 ± 1.66*#156.80 ± 3.75*#△100.00 ± 2.95

2.5 各組細(xì)胞PI3K、AKT 蛋白磷酸化水平比較 與對(duì)照組相比，小檗胺組經(jīng)10、20、40 μmol/L 小檗胺處理后細(xì)胞PI3K、AKT 磷酸化水平均降低；其中高濃度小檗胺處理后的細(xì)胞PI3K、AKT 磷酸化水平較低濃度小檗胺降低（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組細(xì)胞PI3K、AKT蛋白磷酸化水平比較（ ± s）

表4 各組細(xì)胞PI3K、AKT蛋白磷酸化水平比較（ ± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與10 μmol/L 小檗胺組比較，#P＜0.05；與20 μmol/L小檗胺組比較，△P＜0.05。

組別小檗胺組 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L對(duì)照組p-AKT/AKT 0.602 ± 0.028*0.513 ± 0.024*#0.437 ± 0.053*#△1.000 ± 0.035 p-PI3K/PI3K 0.846 ± 0.052*0.638 ± 0.038*#0.541 ± 0.070*#△1.000 ± 0.043

3 討論

近年來，隨著靶向藥物和免疫治療的發(fā)展，肺癌的治療取得了一定進(jìn)展，但肺癌仍然是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤［5］。很多肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期或者有轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。傳統(tǒng)化療藥物不良反應(yīng)大，容易耐藥，而靶向藥物和免疫治療藥物也存在耐藥和復(fù)發(fā)的問題。中醫(yī)藥因高效、毒性小的特點(diǎn)而被廣泛研究，一些中藥制劑已經(jīng)應(yīng)用到臨床實(shí)踐［6］。小檗胺是從藥用植物小檗科中提取的天然小分子化合物，可用于治療白細(xì)胞減少癥，對(duì)心血管疾病也有一定作用［7］。近年研究表明，小檗胺對(duì)多種腫瘤具有抑制作用。MENG 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，小檗胺可以通過Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ有效抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。WANG 等［9］報(bào)道，小檗胺可通過調(diào)控AKT 和NF-κB 信號(hào)通路，抑制高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力。金穎等［10］報(bào)道，小檗胺可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究觀察了不同濃度小檗胺對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖和凋亡的作用，結(jié)果表明，小檗胺能夠顯著抑制細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞克隆數(shù)和克隆形成率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這表明小檗胺對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞有增殖抑制和促凋亡的作用。

細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡，在抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要有2 種途徑，一種是由細(xì)胞間信號(hào)激活的內(nèi)在途徑，即線粒體途徑；一種是由細(xì)胞外信號(hào)激活的外在途徑，即死亡受體途徑［11］。Bcl-2 以及Bcl-2 家族成員Bax 是細(xì)胞凋亡中作用于線粒體的關(guān)鍵調(diào)控分子，Bcl-2 可以保護(hù)細(xì)胞膜通透性，抑制細(xì)胞凋亡，而Bax 作用與Bcl-2 作用相反，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放，激活Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［12］。Caspase 家族蛋白被活化進(jìn)而發(fā)生凋亡蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡的重要過程，Caspase-3 是其家族重要成員之一，是Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的關(guān)鍵凋亡執(zhí)行者，Caspase-3 的激活依賴于細(xì)胞色素C 的釋放，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。本研究結(jié)果顯示，小檗胺處理組Bax 和Caspase-3 的蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，Bcl-2的蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，以上結(jié)果提示小檗胺可能是通過調(diào)控Bcl-2、Bax 以及Caspase-3 的表達(dá)從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。

PI3K/AKT 信號(hào)通路是參與細(xì)胞代謝、增殖以及凋亡中的重要信號(hào)通路之一，在多種疾病如腫瘤、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用［14-17］。PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，當(dāng)受到酪氨酸激酶或G 蛋白偶聯(lián)受體的激活后，將底物PIP2 轉(zhuǎn)化為PIP3。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K 信號(hào)通路中的一個(gè)重要下游靶點(diǎn)，PIP3 作為第二信使，與AKT 的N 端PH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使AKT 從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，最終導(dǎo)致AKT 磷酸化而活化，進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等過程［18］。谷田露等［19］報(bào)道，金雀異黃酮通過調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。孟東雪等［20］報(bào)道，扶正抑瘤湯可以通過PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌增殖、凋亡及自噬。本研究結(jié)果顯示，小檗胺組PI3K、AKT 蛋白磷酸化水平低于對(duì)照組，表明小檗胺可能是通過PI3K/AKT 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，小檗胺可以抑制人肺癌A549細(xì)胞的增殖、降低細(xì)胞克隆數(shù)和克隆形成率、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。本研究為發(fā)現(xiàn)新的肺癌治療藥物提供了理論依據(jù)。