基于鈣超載探討自主神經(jīng)調(diào)控對(duì)HFpEF大鼠心肌結(jié)構(gòu)重塑、電重塑及纖維化的影響

彭明，李玉凱，王嵐，黃糧，成忠，肖杰

慢性心力衰竭（CHF）是由于存在心臟結(jié)構(gòu)和（或）功能異常，引起心輸出量下降和（或）心內(nèi)壓力增高，從而導(dǎo)致一系列相關(guān)臨床表現(xiàn)的綜合征。2016年歐洲心血管學(xué)會(huì)（European Society of Cardiovascular Diseases，ESC）心力衰竭管理指南依據(jù)左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）將心力衰竭分為射血分?jǐn)?shù)降低心力衰竭（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF，LVEF＜0．4）、射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF，LVEF＞0．5）以及射血分?jǐn)?shù)中間范圍心力衰竭（heart failure with mid-range ejection fraction，HFmrEF，LVEF 0．4～0．5）［1］。近年來(lái)HFpEF 發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，成為心力衰竭患者中比例最高的分型［2-3］。HFpEF 的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明，亦無(wú)有效治療方案，其發(fā)病率和死亡率與HFrEF相比沒(méi)有明顯的改善［4-5］。因此，仍需要進(jìn)一步研究HFpEF 的病理生理機(jī)制以尋找新的有效治療方案。自主神經(jīng)功能紊亂在CHF 發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，表現(xiàn)為交感神經(jīng)亢進(jìn)以及迷走神經(jīng)活性低下。自主神經(jīng)調(diào)控旨在改善這種狀態(tài)，帶來(lái)心血管方面的獲益。本研究主要針對(duì)大鼠HFpEF 模型進(jìn)行經(jīng)皮耳緣迷走神經(jīng)刺激（transcutaneous vagus nerve stimulation，tVNS），觀察自主神經(jīng)調(diào)控對(duì)HFpEF大鼠模型的治療作用，并對(duì)此作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康12 周齡SD 大鼠44 只，雌雄各半，體質(zhì)量（250±50）g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：20210428Aazz0619000445；生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001。

1.2 主要試劑及儀器 B 型尿鈉肽前體（NT-proBNP）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、SDS-聚丙烯酰胺凝膠試劑盒、ECL 顯色試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）、肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATP enzyme，SERCA）2a 及其調(diào)節(jié)蛋白受磷蛋白（phospholamban，PLB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔抗鼠抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和純羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；胎牛血清、HE染液套裝及Masson 染液套裝購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；DEPC水購(gòu)于碧云天生物公司；Trizol購(gòu)于合肥博美生物科技有限公司；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司；SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）購(gòu)于大連寶生物科技有限公司。

病理切片機(jī)購(gòu)于上海徠卡儀器有限公司；正置熒光顯微鏡、正置光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本尼康公司；PCR 儀購(gòu)于杭州安杰思生物科技有限公司；微量分光光度計(jì)購(gòu)于杭州奧盛儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于上海天能科技有限公司；動(dòng)物專用超聲儀購(gòu)于加拿大VisualSonics 公司；心臟電生理刺激儀購(gòu)于蘇州東方電子儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模、分組及干預(yù) 44只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只作為對(duì)照組，余34只用于建立HFpEF模型。其中30只大鼠建模成功，4只死亡。建模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組，每組10 只：模型組、自主神經(jīng)調(diào)控組（調(diào)控組）及自主神經(jīng)調(diào)控+乙酰膽堿M2受體拮抗劑組（調(diào)控+拮抗組）。除對(duì)照組外，其余各組大鼠均進(jìn)行造模手術(shù)。第1次手術(shù)，麻醉大鼠后剖腹，鈍性分離腎動(dòng)脈和髂分叉之間的主動(dòng)脈和下腔靜脈的覆蓋外膜，并將針頭插入2根血管創(chuàng)建分流，建立瘺道后用氰基丙烯酸酯進(jìn)行粘合。通過(guò)觀察下腔靜脈顏色變紅，證實(shí)瘺管的形成。2周后進(jìn)行第2次手術(shù)，結(jié)扎動(dòng)靜脈瘺。通過(guò)心臟彩超結(jié)合NT-proBNP的測(cè)定結(jié)果，確定存在心室壁增厚合并舒張功能不全，且LVEF 大于0．5，符合《2021年ESC 急慢性心力衰竭診斷和治療指南》中HFpEF的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，確定HFpEF模型構(gòu)建成功。調(diào)控組在模型組基礎(chǔ)上將刺激電極固定于大鼠雙側(cè)耳廓的耳屏內(nèi)側(cè)的迷走神經(jīng)，設(shè)置刺激程序參數(shù)為1 mA 方波、脈寬1 ms、刺激頻率20 Hz，每日刺激30 min，持續(xù)刺激6周。調(diào)控+拮抗組在調(diào)控組基礎(chǔ)上，每天尾靜脈注射乙酰膽堿M2受體拮抗劑美索曲明（0．5 mg/kg），直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 心肌結(jié)構(gòu)重塑、電重塑以及心力衰竭指標(biāo)測(cè)定 將各組大鼠麻醉后仰臥固定，使用心臟超聲儀檢測(cè)LVEF、二尖瓣舒張?jiān)缙?二尖瓣舒張晚期血流速度最大峰值（peak value of mitral flow velocity in early diastole/peak value of mitral flow velocity in late diastole，E/A）、舒張末期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall end-diastolic dimension，LVPWD-D）及舒張末期室間隔厚度（interventricular ventricular septum end-diastolic dimension，IVS-D）。在各組大鼠深度麻醉狀態(tài)下開(kāi)胸暴露其心臟，將一對(duì)雙極導(dǎo)絲電極頭端用無(wú)創(chuàng)針縫合在左心室處，兩電極間距為2～3 mm，接通臨時(shí)起搏器，進(jìn)行心室電刺激，記錄有效不應(yīng)期（effective refractory period，ERP）和單向動(dòng)作電位時(shí)程（monophasic action potential duration，MAPD），具體參照溫霞等［7］方法進(jìn)行。處死大鼠后，取血清標(biāo)本，用ELISA 法檢測(cè)血清NT-proBNP 水平。取出心肌組織，一部分制成石蠟切片，另一部分液氮冷凍備用。

1.5 心肌組織HE 染色及Masson 染色觀察心肌組織細(xì)微結(jié)構(gòu) 大鼠心肌組織石蠟包埋切片、脫蠟至水、組織透化進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞排列以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。Masson染色觀察心肌纖維化程度，膠原纖維呈藍(lán)色，心肌組織呈紅色。

1.6 RT-PCR 檢測(cè)MMP-9、TIMP-1、SERCA2a 及PLB mRNA的表達(dá) 心肌組織進(jìn)行勻漿，Trizol法提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成第1 鏈cDNA，再進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR·Mix 10 μL，上下游引物各0．4 μL，cDNA 2 μL，無(wú)核酸酶的雙蒸水7．2 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)大鼠體內(nèi)MMP-9、TIMP-1、SERCA2a 以及PLB mRNA 的表達(dá)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目標(biāo)基因mRNA 的表達(dá)情況，引物序列見(jiàn)表1。

1.7 Western blot 檢測(cè)MMP-9、TIMP-1、SERCA2a 以及PLB蛋白的表達(dá) 取心肌組織冰上進(jìn)行裂解1 h，BCA 法測(cè)總蛋白含量，對(duì)各組蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行胎牛血清封閉，加入MMP-9、TIMP-1、SERCA2a、PLB 一抗（均1∶1 000稀釋）以及內(nèi)參蛋白GAPDH（1∶2 000稀釋）抗體，在4 ℃下孵育過(guò)夜。孵育后洗膜3 次。二抗（1∶5 000 稀釋）搖床孵育2 h。洗膜后加ECL 發(fā)光劑，避光顯色5 min。Image J 軟件分析各蛋白的表達(dá)，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 Primer sequence of PCR表1 PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26．0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組大鼠心力衰竭指標(biāo)、結(jié)構(gòu)重塑及電重塑的比較 與對(duì)照組比較，模型組NT-proBNP、LVPWDD、IVS-D、ERP及MAPD值升高，而E/A值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。與模型組比較，調(diào)控組NT-proBNP、LVPWD-D、IVS-D、ERP 及MAPD 值降低，E/A 值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。調(diào)控+拮抗組上述各指標(biāo)與模型組相比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組、模型組、調(diào)控組以及調(diào)控+拮抗組大鼠LVEF 值均＞0．5，且各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.2 4 組大鼠心肌組織病理改變的比較 HE 染色顯示對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙清晰可見(jiàn)，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙不夠明顯，伴有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。調(diào)控組上述病理改變與模型組相比均明顯減輕。而調(diào)控+拮抗組與模型組相比改善不明顯，見(jiàn)圖1。Masson染色可見(jiàn)對(duì)照組心肌纖維排列整齊，少有膠原纖維附著。與對(duì)照組比較，模型組心肌纖維排列紊亂，大量膠原纖維生成。調(diào)控組上述病理改變與模型組相比均明顯減輕。而調(diào)控+拮抗組與模型組相比改善不明顯，見(jiàn)圖2。

2.3 4組大鼠心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)的比較 模型組MMP-9 mRNA 及蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，TIMP-1 mRNA 及蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。調(diào)控組MMP-9 mRNA 及蛋白表達(dá)低于模型組，TIMP-1 mRNA 及蛋白表達(dá)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。而調(diào)控+拮抗組上述指標(biāo)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3，圖3。

Tab.2 Comparison of indexes of heart failure,structural remodeling and electrical remodeling between four groups of rats表2 4組大鼠間心力衰竭指標(biāo)、結(jié)構(gòu)重塑及電重塑指標(biāo)的比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of indexes of heart failure,structural remodeling and electrical remodeling between four groups of rats表2 4組大鼠間心力衰竭指標(biāo)、結(jié)構(gòu)重塑及電重塑指標(biāo)的比較（n=10，±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0．05。

組別對(duì)照組模型組調(diào)控組調(diào)控+拮抗組F NT-proBNP（ng/L）45．22±6．26 301．25±16．07a 79．33±5．63b 297．73±18．77 1 112．080＊＊E/A 1．85±0．06 1．28±0．06a 1．66±0．05b 1．28±0．04 255．841＊＊LVPWD-D（mm）7．59±0．06 7．99±0．22a 7．74±0．04b 7．97±0．20 16．429＊＊IVS-D（mm）1．51±0．02 2．14±0．08a 1．70±0．02b 2．14±0．07 371．247＊＊LVEF 0．58±0．04 0．57±0．06 0．57±0．06 0．58±0．05 0．049 ERP（ms）155．43±4．32 183．11±5．83a 167．49±2．23b 182．88±4．90 87．549＊＊MAPD（ms）172．04±4．85 216．95±4．76a 179．86±2．98b 216．22±4．40 301．465＊＊

Fig．1 The pathological results of ventricular tissue in four groups of rats(HE staining,×400)圖1 4組大鼠心室組織病理結(jié)果（HE染色，×400）

Fig．2 The pathological results of ventricular tissue in four groups of rats(Masson staining,×400)圖2 4組大鼠心室組織病理結(jié)果（Masson染色，×400）

Tab.3 Comparison of related indexes of myocardial fibrosis between four groups of rats表3 4組大鼠心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)的比較（n=10，±s）

Tab.3 Comparison of related indexes of myocardial fibrosis between four groups of rats表3 4組大鼠心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)的比較（n=10，±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；a 與對(duì)照組相比較，b 與模型組相比較，P＜0．05。

組別對(duì)照組模型組調(diào)控組調(diào)控+拮抗組F MMP-9 mRNA 1．00±0．02 5．78±0．81a 1．37±0．03b 5．40±1．62 79．460＊＊MMP-9蛋白0．22±0．04 0．69±0．06a 0．49±0．05b 0．70±0．04 220．176＊＊TIMP-1 mRNA 1．00±0．02 0．13±0．03a 0．72±0．16b 0．13±0．02 296．185＊＊TIMP-1蛋白0．80±0．07 0．31±0．03a 0．71±0．04b 0．30±0．06 269．906＊＊

2.4 4 組大鼠心肌鈣超載指標(biāo)的比較 模型組SERCA2a mRNA 及蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，PLB mRNA 及蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。調(diào)控組SERCA2a mRNA 及蛋白表達(dá)高于模型組，PLB mRNA及蛋白表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。而調(diào)控+拮抗組上述指標(biāo)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4，圖4。

Fig．3 Typical Western blot results of MMP-9 and TIMP-1 proteins in myocardium of four groups of rats圖3 4組大鼠心肌組織MMP-9、TIMP-1蛋白的典型免疫印跡圖

Tab.4 Comparison of related indexes of calcium overload between four groups of rats表4 4組大鼠鈣超載相關(guān)指標(biāo)的比較（n=10，±s）

Tab.4 Comparison of related indexes of calcium overload between four groups of rats表4 4組大鼠鈣超載相關(guān)指標(biāo)的比較（n=10，±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；a 與對(duì)照組相比較，b 與模型組相比較，P＜0．05。

組別對(duì)照組模型組調(diào)控組調(diào)控+拮抗組F SERCA2a mRNA 0．99±0．01 0．14±0．03a 0．80±0．06b 0．11±0．03 1 439．914＊＊SERCA2a蛋白0．71±0．08 0．19±0．05a 0．52±0．03b 0．23±0．04 215．837＊＊PLB mRNA 1．01±0．02 5．76±0．99a 1．95±0．12b 5．68±0．75 156．731＊＊PLB蛋白0．24±0．02 0．74±0．03a 0．44±0．03b 0．76±0．05 539．140＊＊

3 討論

Fig．4 Typical Western blot results of SERCA2a and PLB proteins in myocardium of four groups of rats圖4 4組大鼠心肌組織SERCA2a、PLB蛋白的典型免疫印跡圖

HFpEF是以心臟出現(xiàn)向心性肥厚及舒張功能不全為特征性臨床表現(xiàn)的綜合征，其發(fā)病機(jī)制并未完全闡明。目前研究證實(shí)，鈣超載與心力衰竭后心臟的結(jié)構(gòu)重塑及電重塑關(guān)系密切。細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體膜上的Ca2+-ATP 酶活性的改變可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，繼而激活鈣依賴性的蛋白水解酶，具有活性的蛋白水解酶可以溶解心肌蛋白，引起結(jié)構(gòu)重塑［8］。細(xì)胞內(nèi)的鈣超載還引起動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)、延遲后除極以及復(fù)極離散程度增大，引起心臟的電重塑，最終導(dǎo)致與觸發(fā)及折返有關(guān)的心律失常的發(fā)生［9］。SERCA 和PLB 是維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)蛋白［10］。SERCA2a 是心肌細(xì)胞中SERCA 的主要亞型，其主要作用是心臟舒張時(shí)將細(xì)胞漿內(nèi)的Ca2+泵入到肌漿網(wǎng)，降低細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度［11］。PLB是SERCA2a活性的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，能抑制SERCA2a活性［12］，故通過(guò)檢測(cè)心肌組織內(nèi)SERCA2a、PLB mRNA 及蛋白的表達(dá)可以反映機(jī)體內(nèi)鈣超載的情況。本研究中，模型組大鼠出現(xiàn)了以心臟室壁增厚及舒張功能降低為主要表現(xiàn)的心力衰竭，并且存在電重塑，這些結(jié)果可能與鈣超載水平的升高相關(guān)。

鈣超載還可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度纖維化，進(jìn)而引起左心室主動(dòng)舒張功能障礙及被動(dòng)僵硬度升高，這也和Ca2+-ATP 酶活性高度相關(guān)［13-15］。MMP-9能溶解心肌膠原基質(zhì)，誘發(fā)心力衰竭后的間質(zhì)纖維化，TIMP-1則能抑制MMP-9的活性，延緩心肌間質(zhì)纖維化［16］。本研究中，相對(duì)于對(duì)照組，模型組MMP-9 mRNA 及蛋白表達(dá)升高，TIMP-1 mRNA 及蛋白表達(dá)降低，結(jié)合心肌病理切片Masson染色提示模型組大鼠心肌膠原纖維增生明顯，說(shuō)明模型組大鼠心肌纖維化水平明顯升高，這種病理過(guò)程可能也與鈣超載水平升高相關(guān)。

有研究顯示，自主神經(jīng)調(diào)控可以改善體內(nèi)鈣超載狀態(tài)，交感神經(jīng)活性增高會(huì)升高豬室性心律失常模型體內(nèi)的鈣水平，從而增加惡性心律失常發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［17］，而迷走神經(jīng)刺激可以改善犬心房顫動(dòng)模型體內(nèi)的鈣超載狀態(tài)，從而減輕心臟的結(jié)構(gòu)重塑及電重塑［18］。本研究中調(diào)控組相對(duì)于模型組，大鼠心肌的NT-proBNP 水平、結(jié)構(gòu)重塑、電重塑、心肌纖維化以及鈣超載的程度降低，說(shuō)明迷走神經(jīng)刺激改善了HFpEF 大鼠的心力衰竭狀態(tài)，并且這種獲益可能是通過(guò)降低鈣超載水平實(shí)現(xiàn)的。

在本研究中，調(diào)控+拮抗組經(jīng)阻斷迷走神經(jīng)傳導(dǎo)后再予以迷走神經(jīng)刺激，相比模型組，其NT-proBNP水平、心臟結(jié)構(gòu)重塑、電重塑、鈣超載以及心肌纖維化的程度均無(wú)明顯改善，因此進(jìn)一步驗(yàn)證了迷走神經(jīng)刺激可以有效治療HFpEF，自主神經(jīng)調(diào)控有望成為HFpEF治療的新選擇。

本研究雖得出陽(yáng)性結(jié)果，但對(duì)于自主神經(jīng)調(diào)控對(duì)HFpEF 的干預(yù)作用后續(xù)仍需更大樣本量的研究進(jìn)行觀察總結(jié)。對(duì)于自主神經(jīng)調(diào)控對(duì)HFpEF 的作用機(jī)制，仍需更多的病理生理研究。