miR-149-3p在先天性心臟病胎鼠心臟組織中的表達(dá)及其對P19細(xì)胞分化的影響

胡丹慧，羅慧臣，劉海英

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是常見的新生兒先天性缺陷疾病，每年影響全球約0．9%的嬰兒，而且心臟發(fā)育障礙會(huì)導(dǎo)致多種缺陷［1-3］。CHD是一個(gè)廣泛的概念，主要包括房間隔缺損、室間隔缺損、肺動(dòng)脈瓣狹窄、主動(dòng)脈瓣狹窄、主動(dòng)脈縮窄和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉等類型。據(jù)估計(jì)，產(chǎn)前死亡的胎兒中超過40% 由CHD 造成［4］。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是長度較小且高度保守的非編碼RNA，在各種病理生理狀態(tài)中有復(fù)雜的作用［4］。研究表明，miRNA 在心臟胚胎發(fā)育、正常心血管功能以及CHD的發(fā)病中發(fā)揮重要調(diào)控作用，成為近年來心臟相關(guān)疾病研究的熱點(diǎn)［5］。有研究報(bào)道，miR-149可以在體外促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的心肌分化［6］。miR-149 的基因多態(tài)性與心腦血管疾病有關(guān)［5］。熱休克蛋白家族B 成員6（heat shock protein family B member 6，HSPB6，又稱HSP20）在心肌組織中高表達(dá)，參與多種心臟相關(guān)生理病理過程的調(diào)節(jié)，如增強(qiáng)心臟收縮功能、改善心肌缺血/再灌注損傷等［7］。此外，體內(nèi)外研究顯示HSPB6 可以保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡［8］。然而，miR-149-3p 是否靶向HSPB6 參與CHD 調(diào)控還有待研究。本研究通過構(gòu)建CHD室間隔缺損小鼠模型，探討CHD胎鼠心臟組織中HSPB6 和miR-149-3p 的表達(dá)情況，并采用體外實(shí)驗(yàn)分析miR-149-3p 是否通過靶向下調(diào)HSPB6影響P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡ICR小鼠60只，雌雄比例3∶1，體質(zhì)量25～30 g，均購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2019-0035。小鼠飼養(yǎng)于22～24 ℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h 明暗交替的環(huán)境中，自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑與儀器 小鼠畸胎瘤P19 細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心；α-MEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；丙戊酸（VPA）購自德國Merck 公司；miR-149-3p 過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建、擴(kuò)增、包裝，慢病毒濃縮、純化及慢病毒滴度測定由漢恒生物科技（上海）有限公司完成；嘌呤霉素購自美國Thermo Fisher公司；二甲基亞砜（DMSO）和DAPI 購自北京Solarbio 公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒和SYBR Green PCR Kit購自日本TaKaRa公司；Hairpin-itTMmiRNA qPCR Quantitation Kit 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購自美國Promega公司；小鼠抗人心肌鈣蛋白I（cTnI）單克隆抗體購自于英國Abcam 公司；小鼠抗人HSPB6 抗體和兔抗人GAPDH 抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；山羊抗小鼠熒光二抗IgG488購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。石蠟包埋機(jī)和切片機(jī)購自德國徠卡公司；獨(dú)立控溫PCR 儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀購自美國ABI公司；化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)購自上海Tanon公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠CHD 室間隔缺損模型建立［9］將發(fā)情期雌鼠和雄鼠按3∶1的比例進(jìn)行合籠過夜，次日查見陰栓的雌鼠作為妊娠第1天。選取20只妊娠第7天的孕鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為造模組和正常組，每組10只。造模組按700 mg/kg的劑量腹腔注射1次VPA，正常組腹腔注射等量的0．9%NaCl溶液。

1.3.2 胎鼠心臟組織病理學(xué)檢測 妊娠第19天取出胎鼠，分離心臟，沿縱切面一分為二，分別用于HE染色和qPCR檢測。用4%多聚甲醛固定胎鼠心臟組織24 h，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋后，切片烤片。之后切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇復(fù)水，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，伊紅溶液染色。脫水、透明后封片。用光學(xué)顯微鏡觀察染色后的組織切片，若在連續(xù)切片中觀察到心臟室間隔存在連續(xù)性中斷，則確認(rèn)為胎鼠心臟室間隔缺損即造模成功，并將造模成功的胎鼠納入CHD組。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化 用含10%FBS 的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)P19細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。誘導(dǎo)分化：取處于對數(shù)生長期的P19細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL密度接種于培養(yǎng)皿中，用α-MEM培養(yǎng)基（含1%DMSO）重懸，作為誘導(dǎo)培養(yǎng)的第0 天。之后每隔2 d 進(jìn)行1 次半量換液，在誘導(dǎo)第4天晚上，取30～50個(gè)胚胎樣小體接種至6孔板中，用α-MEM培養(yǎng)基（無DMSO）培養(yǎng)，隨后每隔2 d進(jìn)行1次全量換液，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)的第0、5、10天收集細(xì)胞。

1.3.4 慢病毒感染 將對數(shù)生長期的P19細(xì)胞按照3×105個(gè)/孔密度接種至6孔板中。將細(xì)胞分為空白對照組（blank組）、空載組（Vector 組）和miR-149-3p 過表達(dá)組（miR-149-3p組）。待細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，按照50∶1的病毒感染比例取空載或miR-149-3p過表達(dá)慢病毒（病毒滴度1．5×108TU/mL）感染P19 細(xì)胞。感染6～8 h 后，換液繼續(xù)培養(yǎng)。待感染48 h后，加入終質(zhì)量濃度為0．5 mg/L的嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)，用于篩選穩(wěn)定表達(dá)株，qPCR檢測miR-149-3p的表達(dá)。

1.3.5 qPCR檢測 取胎鼠心臟組織、DMSO誘導(dǎo)分化的P19細(xì)胞或慢病毒感染后的P19 細(xì)胞，采用Trizol 法提取組織或細(xì)胞總RNA，采用分光光度計(jì)對RNA進(jìn)行定量后，再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，依照Hairpin-itTMmiRNA qPCR Quantitation Kit和SYBR Green PCR Kit說明書，通過qPCR 分別檢測miR-149-3p 和其他基因的表達(dá)水平。引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。miR-149-3p以U6為內(nèi)參，其他基因mRNA 以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算各組樣本中miR-149-3p、HSPB6、GATA4、cTnT、ANP mRNA的相對表達(dá)量。

Tab.1 The primer sequences of real-time fluorescent quantitative PCR表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3.6 Western blot 檢測 取慢病毒感染后的各組P19 細(xì)胞沉淀，采用RIPA 裂解緩沖液裂解各組細(xì)胞，在4 ℃條件下離心抽提總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。各組取等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，之后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，在4 ℃下加入一抗HSPB6（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）孵育過夜。次日，將膜與二抗在室溫下孵育1 h，膜上滴加ECL 進(jìn)行曝光。以GAPDH 為內(nèi)參，對各組蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.3.7 免疫熒光染色 取慢病毒感染后的各組P19細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中，加入1%DMSO誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化。在分化的第9 天，按照3×105個(gè)/孔接種至6 孔板中（放有蓋玻片），培養(yǎng)至分化第10天。用PBS輕輕洗滌在蓋玻片上生長的細(xì)胞，在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min后，將細(xì)胞用0．1%NP-40透化5 min，并用5%山羊血清封閉1 h；加入cTnI單克隆抗體（1∶50），室溫孵育1 h，再加入熒光二抗（1∶500）室溫避光孵育1 h。用DAPI 對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，在載玻片上滴加防淬滅劑后封片。用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，每組中隨機(jī)讀取5個(gè)視野并拍攝照片，統(tǒng)計(jì)其中cTnI陽性的細(xì)胞數(shù)。以cTnI 陽性細(xì)胞數(shù)與視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)的比值計(jì)算心肌細(xì)胞分化率。

1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 采用TargetScan 7．2 軟件預(yù)測HSPB6的3′-UTR 上假定的miR-149-3p識(shí)別位點(diǎn)，據(jù)此構(gòu)建含HSPB6 3'-UTR 野生型（WT，序列GGGAGGG）和突變型（MUT，序列GAAGAGG）報(bào)告質(zhì)粒。當(dāng)空載組和miR-149-3p過表達(dá)組細(xì)胞融合度達(dá)到60%左右時(shí)，利用Lipofectamine 3000 試劑將HSPB6-WT 和HSPB6-MUT 報(bào)告載體轉(zhuǎn)染至各組細(xì)胞。待轉(zhuǎn)染48 h 后，收集各組細(xì)胞，參照雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)說明書檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性為參照來計(jì)算各組相對酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22．0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胎鼠心臟組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，正常組胎鼠心臟組織室間隔整齊，動(dòng)脈瓣膜以及房室瓣膜發(fā)育較成熟，大血管發(fā)育良好，而CHD組胎鼠心臟組織連續(xù)切片存在室間隔連續(xù)性中斷，室間隔缺損較為明顯，血管發(fā)育不完善，見圖1。

Fig．1 Histopathological changes of fetal mouse heart tissue(HE staining,×400)圖1 胎鼠心臟組織病理學(xué)變化（HE染色，×400）

2.2 各組胎鼠心臟組織中miR-149-3p 的表達(dá)水平 qPCR 結(jié)果顯示，與正常組比較，CHD 組胎鼠心臟組織中miR-149-3p 表達(dá)水平明顯升高（5．415±0．904vs.1．004±0．072；n=10，t=15．376，P＜0．01）。

2.3 miR-149-3p 在P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化 qPCR 結(jié)果顯示，DMSO 誘導(dǎo)P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化第0、5 和10 天心肌分化標(biāo)志物GATA4、cTnT和ANP mRNA表達(dá)水平不斷升高（P＜0．01），P19細(xì)胞成功向心肌細(xì)胞分化。與此同時(shí)，在該誘導(dǎo)分化過程中miR-149-3p 表達(dá)水平不斷降低（P＜0．05），見表2。

Tab.2 Changes in expression levels of GATA4,cTnT and ANP mRNA and miR-149-3p during the process of inducing differentiation表2 誘導(dǎo)分化過程中GATA4、cTnT、ANP mRNA和miR-149-3p表達(dá)變化（n=3，±s）

Tab.2 Changes in expression levels of GATA4,cTnT and ANP mRNA and miR-149-3p during the process of inducing differentiation表2 誘導(dǎo)分化過程中GATA4、cTnT、ANP mRNA和miR-149-3p表達(dá)變化（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與第0天比較，b與第5天比較，P＜0．05。

時(shí)間第0天第5天第10天F GATA4 0．973±0．023 3．367±0．751a 7．333±0．651b 94．072＊＊cTnT 0．950±0．030 4．600±0．614a 9．167±0．777b 155．374＊＊ANP 0．987±0．086 3．500±0．755a 8．233±0．666b 119．370＊＊miR-149-3p 1．009±0．076 0．449±0．120a 0．216±0．071b 59．349＊＊

2.4 miR-149-3p 過表達(dá)抑制P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化 qPCR結(jié)果顯示，慢病毒感染后，與blank組或Vector 組比較，miR-149-3p 組細(xì)胞中miR-149-3p表達(dá)水平明顯升高（P＜0．01），見表3。各組P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化第10 天，免疫熒光結(jié)果顯示，blank組和Vector組均有較強(qiáng)的cTnI蛋白綠色熒光，而miR-149-3p 組cTnI 蛋白綠色熒光明顯減弱且含有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)也明顯減少，見圖2。與blank 組或Vector 組比較，miR-149-3p 組心肌細(xì)胞分化率明顯降低（P＜0．01），見表3。qPCR 結(jié)果顯示，與blank 組或Vector 組比較，miR-149-3p 組細(xì)胞內(nèi)心肌分化標(biāo)志物GATA4、cTnT和ANP mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0．01），見表4。

Tab.3 Effects of miR-149-3p overexpression on miR-149-3p expression and cardiomyocyte differentiation during P19 cell differentiation into cardiomyocytes表3 miR-149-3p過表達(dá)對P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中miR-149-3p表達(dá)和心肌細(xì)胞分化率的影響（n=3，±s）

Tab.3 Effects of miR-149-3p overexpression on miR-149-3p expression and cardiomyocyte differentiation during P19 cell differentiation into cardiomyocytes表3 miR-149-3p過表達(dá)對P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中miR-149-3p表達(dá)和心肌細(xì)胞分化率的影響（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與blank組比較，b與Vector組比較，P＜0．05；表4、5同。

組別blank組Vector組miR-149-3p組F miR-149-3p 1．007±0．021 1．033±0．025 5．277±0．677ab 118．404＊＊心肌細(xì)胞分化率（%）67．977±5．234 66．403±6．330 21．840±6．719ab 54．832＊＊

Fig．2 The expression of cTnI protein(cellular immunofluorescence,×400)圖2 cTnI蛋白的表達(dá)情況（細(xì)胞免疫熒光，×400）

Tab.4 Effects of miR-149-3p overexpression on GATA4,cTnT and ANP mRNA expressions during the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes表4 miR-149-3p過表達(dá)對P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中GATA4、cTnT和ANP mRNA表達(dá)的影響（n=3，±s）

Tab.4 Effects of miR-149-3p overexpression on GATA4,cTnT and ANP mRNA expressions during the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes表4 miR-149-3p過表達(dá)對P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中GATA4、cTnT和ANP mRNA表達(dá)的影響（n=3，±s）

組別blank組Vector組miR-149-3p組F GATA4 0．993±0．088 1．007±0．089 0．364±0．062ab 62．128＊＊cTnT 1．009±0．087 1．028±0．085 0．290±0．075ab 77．285＊＊ANP 0．969±0．043 1．002±0．099 0．305±0．099ab 65．468＊＊

2.5 miR-149-3p 通過靶向下調(diào)HSPB6 影響P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化 與正常組相比，CHD 組胎鼠心臟組織中HSPB6 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（0．323±0．081 和0．991±0．066；n=10，t=20．252，P＜0．01）。經(jīng)1%DMSO誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化第0、5和10天過程中HSPB6 mRNA 表達(dá)水平不斷升高（依次為0．967±0．026、2．189±0．339 和4．113±0．309；n=3，F(xiàn)=107．269，P＜0．01）。

與blank 組或Vector 組比較，miR-149-3p 過表達(dá)后P19細(xì)胞中HSPB6 mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0．05），見圖3、表5。TargetScan 7．2 軟件預(yù)測結(jié)果顯示，HSPB6 基因3'-UTR 區(qū)域上存在與miR-149-3p 結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)，過表達(dá)miR-149-3p可使得HSPB6-WT報(bào)告基因的相對熒光素酶活性顯著降低（0．532±0．098和1．000±0．045；n=3，t=7．495，P＜0．01）；而過表達(dá)miR-149-3p 對HSPB6-MUT 報(bào)告基因的相對熒光素酶活性無明顯影響（1．010±0．091 和0．993±0．080；n=3，t=0．232，P＞0．05）。

Fig．3 The expression of HSPB6 protein圖3 HSPB6蛋白的表達(dá)情況

Tab.5 Effects of miR-149-3p overexpression on HSPB6 mRNA and protein expression during the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes表5 miR-149-3p過表達(dá)對P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中HSPB6 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（n=3，±s）

Tab.5 Effects of miR-149-3p overexpression on HSPB6 mRNA and protein expression during the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes表5 miR-149-3p過表達(dá)對P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中HSPB6 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（n=3，±s）

組別blank組Vector組miR-149-3p組F HSPB6 mRNA 1．010±0．084 1．000±0．116 0．217±0．083ab 67．815＊＊HSPB6蛋白1．098±0．180 1．136±0．059 0．458±0．099ab 28．391＊＊

Fig．4 The targeting site of miR-149-3p and HSPB6圖4 miR-149-3p與HSPB6的靶向結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

心臟在胚胎發(fā)育過程中受到多種因素調(diào)控和影響，任何微小差錯(cuò)都可能導(dǎo)致心房、心室和瓣膜等心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生病變，從而導(dǎo)致CHD 的發(fā)生［10］。研究CHD 的病因和發(fā)病機(jī)制對于CHD 的預(yù)防和治療至關(guān)重要。CHD小鼠是理想的CHD動(dòng)物模型，向孕期小鼠腹腔注射VPA，誘導(dǎo)胚胎心臟畸形的產(chǎn)生，其操作難度低，檢測指標(biāo)簡單易行［9］。本研究采用孕鼠腹腔注射VPA成功構(gòu)建了CHD胎鼠模型。

miRNA 在心臟胚胎發(fā)育、維持正常心血管功能及CHD發(fā)病中發(fā)揮重要調(diào)控作用［5］。miR-23b可靶向GATA6下調(diào)類胰島素生長因子1（IGF-1），從而促進(jìn)CHD 的發(fā)展［11］；miR-219-5p 通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡參與紫紺型CHD 進(jìn)展［12］。有研究報(bào)道，miR-149可以促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化［6］，其基因的多態(tài)性與心腦血管疾病有關(guān)［5］。以上研究表明，miR-149-3p 可能參與CHD 以及其他心臟疾病的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，CHD 胎鼠心臟組織中miR-149-3p高表達(dá)，而在P19細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中miR-149-3p 表達(dá)水平則不斷下降，提示miR-149-3p高表達(dá)可能不利于P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在P19細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，miR-149-3p過表達(dá)可以明顯降低P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，同時(shí)下調(diào)心肌細(xì)胞分化標(biāo)志物GATA4、cTnT 和ANP 的表達(dá)。由此說明miR-149-3p 過表達(dá)可以抑制P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，提示miR-149-3p高表達(dá)可能是參與CHD發(fā)病的重要病理因素。

HSP 是一個(gè)高度保守的分子伴侶家族，可作為細(xì)胞的“防御者”，保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)外刺激和損傷。作為HSP家族成員，HSPB6在心肌組織中高表達(dá)，具有顯著的心臟保護(hù)能力，其過表達(dá)可改善藥物性心臟損傷；HSPB6還是一種血管舒張劑，可減少與靜脈移植相關(guān)的血管痙攣和血栓形成［7］。HSPB6不但可以降低氧氣/葡萄糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞器損傷和細(xì)胞凋亡的水平［13］，還可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子等的分泌，激活血管內(nèi)皮生長因子受體2，誘導(dǎo)心肌血管生成［14-15］。也有研究報(bào)道，miR-23a-5p可通過靶向HSPB6/ASK1參與調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷［16］；miR-34a-5p 可能調(diào)控HSPB6 的激活，從而誘導(dǎo)膀胱癌腫瘤細(xì)胞的血管生成過程［14］。miR-149-3p能否通過靶向下調(diào)HSPB6表達(dá)影響P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化尚不明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CHD胎鼠心臟組織中以及在P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中，HSPB6 的表達(dá)趨勢與miR-149-3p 相反，提示miR-149-3p 與HSPB6 可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，HSPB6基因3'-UTR區(qū)存在與miR-149-3p結(jié)合的位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)miR-149-3p可以靶向調(diào)控HSPB6。

綜上所述，miR-149-3p可能通過靶向下調(diào)HSPB6影響心肌細(xì)胞分化進(jìn)而參與CHD的病理機(jī)制，這可能為CHD的預(yù)防和治療提供新的潛在靶點(diǎn)。當(dāng)然，HSPB6基因過表達(dá)是否可逆轉(zhuǎn)miR-149-3p 對P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的抑制作用還需進(jìn)一步證實(shí)。