MAGEA4和MAGEC1基因在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)變化及潛在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的生物信息學(xué)分析

梁子謙，黃李浩赟，孫浩嘉，吳曉娜，蘇顏雄，賀菽嘉

1 廣西醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，南寧 530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；3 廣西高校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

肝細(xì)胞癌（HCC）是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因。目前HCC 的治療手段包括手術(shù)、射頻消融、經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞以及酪氨酸激酶抑制劑、免疫檢查點(diǎn)阻斷治療等，然而患者的預(yù)后仍不理想。深入探討HCC 發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)HCC 潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。黑素瘤相關(guān)抗原（MAGE）是一類重要的癌—睪丸抗原，該家族中的部分成員在多種類型惡性腫瘤中呈高表達(dá)，而在正常組織中限制性低表達(dá)，是腫瘤免疫治療的潛在靶標(biāo)［1］。MAGEA4和MAGEC1屬于Ⅰ類MAGE家族成員，與腫瘤的關(guān)系十分密切，其中MAGEA4 在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)［2-4］，MAGEC1 在乳腺癌、結(jié)直腸癌、HCC 組織中存在異常表達(dá)［5-7］。然而既往研究中樣本例數(shù)較少、來源不同等因素的影響，MAGEA4 和MAGEC1 表達(dá)在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚不明確。2021 年3 月—2022 年3 月，本研究通過檢索、收集、統(tǒng)計(jì)處理HCC 相關(guān)數(shù)據(jù)集，通過大樣本量的數(shù)據(jù)分析綜合探究MAGEA4 和MAGEC1 在HCC 和癌旁正常肝組織中的表達(dá)水平、預(yù)后意義及潛在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以期為HCC 的診斷治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)信息來源 從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)（包含HCC組織407 例，癌旁正常肝組織58 例），數(shù)據(jù)形式為FPKM；利用R 軟件（4.1.0）將FPKM 矩陣轉(zhuǎn)化為TPM 矩陣，利用R 軟件包limma 將表達(dá)矩陣標(biāo)準(zhǔn)化。同 時(shí) 從GEO 數(shù) 據(jù) 庫 下 載GSE10143、GSE20140、GSE87630、GSE107170 4 個(gè)RNA 芯片數(shù)據(jù)集，分別包含HCC 組織80、35、64、173 例，癌旁正常肝組織307、34、30、116 例。共納入HCC 組織759 例，癌旁正常肝組織545例。

1.2 MAGEA4、MAGEC1 在HCC 組織中的表達(dá)分析 利用GraphPad Prism 8 軟件繪制散點(diǎn)圖分析MAGEA4、MAGEC1 在HCC 與癌旁正常肝組織中的表達(dá)差異，并分析在HCC 組織中MAGEA4 與MAGEC1表達(dá)的相關(guān)性。

1.3 MAGEA4、MAGEC1 區(qū)分HCC 和癌旁正常肝組織的能力評(píng)估 繪制受試者工作特征（ROC）曲線，以中位數(shù)區(qū)分MAGEA4 和MAGEC1 的高表達(dá)和低表達(dá)，依據(jù)曲線下面積（AUC）評(píng)估MAGEA4 和MAGEC1 表達(dá)區(qū)分HCC 和癌旁正常肝組織的能力。AUC 0.5～＜0.7 提示低區(qū)分能力，0.7～＜0.9 提示中等區(qū)分能力，≥0.9提示高區(qū)分能力。

1.4 MAGEA4、MAGEC1對(duì)HCC預(yù)后影響的分析 利用TCGA-LIHC 隊(duì)列的隨訪數(shù)據(jù)，使用Kaplan-Meier 生存曲線分析MAGEA4 和MAGEC1 與HCC 預(yù)后的影響。使用Cox 回歸分析計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR），HR＞1提示為預(yù)后危險(xiǎn)因素，＜1提示為預(yù)后保護(hù)因素。

1.5 調(diào)控MAGEA4、MAGEC1 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和miRNA 的預(yù)測(cè) 使用Cistrome DB 數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)上游調(diào)控MAGEA4、MAGEC1 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，選擇score≥0.3 的轉(zhuǎn)錄因子并取交集。使用TargetScan Human v8.0 預(yù)測(cè)與MAGEA4、MAGEC1 具有靶向關(guān)系的miRNA，選擇score≤-0.2 的miRNA 并取交集。采用R 語言ggseqlogo 包繪制轉(zhuǎn)錄因子的序列圖，Cytoscape3.6.1 軟件繪制轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)圖。使用JASPAR 數(shù)據(jù)庫尋找轉(zhuǎn)錄因子與MAGEA4、MAGEC1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的結(jié)合位點(diǎn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5.0 軟件。計(jì)量資料以± s 表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。采用Log-Rank 檢驗(yàn)比較兩組生存率的差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC與癌旁正常肝組織中MAGEA4、MAGEC1表達(dá)比較 在納入的5個(gè)HCC 數(shù)據(jù)集中，MAGEA4、MAGEC1 在HCC 組織中的表達(dá)水平均高于癌旁正常肝組織（P均＜0.05）。見表1、2。在TCGA-LIHC、GSE10143、GSE107170 數(shù) 據(jù) 集 中，MAGEA4 與MAGEC1在HCC組織中的表達(dá)均呈正相關(guān)（r分別為0.322、0.299、0.482，P均＜0.01），在GSE20140、GSE87630數(shù)據(jù)集中，MAGEA4與MAGEC1在HCC組織中的表達(dá)無明顯相關(guān)性（r分別為-0.139、0.186，P均＞0.05）。

表1 MAGEA4在HCC和癌旁正常肝組織中的表達(dá) 比較（± s）

表1 MAGEA4在HCC和癌旁正常肝組織中的表達(dá) 比較（± s）

注：與數(shù)據(jù)集內(nèi)HCC組織比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

數(shù)據(jù)集TCGA-LIHC HCC組織 癌旁正常肝組織GSE10143 HCC組織 癌旁正常肝組織GSE20140 HCC組織 癌旁正常肝組織GSE87630 HCC組織 癌旁正常肝組織GSE107170 HCC組織 癌旁正常肝組織n 407 58 80 307 35 34 64 30 173 116 MAGEA4-1.733 ± 3.286-2.733 ± 1.761**9.914 ± 0.474 8.926 ± 0.716**7.188 ± 1.353 6.707 ± 0.070*2.660 ± 0.091 2.623 ± 0.059*3.185 ± 0.897 3.029 ± 0.134**MAGEC1 1.071 ± 5.078-2.485 ± 1.785**10.770 ± 1.114 8.825 ± 0.792**6.939 ± 0.479 6.699 ± 0.045**2.709 ± 0.130 2.619 ± 0.053**4.246 ± 1.443 3.597 ± 0.367**

2.2 MAGEA4、MAGEC1對(duì)HCC和癌旁正常肝組織的區(qū)分能力 ROC 曲線提示，MAGEA4 區(qū)分HCC 和癌旁正常肝組織具有輕到中度準(zhǔn)確性（AUC=0.545～0.858），MAGEC1 區(qū)分HCC 和癌旁正常肝組織具有輕到高度準(zhǔn)確性（AUC=0.613～0.931），見OSID 碼圖1。

2.3 MAGEA4、MAGEC1 表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響 MAGEA4 高表達(dá)和低表達(dá)HCC 患者的5 年生存率分別為33.9%、54.4%，MAGEA4是HCC預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P=0.000 43，HR=1.97）。MAGEC1 高表達(dá)和低表達(dá)HCC 患者的5 年生存率分別為46.9%、51.6%，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.300 00），見OSID碼圖2。

2.4 MAGEA4 和MAGEC1 潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 通過預(yù)測(cè)，與MAGEA4 和MAGEC1 均具有靶向關(guān)系的miRNA 為hsa-miR-1827。TargetScan Human v8.0分析發(fā)現(xiàn)，該miRNA 與MAGEA4 的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）存在7mer-A1 的結(jié)合模式，與MAGEC1 的3'-UTR存在8mer的結(jié)合模式。見OSID碼圖3。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)與MAGEA4和MAGEC1具有潛在調(diào)控關(guān)系的轉(zhuǎn)錄因子，即MYC 和TFAP2A，預(yù)測(cè)它們與MAGEA4、MAGEC1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的結(jié)合序列見表2。

表2 轉(zhuǎn)錄因子與MAGEA4、MAGEC1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 的結(jié)合序列（結(jié)合分?jǐn)?shù)＞0.8）

3 討論

MAGE 家族是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)癌—睪丸抗原。研究顯示，多種MAGE 基因在HCC 組織中呈異常表達(dá)，并且與腫瘤臨床分期及患者總生存率相關(guān)；表達(dá)失調(diào)的MAGE家族成員可能通過參與G蛋白偶聯(lián)受體通路在信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，從而影響HCC的發(fā)生發(fā)展［8］。MAGEA4和MAGEC1參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，過表達(dá)的MAGEA4 在非小細(xì)胞肺癌中通過抑制Caspase-3 的活性從而抑制細(xì)胞凋亡，因而有利于腫瘤細(xì)胞的生長［9］；而過表達(dá)的MAGEC1 可抑制Caspase-9 和Caspase-12 的活性，發(fā)揮抑制骨髓瘤細(xì)胞凋亡的作用［10］。因此推測(cè)，MAGEA4 可能是T 細(xì)胞免疫治療一個(gè)有潛力的靶點(diǎn)［11-12］，MAGEC1 可能通過抑制細(xì)胞凋亡從而參與惡性腫瘤的發(fā)展。目前關(guān)于MAGEA4 和MAGEC1在腫瘤中表達(dá)的文獻(xiàn)較少，轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍不清楚，因此我們借助公共高通量數(shù)據(jù)庫TCGA和GEO中的HCC 數(shù)據(jù)集，減少實(shí)驗(yàn)條件的局限性，并排除人種、臨床分期、病理類型等腫瘤異質(zhì)性帶來的偏倚，通過多中心大樣本分析，結(jié)果顯示MAGEA4 和MAGEC1在HCC 組織中呈高表達(dá)。進(jìn)一步通過Pearson 相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)MAGEA4與MAGEC1在HCC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者可能共同參與了HCC 的發(fā)生發(fā)展。

MAGE 家族在腫瘤中的預(yù)后價(jià)值一直是學(xué)者的關(guān)注點(diǎn)。一項(xiàng)研究通過多因素Cox 回歸分析表明，MAGEA4 是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［9］。另一項(xiàng)研究顯示，MAGEC1 蛋白的表達(dá)與HCC 患者總生存期降低有關(guān)［6］。本研究通過生存分析發(fā)現(xiàn)，MAGEA4 是HCC 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，與HCC 患者總生存率降低相關(guān)；而MAGEC1與HCC 患者的預(yù)后無明顯相關(guān)，提示MAGEC1 可能具有與家族其他成員不同的生物學(xué)功能；抑或是MAGEC1 的基因表達(dá)與蛋白合成并不同步，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后可能受到不同的調(diào)控因子影響。

轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別和直接結(jié)合特定DNA 序列后，可通過直接激活轉(zhuǎn)錄、募集RNA 聚合酶Ⅱ或結(jié)合增強(qiáng)子起到激活轉(zhuǎn)錄的作用；也可通過結(jié)合沉默子、募集阻遏物使轉(zhuǎn)錄抑制［13］。miRNA通過與mRNA的3'-UTR互補(bǔ)結(jié)合，使mRNA降解或抑制翻譯，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用［14］。本研究推測(cè)hsamiR-1827 以 及轉(zhuǎn) 錄因 子MYC、TFAP2A 可能 調(diào) 控MAGEA4、MAGEC1 的表達(dá)，從而參與HCC 發(fā)生與進(jìn)展的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA hsa_circ_0003141 作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 參與hsa-miR-1827/UBAP2 軸的調(diào)控［15］。轉(zhuǎn)錄因子MYC 通過靶向上調(diào)纖連蛋白FN1 的表達(dá)而促進(jìn)HCC 的侵襲、發(fā)展［16］；轉(zhuǎn)錄因子TFAP2A 在HCC 中的作用仍不清楚，但已有文獻(xiàn)報(bào)道其可以通過miR-204-5p/TFAP2A 反饋環(huán)路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［17］。

綜上所述，本研究首次采用大樣本量綜合研究的方法揭示了MAGEA4 和MAGEC1 在HCC 組織中的高表達(dá)，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，高表達(dá)的MAGEA4 與HCC 患者的不良預(yù)后有關(guān)。此外，本研究還對(duì)MAGEA4、MAGEC1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-1827 以及轉(zhuǎn)錄因子MYC、TFAP2A 對(duì)MAGEA4、MAGEC1 具有潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。MAGEA4 和MAGEC1 可作為HCC 潛在的免疫治療靶點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。