白花丹素對涎腺腺樣囊性癌細胞增殖、遷移、凋亡的干預作用及其機制

孫銀雪，岳海云，葛可欣，張東升

1 山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，濟南 250013；2 解放軍第九六〇醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗室；3 山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院口腔頜面外科

腺樣囊性癌（ACC）約占唾液腺腫瘤的10%，通常生長緩慢，但術后局部復發(fā)和遠處轉移的發(fā)生率較高［1］。ACC 根據(jù)組織學形態(tài)可分為實性、腺樣或管狀型，實體型通常分化較差，更具有侵襲性［2］。ACC 的治療首選手術切除，但臨床上局部復發(fā)和遠處轉移仍較常見，通常輔以術后放化療。但ACC 對傳統(tǒng)化療敏感性不高，且毒性反應較重，因此，尋找新的治療藥物對改善ACC 的療效具有重要意義。白花丹素（PLB）是從白花丹根葉中提取的天然萘醌衍生物［3］，具有抗炎、抗微生物、調節(jié)血脂及抗腫瘤的生物學效應［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，PLB 在多種腫瘤細胞中發(fā)揮抗腫瘤作用，包括乳腺癌、非小細胞肺癌、肝癌、胰腺癌、結直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、腦膠質瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤等［5-7］。PLB 主要通過抗增殖、抗血管生成、抗侵襲和轉移、細胞周期停滯以及誘導腫瘤細胞自噬和凋亡等發(fā)揮抗腫瘤效應［3，6-7］。但是PLB 對ACC 的作用及機制目前尚未闡明。2021 年5 月—2022 年10 月，我們觀察了不同濃度PLB 對ACC 細胞增殖、遷移和凋亡的干預作用，并探討其作用機制與線粒體氧化應激的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 人涎腺腺樣囊性癌細胞SACC-83（吉妮歐生物，廣州）。白花丹素（Sigma-Aldrich，上海）；胎牛血清（四季青，浙江）；DMEM（Gibco，美國）；青—鏈霉素、結晶紫染色液、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒、DCF-DA 染色試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、TMRE 試劑盒、RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、HRP 標記的二抗、超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（碧云天，上海）；TUNEL 染色試劑盒（羅氏，美國）；GAPDH、bcl-2、bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 抗體（萬類生物，沈陽）。二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國）；酶標儀（Thermo Fisher，美國）；高速離心機（Thermo Fisher，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng) 取SACC-83 細胞，加入含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于5% CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達到80%，按照1∶2傳代。

1.3 細胞分組與給藥處理 取對數(shù)生長期細胞，分為0、12.5、25、50 μmol/L PLB 組，分別加入含0、12.5、25、50 μmol/L PLB的DMSO培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。

1.4 細胞毒性檢測 采用LDH 釋放法。取各組細胞培養(yǎng)上清10 μL，加入LDH 反應液孵育30 min，在酶標儀上測量450 nm處光密度（OD）值。加入RIPA裂解細胞，離心取上清，測量450 nm 處總吸光度B。LDH 釋放量=A/B×100%。以細胞培養(yǎng)上清中LDH含量表示PLB對SACC-83的細胞毒性作用。

1.5 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法，取各組細胞，加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h。在酶標儀上測量450 nm處的OD值。

1.6 細胞遷移能力觀察 采用Transwell 實驗。取各組細胞，加入胰酶消化，調整細胞密度至5×104/mL，每個小室內加入細胞懸液100 μL。在24 孔板下室加入600 μL 含20% FBS 的培養(yǎng)基，共同培養(yǎng)24 h。遷移細胞使用4%多聚甲醛固定，1%結晶紫染色15 min，顯微鏡下拍照并計數(shù)。

1.7 細胞凋亡檢測 采用TUNEL 染色法。取各組細胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃下與TUNEL 反應混合物孵育1 h，DAPI 復染15 min。熒光顯微鏡下隨機選取5 個視野，計數(shù)總細胞數(shù)和陽性細胞數(shù)，細胞凋亡率=TUNEL 陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.8 細胞氧化水平檢測 采用熒光探針DCF-DA檢測活性氧（ROS）水平。將細胞以1×104/孔接種在96 孔板中，37 ℃避光條件下與10 mmol/L DCF-DA孵育30 min，使用熒光酶標儀測量熒光強度（激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm）。采用微量法檢測MDA 含量。取各組細胞，裂解并進行蛋白定量后，加入MDA 工作溶液，100 ℃加熱15 min；4 ℃下1 000 r/mim 離心10 min，收集上清。在酶標儀上測量532 nm處吸光度值。

1.9 線粒體膜電位檢測 采用熒光探針法。將細胞以1×104/孔接種在96 孔板中，37 ℃避光條件下與1 μmol/L TMRE試劑孵育30 min，使用熒光酶標儀測量熒光強度（激發(fā)波長為540 nm，發(fā)射波長為595 nm）。1.10 凋亡相關蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，裂解并蛋白定量后，進行SDSPAGE 凝膠電泳并轉移到PVDF 膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別與GAPDH（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）、Caspase-3/Cleaved Caspase-3（1∶500）一抗，4 ℃孵育過夜。加入HRP 標記的二抗（1∶5 000）孵育1 h，使用ECL化學發(fā)光檢測目標條帶強度，Image J 軟件進行灰度分析，計算抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-3的相對表達量，結果以Bcl-2/Bax、Cleaved Caspase-3/Caspase-3表示。

2 結果

2.1 各組細胞毒性比較 對照組以及12.5、25、50 μmol/L PLB 組細胞LDH 釋放量（OD 值）分別為0.073 ± 0.001、0.129 ± 0.005、0.410 ± 0.038、0.461 ± 0.030，PLB不同濃度組LDH釋放量均高于對照組，其中25、50 μmol/L PLB組高于12.5 μmol/L PLB組，50 μmol/L PLB組高于25 μmol/L PLB組（P均＜0.05）。

2.2 各組細胞增殖能力比較 對照組以及12.5、25、50 μmol/L PLB組細胞增殖OD值分別為0.610 ± 0.026、0.529 ± 0.027、0.125 ± 0.026、0.108 ± 0.003，PLB 不同濃度組細胞增殖能力均較對照組下降，其中25、50 μmol/L PLB 組低于12.5 μmol/L PLB 組（P均＜0.05），25 μmol/L PLB 組與50 μmol/L PLB組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.3 各組細胞遷移能力比較 對照組以及12.5、25、50 μmol/L PLB 組細胞遷移率分別為100.0% ± 4.5%、83.5% ± 5.7%、64.2% ± 10.1%、54.2% ± 3.5%，PLB 不同濃度組細胞遷移率均低于對照組，其中25、50 μmol/L PLB 組低于12.5 μmol/L PLB 組（P均＜0.05），25 μmol/L PLB組與50 μmol/L PLB組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.4 各組細胞凋亡情況比較 對照組以及12.5、25、50 μmol/L PLB 組細胞凋亡率分別為5.6% ± 0.1%、22.0% ± 0.1%、52.1% ± 13.4%、70.1% ± 1.3%，PLB不同濃度組細胞凋亡率均高于對照組，其中25、50 μmol/L PLB 組高于12.5 μmol/L PLB 組，50 μmol/L PLB組高于25 μmol/L PLB組（P均＜0.05）。

2.5 各組細胞氧化水平比較 25、50 μmol/L PLB組細胞內ROS 水平均高于對照組和12.5 μmol/L PLB 組，其中50 μmol/L PLB 組高于25 μmol/L PLB組（P均＜0.05）。25、50 μmol/L PLB 組細胞內MDA水平均高于對照組，其中50 μmol/L PLB 組高于12.5、25 μmol/L PLB 組（P均＜0.05）。其他兩兩比較均無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組細胞ROS、MDA水平比較

表1 各組細胞ROS、MDA水平比較

注：與對照組比較，*P＜0.05；與12.5 μmol/L PLB 組比較，#P＜0.05；與25 μmol/L PLB組比較，△P＜0.05。

組別對照組12.5 μmol/L PLB組25 μmol/L PLB組50 μmol/L PLB組ROS 719 ± 220 1 040 ± 247 4 813 ± 562*#6 690 ± 919*#△MDA 0.229 ± 0.031 0.504 ± 0.076 0.841 ± 0.257*1.337 ± 0.397*#△

2.6 各組細胞線粒體膜電位比較 對照組和12.5、25、50 μmol/L PLB 組細胞線粒體膜電位熒光強度分別為433 ± 84、351 ± 148、223 ± 18、166 ± 6，其中25、50 μmol/L PLB 組線粒體膜電位低于對照組，50 μmol/L PLB 組細胞線粒體膜電位低于12.5 μmol/L PLB 組（P均＜0.05），其他兩兩比較均無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。

2.7 各組細胞凋亡相關蛋白表達水平比較 PLB不同濃度組Bcl-2/Bax 均低于對照組，Cleaved Caspase-3/Caspase-3 均高于對照組（P均＜0.05），12.5、25、50 μmol/L PLB 組間兩兩比較均無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。見表2。

表2 各組細胞凋亡相關蛋白表達水平比較（ s）

表2 各組細胞凋亡相關蛋白表達水平比較（ s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別對照組12.5 μmol/L PLB組25 μmol/L PLB組50 μmol/L PLB組Bcl-2/Bax 12.030 ± 1.724 0.419 ± 0.115*0.490 ± 0.055*0.021 ± 0.008*Cleaved Caspase-3/Caspase-3 0.305 ± 0.022 1.198 ± 0.074*1.475 ± 0.253*1.798 ± 0.174*

3 討論

植物中含有的一些天然活性產(chǎn)物可以抑制腫瘤細胞生物合成和有絲分裂，具有作為抗腫瘤藥物開發(fā)的巨大潛力，已經(jīng)用于治療惡性腫瘤的如長春新堿、紫杉醇等［8］。隨著基因編輯技術的快速發(fā)展，人們通過基因修飾促進天然藥物活性物質積累，甚至生產(chǎn)異源重組蛋白，進一步拓寬了植物來源抗腫瘤藥物的開發(fā)潛力。PLB是從中藥白花丹的根系中分離的一種天然萘醌化合物［9］，可調控NF-κB、AKT、MMP-9、VEGF、STAT3、MAPK 等多種信號通路發(fā)揮抗腫瘤活性［3，10-12］，包括誘導DNA 和線粒體損傷［13］、凋 亡［6，14］和 自噬［12］、細 胞 周 期 停滯［14］、抗 血管 生成［11，15］和腫瘤轉移［15］等。研究表明，在乳腺癌MCF-7 細胞中，PLB 可誘導ROS 生成及線粒體膜電位降低，導致細胞凋亡［6］；在胰腺癌細胞中，PLB 可通過損傷線粒體誘導應激信號，并通過激活內在凋亡信號誘導ROS 介導的細胞凋亡［16］；在人舌鱗癌SCC25細胞中，PLB可激活死亡受體介導的凋亡通路，抑制腫瘤細胞增殖［14］。然而，PLB 在涎腺腺樣囊性癌SACC-83 細胞中的抗腫瘤作用和機制還未見報道。本研究結果顯示，不同濃度PLB 培養(yǎng)SACC-83 細胞24 h后，細胞LDH釋放量均高于對照組，PLB濃度越高，LDH 釋放量越高，提示PLB 對腺樣囊性癌細胞具有細胞毒作用。不同濃度PLB 培養(yǎng)細胞24 h 后，細胞的增殖和遷移能力均降低，凋亡率均升高，其中25和50 μmol/L PLB組的效果明顯強于12.5 μmol/L PLB 組。此外，不同濃度PLB 組細胞Bcl-2/Bax 均低于對照組，而Cleaved Caspase-3/Caspase-3 均高于對照組，提示抗凋亡信號減弱、促凋亡信號增強。因此認為，PLB 可有效抑制腺樣囊性癌細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡。

凋亡作為一種常見的程序性細胞死亡形式，可能是PLB發(fā)揮抗涎腺腺樣囊性癌增殖和遷移的重要機制。線粒體作為一種古老的細胞器，不僅通過多種代謝模式為生命提供動力，在細胞凋亡過程中也具有至關重要的作用［17-18］。在誘導線粒體凋亡時，線粒體外膜通透性增加可導致細胞死亡，其下游的凋亡信號通路涉及線粒體釋放的細胞色素C和隨后的Caspase活化［19］。因此，針對線粒體外膜通透性從而調控細胞死亡具有巨大的治療潛力。本研究結果顯示，25、50 μmol/L PLB 組相比12.5 μmol/L PLB組和對照組具有更高的ROS和MDA水平，提示中高濃度PLB可促進腺樣囊性癌細胞的氧化應激。與對照組相比，25、50 μmol/L PLB 處理24 h 后，細胞線粒體膜電位顯著降低，提示PLB 可能促進腺樣囊性癌細胞線粒體應激介導的ROS 生成，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖和遷移。此外，線粒體在其他形式的程序性細胞死亡，包括壞死、鐵死亡和焦亡中可能也具有重要的作用［17］，提示PLB 可能存在基于線粒體調控細胞死亡的新的途徑，這將成為我們下一步的研究重點。

綜上所述，PLB 通過誘導線粒體應激以及ROS介導的細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，可促進脂質過氧化和線粒體膜電位降低，激活凋亡相關信號通路，促進腫瘤細胞凋亡。PLB有望被開發(fā)為治療包括腺樣囊性癌在內的多種腫瘤的天然活性藥物。盡管PLB具有廣泛的抗腫瘤活性，然而其用作抗腫瘤藥物仍存在一些困難：PLB作為天然活性物質，其本身存在水溶性差、生物利用度低的問題；PLB對動物具有中等毒性，作為抗腫瘤藥物其安全性仍有待研究［20］。目前，研究者們已經(jīng)開始著眼于研究和解決PLB 轉化所面臨的困難，針對PLB生物利用度低的問題，有報道納米封裝可以提高PLB 的生物利用度，且不會削弱其抗腫瘤活性［21］。針對PLB 的生物毒性，有文獻報道小鼠口服或腹腔注射PLB引起毒副作用的毒性劑量分別為8～65 mg/kg 和16 mg/kg［11］，已經(jīng)遠遠超過其發(fā)揮抗腫瘤作用的生物效應劑量。然而BELLO 等［22］研究表明，口服2.5 mg/kg PLB 即可誘導線粒體依賴性睪丸細胞死亡，導致精子數(shù)量和活力下降。因此，PLB 可能并不適用于具有生育需求的腫瘤患者。盡管PLB 展現(xiàn)出優(yōu)秀的潛在應用前景，我們仍需對其效應機制、毒性和安全性進行更全面和深入的研究。