急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障損傷、MLCK/p-MLC2信號(hào)通路活性變化及其與抗菌肽的關(guān)系

馬鳳雨，曾家月，文琳，陳霞，2

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川瀘州 646000；2 成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

急性胰腺炎（AP）是消化科常見(jiàn)急腹癥。重癥急性胰腺炎（SAP）患者表現(xiàn)為胰腺壞死出血，伴有臟器功能障礙及代謝功能紊亂等，可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，嚴(yán)重威脅患者生命健康。小腸是SAP 最易累及的器官之一，腸黏膜屏障損傷不僅參與了SAP 的全身炎癥反應(yīng)及多器官損傷，其導(dǎo)致的腸道細(xì)菌移位也是胰腺炎后期并發(fā)感染最主要機(jī)制。腸黏膜屏障包括機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障。機(jī)械屏障是由緊密連接蛋白與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架將相鄰細(xì)胞連接起來(lái)構(gòu)成。緊密連接蛋白主要由咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudin）及閉合小環(huán)蛋白（ZO）組成［1］。肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）是肌球蛋白輕鏈（MLC2）的特異性底物酶，在細(xì)胞骨架重構(gòu)中起重要作用［2］。研究顯示，腸黏膜屏障損傷與緊密連接蛋白分子的降解、緊密連接蛋白分子結(jié)構(gòu)的解聚和重排有關(guān)，其中磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC2）在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3-4］。免疫屏障中最具有代表性的是抗菌肽。回腸的潘氏細(xì)胞是腸道中抗菌肽的主要來(lái)源，在腸道病原菌的刺激下，潘氏細(xì)胞脫顆粒釋放一系列抗菌因子，包括防御素、溶菌酶和再生胰島衍生蛋白3 家族（Reg3）蛋白等，保護(hù)隱窩細(xì)胞免受微生物感染，阻止外源微生物入侵，發(fā)揮殺菌作用，同時(shí)參與調(diào)節(jié)腸道菌群組成和腸道免疫反應(yīng)［5-6］。2021 年6 月—2022 年1 月，我們通過(guò)建立AP大鼠模型，觀察大鼠腸黏膜屏障損傷情況，以及腸黏膜組織MLCK/p-MLC2 信號(hào)通路活性變化，并分析該信號(hào)通路激活與小腸抗菌肽的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠24 只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及專(zhuān)用飼料均由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房。飼養(yǎng)條件：室溫（22 ± 2）℃，每天定時(shí)換氣，保持12 h/12 h 光暗照明，飲食不限。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2 主要藥品與試劑 ?；悄懰徕c（美國(guó)Sigma公司），脂肪酶、淀粉酶ELISA試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司），總RNA 純化提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time qPCR 試劑盒（中國(guó)ELK Biotechnology公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（中國(guó)ASPEN公司）。

1.2 動(dòng)物分組與造模 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組6 只、AP 組18 只。AP 組采取胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉溶液進(jìn)行造模。造模前12 h 禁食不禁水，給予3%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定。沿腹中線打開(kāi)腹腔，找到胰膽管，在十二指腸乳頭旁用26 G 留置針穿破腸壁，進(jìn)入胰管，微血管鉗夾閉肝門(mén)處胰管，以0.1 mL/min 的速度泵入5%牛磺膽酸鈉0.1 mL/100 g，2 min 后取下微血管鉗。以胰膽管周?chē)[脹，局部胰腺顏色慢慢變黑、水腫伴充血判斷為造模成功?？p合傷口，關(guān)腹，術(shù)后繼續(xù)禁食不禁水。對(duì)照組僅開(kāi)腹，適當(dāng)翻動(dòng)胰腺后關(guān)腹。

1.3 血清脂肪酶、淀粉酶含量檢測(cè) 對(duì)照組于造模后6 h，AP組于造模后6、12、24 h各取6只大鼠，經(jīng)心臟穿刺采血2 mL，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min 離心15 min，離心半徑為12.5 cm，分離血清。采用ELISA法檢測(cè)脂肪酶、淀粉酶含量。

1.4 回腸黏膜組織病理學(xué)檢查 采用HE 染色法。大鼠采血后立即處死，取回腸黏膜組織標(biāo)本，加入4%多聚甲醛固定，濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成4 μm厚切片。濃度梯度乙醇脫蠟至水，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，1%氨水顯藍(lán)。加乙醇伊紅復(fù)染60 s，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。采用Chiu 評(píng)分評(píng)價(jià)回腸黏膜組織病理學(xué)改變，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，正常黏膜絨毛；1分，絨毛頂端上皮下出現(xiàn)間隙，炎癥細(xì)胞局部增多；2 分，上皮下間隙擴(kuò)大，固有層局部水腫出血；3 分，固有層明顯水腫，彌漫出血，炎癥細(xì)胞皮下聚集；4分，剝脫的絨毛有固有層和擴(kuò)張的毛細(xì)血管暴露；5分，固有層消化崩解、出血、潰瘍。

1.5 回腸黏膜組織Reg3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR法。取回腸末端腸段，-80 ℃保存。稱取0.1 g 回腸黏膜組織，冰上研磨，加入TRIzol 裂解液提取總RNA，以其為模板逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以cDNA 作為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增引物由武漢恒意賽生物公司設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.6 回腸黏膜組織MLCK、p-MLC2、ZO-1、Claudin-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。取0.1 g冷凍的末端回腸組織，研磨后離心取沉淀，加入裂解液提取組織蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，上樣后80 V 電泳2 h，60 V 轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h。除去封閉液，加入稀釋后的一抗（MLCK、ZO-1、Claudin-1 一抗稀 釋比例1∶1 000；p-MLC2 一抗稀釋比例1∶500）4 ℃過(guò)夜；TBST 洗滌3次，加入稀釋后的二抗（稀釋比例1∶1 000）室溫孵育30 min。TBST 清洗，滴加電化學(xué)發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)顯影。采用AlphaEaseFC 軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料經(jīng)過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步比較采用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清淀粉酶、脂肪酶水平比較 AP 組造模后6、12、24 h血清淀粉酶、脂肪酶水平均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。AP 組造模后12、24 h 血清淀粉酶、脂肪酶水平高于造模后6 h，且造模后24 h高于12 h（P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組血清脂肪酶、淀粉酶水平比較（ ± s）

表2 各組血清脂肪酶、淀粉酶水平比較（ ± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與造模后6 h 比較，#P＜0.05；與造模后12 h比較，△P＜0.05。

組別AP組 造模后6 h 造模后12 h 造模后24 h對(duì)照組n 6 6 6 6脂肪酶（U/L）115.98 ± 13.55*136.56 ± 17.79*#158.61 ± 18.85*#△61.91 ± 9.81淀粉酶（U/dL）1 678.45 ± 115.60*1 929.29 ± 189.08*#2 395.63 ± 276.07*#△1 414.14 ± 213.51

2.2 各組回腸黏膜組織病理結(jié)果比較 對(duì)照組回腸黏膜完整，絨毛結(jié)構(gòu)規(guī)整正常；AP 組回腸黏膜組織出現(xiàn)不同程度的損傷，包括絨毛充血、水腫、變寬變短及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分絨毛頂端破裂。AP組造模后6、12、24 h 回腸黏膜組織病理學(xué)評(píng)分分別為（1.50 ± 0.55）、（3.50 ± 0.55）、（4.83 ± 0.41）分，對(duì)照組為（0.33 ± 0.52）分，AP 組高于對(duì)照組，且造模后24 h 高于造模后6 h 及12 h，12 h 高于造模后6 h（P均＜0.05）。

2.3 各組回腸黏膜組織REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，AP組造模后6、12、24 h回腸黏膜組織REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA表達(dá)水平均降低，且造模后24 h 低于造模后6 h 及12 h， 12 h低于造模后6 h（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組回腸黏膜組織抗菌肽基因表達(dá)水平比較（± s）

表3 各組回腸黏膜組織抗菌肽基因表達(dá)水平比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與造模后6 h 比較，#P＜0.05；與造模后12 h比較，△P＜0.05。

組別AP組 造模后6 h 造模后12 h 造模后24 h對(duì)照組n 6 6 6 6 REG3γ mRNA 0.67 ± 0.05*0.46 ± 0.03*#0.20 ± 0.04*#△0.97 ± 0.02 α-防御素5 mRNA 0.70 ± 0.04*0.55 ± 0.03*#0.32 ± 0.03*#△1.04 ± 0.03溶菌酶mRNA 0.78 ± 0.05*0.54 ± 0.04*#0.26 ± 0.02*#△0.96 ± 0.03

2.4 各組回腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、MLCK、p-MLC2 蛋白水平比較 AP 組造模后6、12、24 h回腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1 水平均低于對(duì)照組，AP 組造模后12、24 h 低于造模后6 h，且造模后12 h 低于造模后24 h（P均＜0.05）。AP 組造模后6、12、24 h 回腸黏膜組織MLCK、p-MLC2 蛋白水平均高于對(duì)照組，AP 組造模后12、24 h 回腸黏膜組織MLCK、p-MLC2 蛋白水平均高于造模后6 h，且 造 模 后24 h 亦 高 于 造 模 后12 h（P均＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組回腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、MLCK、p-MLC2蛋白表達(dá)水平比較（± s）

表4 各組回腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、MLCK、p-MLC2蛋白表達(dá)水平比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與造模后6 h比較，#P＜0.05；與造模后12 h比較，△P＜0.05。

組別AP組 造模后6 h 造模后12 h 造模后24 h對(duì)照組n 6 6 6 6 ZO-1 0.78 ± 0.09*0.31 ± 0.05*#0.22 ± 0.05*#△1.01 ± 0.08 Claudin-1 0.41 ± 0.05*0.16 ± 0.03*#0.08 ± 0.02*#△0.73 ± 0.02 MLCK 0.65 ± 0.06*0.84 ± 0.05*#1.08 ± 0.07*#△0.50 ± 0.05 p-MLC2 0.42 ± 0.05*0.86 ± 0.06*#1.07 ± 0.06*#△0.13 ± 0.02

2.5 AP 大鼠回腸黏膜組織MLCK、p-MLC2 蛋白表達(dá)與抗菌肽的相關(guān)性 AP 大鼠回腸黏膜組織MLCK 蛋白表達(dá)水平與REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.96、-0.95、-0.93，P均＜0.05），p-MLC2 蛋白表達(dá)水平與REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA 水平亦呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.96、-0.94、-0.96，P均＜0.05）。

3 討論

小腸是AP最易累及的遠(yuǎn)端器官之一，同時(shí)腸黏膜屏障損傷參與了AP 的發(fā)生發(fā)展［7］。有研究認(rèn)為，腸黏膜屏障損傷是誘發(fā)和加重AP的癥結(jié)所在，在促發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征中發(fā)揮重要作用，這也是SAP 病死率高的主要原因［8］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AP 組造模后各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶和脂肪酶含量均顯著升高，表明AP大鼠模型造模成功。組織病理學(xué)檢查顯示，與對(duì)照組相比，AP組回腸黏膜組織表現(xiàn)為黏膜不同程度斷裂缺失、間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸道組織病理?yè)p傷評(píng)分顯著升高，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，升高更為明顯，表明AP大鼠腸道的病理?yè)p傷呈現(xiàn)時(shí)間依賴性加重趨勢(shì)，有腸上皮細(xì)胞的明顯破壞。

腸黏膜機(jī)械屏障由完整的上皮細(xì)胞和細(xì)胞旁緊密連接組成，該屏障可防止細(xì)菌、脂多糖和腸桿菌群等其他有害物質(zhì)從腸腔進(jìn)入血液。Claudin-1、Occludin 和ZO-1 蛋白作為主要的緊密連接蛋白，能夠加強(qiáng)腸道屏障，降低細(xì)胞旁通透性［9］。Claudin-1、Occludin 與鄰近細(xì)胞中的其他連接蛋白相互作用形成頂端連接復(fù)合體，ZO-1 主要位于鄰近上皮細(xì)胞的邊界，將Occludin 和Claudin-1 錨定在細(xì)胞骨架上，共同控制腸黏膜屏障通透性［10］。Claudin-1、ZO-1 水平降低提示腸黏膜屏障損傷，腸黏膜通透性增加［11］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AP 大鼠回腸黏膜組織中Claudin-1、ZO-1 蛋白表達(dá)減少，提示AP大鼠存在明顯的腸黏膜屏障損傷。

腸黏膜屏障損傷不僅涉及腸機(jī)械屏障損傷，腸道通透性的改變導(dǎo)致細(xì)菌易位，還涉及腸壁內(nèi)免疫活性細(xì)胞和鄰近淋巴結(jié)—腸道相關(guān)淋巴組織的激活?？咕氖悄c道免疫屏障的重要組成部分?；啬c的潘氏細(xì)胞是小腸上皮中高度分化的分泌細(xì)胞，可分泌調(diào)節(jié)腸道菌群的抗菌肽，維持腸道穩(wěn)態(tài)和腸黏膜屏障功能。潘氏細(xì)胞分泌抗菌肽的功能受損可能是AP 發(fā)生腸黏膜屏障損傷的原因之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，ZIP4 基因敲除鼠存在潘氏細(xì)胞功能障礙，干細(xì)胞分化微環(huán)境受到破壞，導(dǎo)致上皮細(xì)胞完整性缺失，腸黏膜屏障受損［12］。研究發(fā)現(xiàn)，潘氏細(xì)胞功能障礙與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如克羅恩病、酒精性脂肪肝、移植物抗宿主病和腸易激綜合征等。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AP 組回腸黏膜組織中的抗菌肽REG3γ、α-防御素5、溶菌酶表達(dá)隨病程延長(zhǎng)逐漸下降，造模后24 h 低于造模后6、12 h。這提示抗菌肽表達(dá)異常可能參與了AP 過(guò)程中腸黏膜屏障損傷的病理過(guò)程。

MLCK 是一種鈣調(diào)素依賴酶，能夠催化肌球蛋白20 kD 輕鏈的磷酸化，使肌動(dòng)球蛋白得以激活肌球蛋白ATP 酶，從而引起平滑肌的收縮活動(dòng)。研究認(rèn)為，MLCK 是腸黏膜屏障功能障礙的關(guān)鍵效應(yīng)因子和潛在的治療靶點(diǎn)［13］，MLCK 剪接變體可糾正炎癥性腸病動(dòng)物的腸黏膜屏障功能障礙。短肌或平滑肌MLCK 在腸上皮中不表達(dá)，而長(zhǎng)肌MLCK 在腸上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，并通過(guò)誘導(dǎo)MLC2 磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)腸道通透性［14］。腸上皮通透性主要由兩種不同的機(jī)制調(diào)節(jié)，即細(xì)胞旁途徑和經(jīng)上皮途徑，由緊密連接控制的細(xì)胞旁途徑允許水、溶質(zhì)和離子的通過(guò)。調(diào)節(jié)細(xì)胞旁途徑涉及四種不同的機(jī)制：緊密連接基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［15］、MLCK 介導(dǎo)的肌肉收縮［16］、緊密連接蛋白的內(nèi)吞［17］和上皮細(xì)胞凋亡［18］。此外，既往研究報(bào)道，腸黏膜屏障破壞引起的細(xì)菌滲透促進(jìn)了病原體相關(guān)分子模式與模式識(shí)別受體如TLR4、TLR5 和NLRP3的結(jié)合；激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)；分泌細(xì)胞因子如IL-13和IFN-γ。WU等［19］研究顯示，過(guò)量分泌IFN-γ可增加細(xì)胞旁通透性，其中MLCK通路激活參與了這一過(guò)程。但MLCK/p-MLC2信號(hào)通路在AP腸黏膜屏障功能障礙中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AP 組回腸黏膜組織中MLCK、p-MLC2蛋白表達(dá)水平顯著增高，造模后24 h較6 h 和12 h 增高更為明顯，表明AP 時(shí)腸道黏膜組織中MLCK激活，MLC2磷酸化，MLCK/p-MLC2信號(hào)通路可能參與了AP時(shí)的腸黏膜屏障功能障礙。

有學(xué)者在腸上皮細(xì)胞持續(xù)表達(dá)MLCK 的轉(zhuǎn)基因小鼠中評(píng)估了腸黏膜屏障功能和緊密連接功能，緊密連接蛋白的選擇性變化伴隨著Na+滲透的增加，這可能直接影響MLCK 依賴的MLC2 磷酸化，提示MLCK/p-MLC2 信號(hào)通路與腸黏膜屏障功能密切相關(guān)［20］。在免疫介導(dǎo)的炎癥性腸病模型中，腫瘤壞死因子受體2 信號(hào)通路刺激增加上皮長(zhǎng)MLCK 的表達(dá)，導(dǎo)致緊密連接失調(diào)、屏障喪失，從而增加免疫介導(dǎo)的結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度［24］。本研究通過(guò)Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的降低與MLCK/p-MLC2 信號(hào)通路呈負(fù)相關(guān)，因此推測(cè)，MLCK/p-MLC2 的表達(dá)與AP腸黏膜免疫屏障的減弱存在相關(guān)性，并由此參與了AP腸黏膜屏障損傷。

綜上所述，AP 大鼠存在腸黏膜屏障損傷，回腸黏膜組織中MLCK/p-MLC2 信號(hào)通路激活，可能導(dǎo)致緊密連接的破壞，其與免疫屏障如抗菌肽的分泌減少共同作用，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷。對(duì)MLCK/p-MLC2信號(hào)通路的進(jìn)一步研究可為臨床治療AP腸黏膜功能障礙提供新思路。