苦蕎醋飲及沙棘醋飲在代謝相關(guān)脂肪性肝病斑馬魚幼魚中的應用

司 霞，張 昕，王晨堯，朱瑞芳，曹 妍，馮耀清，韓世范，*

1.山西醫(yī)科大學護理學院，山西 030001；2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院；3.山西醫(yī)學期刊社有限責任公司

代謝相關(guān)脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）是一種臨床病理綜合征，其特征是在沒有過量飲酒和其他特定肝損害因素的情況下肝細胞中脂肪沉積過多[1]。近幾年，隨著人們生活水平的提高，我國脂肪肝患病率增高，一項Meta 分析檢索了2008 年—2018 年相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)MAFLD 全國患病率達29.2%[2]，且已有研究顯示，MAFLD 與心血管疾病[3]、糖尿病[4]、肝癌[5]等慢性病發(fā)病率呈正相關(guān)。目前尚無針對MAFLD 的理想治療方法，但越來越多的研究者認為，有效的飲食干預可能是治療MAFLD 的重要新策略[6]，給予科學的飲食建議對制定預防與改善MAFLD 的飲食護理方案具有極其重要的意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，部分MAFLD 病人能夠通過食補苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲的方式改善MAFLD 癥狀，但沙棘醋飲、苦蕎醋飲均屬于新型發(fā)酵功能飲品，有關(guān)醋飲對MAFLD 的相關(guān)研究有限，確切的健康益處尚不清楚。本研究就苦蕎醋飲、沙棘醋飲和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲對MAFLD 斑馬魚幼魚的影響進行研究，以期明確醋飲對MAFLD 的預防效果?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取山西大學生物醫(yī)學研究院斑馬魚實驗室繁殖培養(yǎng)的野生型AB 斑馬魚，生長溫度為（28±1）℃，光照14 h 與黑暗10 h 交替循環(huán)。

1.2 醋飲與試劑 膽固醇[金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司]；血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針方法的活性氧物質(zhì)測定試劑盒（Beyotime，中國）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒（索萊寶）；E3 培養(yǎng)基；亞甲基藍（生工）；沙棘醋飲與苦蕎醋飲（山西梁汾醋業(yè)）；核糖核酸（RNA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 與實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）試劑盒TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)（TAKARA）；qPCR 引物（由武漢塞維爾生物科技有限公司合成）。

1.3 主要儀器 BPH-9082 恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；超凈工作臺（力康儀器公司）；低溫離心機（Gene SPEED）；超聲破碎儀（Qsonica）；體式顯微鏡（Nikon SMZ745）；體式熒光顯微鏡（OLYMPUS SZX16）；酶標儀（美國柏騰 SynergyH1）；-80 ℃低溫冰箱（松下公司）；分析天平（SOPTOP/舜宇恒平）；超微量分光光度計NanoDrop One（Thermo Fisher 公司）；PCR 儀(東 勝-ETC821D)；CFX96TMReal-Time PCR Detection System 熒光定量PCR 儀（上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）。

1.4 研究方法 配制斑馬魚幼魚高膽固醇飼料 準備需要制備的幼魚飼料，按照5%的比例添加膽固醇，用液體乙醚將膽固醇充分溶解后再與幼魚飼料混合，進行充分攪拌直至乙醚全部揮發(fā)。

1.5 斑馬魚幼魚分組與喂食 野生型AB 品系斑馬魚在E3 培養(yǎng)液中孵化至受精后5 d 時將斑馬魚更換至白色塑料小缸中，容量約1 L，鍛煉幼魚游泳能力。適應性喂養(yǎng)3 d 后在體式顯微鏡下將發(fā)育正常、游泳能力好的幼魚按完全隨機分組的方法分為對照組、高膽固醇飲食組、苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組，每組100 條幼魚，所有實驗組和對照組均設(shè)置2 個平行組。對照組給予標準普通飼料20 mg，高膽固醇組給予高膽固醇飼料20 mg，苦蕎醋飲組給予高膽固醇飼料20 mg+0.1%苦蕎醋飲，沙棘醋飲組給予高膽固醇飼料20 mg+0.1%沙棘醋飲，苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組給予高膽固醇飼料20 mg+0.05%苦蕎醋飲+0.05%沙棘醋飲。喂養(yǎng)后及時清理食物殘渣，每天換水1 次。連續(xù)干預1 周。

1.6 觀察指標及其實驗方法 ①存活率：連續(xù)干預1周后觀察并記錄各組斑馬魚幼魚存活條數(shù)，并計算百分率。②體重、體長：連續(xù)干預1 周后用0.02%三卡因(Tricane)將幼魚麻醉，用吸水紙將幼魚表面水分吸干，將10 條幼魚作為一組樣本采用分析天平測量體重；選取30 條斑馬魚幼魚，顯微鏡下采用Image 軟件測量斑馬魚幼魚體長。③三酰甘油、總膽固醇和丙二醛：連續(xù)干預1 周后，每組隨機選取斑馬魚幼魚50 條，按照試劑盒說明書測量幼魚體內(nèi)三酰甘油、總膽固醇和丙二醛濃度。④油紅O 染色與蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝內(nèi)脂質(zhì)積累情況及肝臟組織病理變化：連續(xù)干預1 周后，每組隨機選取10 條斑馬魚幼魚，用4%多聚甲醛固定斑馬魚幼魚，聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物（OCT）包埋，冰凍切片機上切片，用油紅O 和HE 染色，并在光學顯微鏡下觀察、拍照。⑤熒光攝影觀察肝臟活性氧染色情況：DCFH-DA 本身并沒有熒光，但可以被活性氧氧化成有熒光產(chǎn)物，因此，根據(jù)其熒光信號強弱分析組織內(nèi)活性氧水平。每組隨機選取10 條斑馬魚幼魚，按照說明書將DCFH-DA 用魚水配制成10 μM/L 液體，在培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3 次，用0.02%Tricane 麻醉液麻醉，在熒光顯微鏡下拍照，所有照片采用相同參數(shù)，全程在暗室中進行。⑥采用qPCR 法檢測脂質(zhì)代謝、氧化應激和炎癥相關(guān)基因信使核糖核酸（mRNA）表達情況：每組隨機選取30 條斑馬魚幼魚置入冰上預冷的1.5 mL EP 管中，用trizol 法提取斑馬魚幼魚總RNA，提取溶解，使用超微量分光光度計檢測RNA 濃度，之后在PCR 儀上用TAKARA 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成互補脫氧核糖核酸（cDNA）。qPCR 檢測基因相對表達量，反應程序為預變性（95 ℃，30 s）1 個循環(huán)，PCR 反應（95 ℃，5 s；60 ℃，30 s）40 個循環(huán)。各組基因相對表達差異以2-△△Ct值計算。目的基因和內(nèi)參基因的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 8.0.1 軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間兩兩比較采用One-Way ANOVA 檢驗，先進行Levene方差齊性檢驗，方差齊時采用最小顯著差異法t檢驗（LSD-t檢驗），方差不齊時采用Dunnett T3檢驗。采用Graphpad Prism 8.0.1 軟件制圖。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚存活率的影響 干預1 周后，高膽固醇飲食組的斑馬魚存活率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組的斑馬魚幼魚存活率與對照組、高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚存活率的影響（±s） 單位：%

表2 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚存活率的影響（±s） 單位：%

組別對照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組試驗次數(shù)33333存活率0.960±0.020 0.900±0.020 0.940±0.027 0.920±0.017 0.940±0.017

2.2 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體重的影響 干預1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚體重較對照組重（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚體重較高膽固醇飲食組輕（均P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表3。

表3 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體重的影響（±s） 單位：g/10 條

表3 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體重的影響（±s） 單位：g/10 條

組別對照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組組數(shù)88888體重0.003 5±0.000 6 0.004 6±0.000 1①0.003 4±0.000 1②0.003 3±0.000 1③0.002 6±0.000 4④

高膽固醇飲食組與對照組比較，①P＜0.05；與高膽固醇飲食組比較，②P＜0.05，③P＜0.01，④P＜0.001。

2.3 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體長的影響 干預1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚體長與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚體長與高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表4。

表4 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體長的影響（±s） 單位：mm

表4 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體長的影響（±s） 單位：mm

組別對照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)30 30 30 30 30體長4.930±0.100 5.070±0.062 4.701±0.195 5.041±0.274 4.679±0.228

2.4 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚三酰甘油的影響 干預1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚三酰甘油較對照組高（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚三酰甘油與高膽固醇飲食組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表5。

表5 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚三酰甘油的影響（±s） 單位：mmol/L

表5 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚三酰甘油的影響（±s） 單位：mmol/L

① 高膽固醇飲食組與對照組比較，P＜0.05。

組別對照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)50 50 50 50 50三酰甘油0.011±0.001 0.017±0.001①0.019±0.001 0.017±0.001 0.016±0.001

2.5 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚總膽固醇的影響 干預1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚總膽固醇較對照組高（P＜0.05）；沙棘醋飲組斑馬魚幼魚總膽固醇較高膽固醇飲食組低（P＜0.05）。見表6。度的影響 干預1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚丙二醛較對照組高（P＜0.001）；苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚丙二醛較高膽固醇飲食組低（P＜0.001）。見表7。

表6 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚總膽固醇的影響（±s） 單位：mmoI/L

表6 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚總膽固醇的影響（±s） 單位：mmoI/L

高膽固醇飲食組與對照組比較，① P＜0.05；與高膽固醇飲食組比較，② P＜0.01。

組別對照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)50 50 50 50 50總膽固醇0.037±0.002 0.063±0.002①0.056±0.002 0.053±0.003②0.063±0.003

表7 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚丙二醛濃度的影響（±s） 單位：nmol/mgprot

表7 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚丙二醛濃度的影響（±s） 單位：nmol/mgprot

高膽固醇飲食組與對照組比較，① P＜0.001；與高膽固醇飲食組比較，② P＜0.001。

組別對照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)50 50 50 50 50丙二醛0.756±0.189 3.475±0.708①3.185±0.401 2.588±0.224 1.315±0.195②

2.6 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚丙二醛濃

2.7 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色的影響 干預1 周后，對照組斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色呈淡紅色，邊界模糊；高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色呈紅色，邊界較清晰，肝細胞內(nèi)脂滴增多；苦蕎醋飲組斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色面積和數(shù)量與高膽固醇飲食組相比未見明顯減少；沙棘醋飲組和苦蕎醋飲組聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色面積和數(shù)量與高膽固醇飲食組相比略有減少，但差異不顯著。說明喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟脂質(zhì)積累改善不明顯。見圖1。

圖1 喂食醋飲的高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色圖

2.8 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟HE染色的影響 干預1 周后，對照組斑馬魚幼魚肝臟組織形態(tài)正常，排列緊密；高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚肝臟內(nèi)可見細胞間間隙較松散，出現(xiàn)大量空泡，脂肪變性占肝臟面積的60%以上，可診斷為發(fā)生MAFLD；喂食醋飲組斑馬魚幼魚肝臟內(nèi)仍可見細胞間間隙松散，較多空泡，說明喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟組織病理學改變不明顯。見圖2。

圖2 喂食醋飲的高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟HE 染色圖

2.9 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟活性氧（ROS）熒光染色的影響 干預1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚較對照組斑馬魚幼魚綠色熒光強度與面積增大；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組與高膽固醇飲食組相比，肝臟處綠色熒光面積較小，顏色較暗，見圖3。ROS 熒光定量分析顯示，苦蕎醋飲組和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組較高膽固醇飲食組低（P＜0.05）。見表8。

圖3 喂食醋飲的高膽固醇飲食斑馬魚幼魚熒光染色圖

表8 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚ROS熒光染色的影響（±s）

表8 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚ROS熒光染色的影響（±s）

與高膽固醇飲食組比較，① P＜0.01，② P＜0.05。

組別對照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)10 10 10 10 10 ROS 12.860±1.396 16.850±1.147 9.585±1.901①12.780±2.827 11.810±1.287②

2.10 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 表達的影響 干預1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚HMGCRa、CYP51 mRNA 表達水平較對照組低（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚HMGCRa、CYP51 mRNA 表達與高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；各組CEBPA mRNA 表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表9。

表9 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 表達的影響（±s）

表9 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 表達的影響（±s）

高膽固醇飲食組與對照組比較，① P＜0.05，② P＜0.001。

組別對照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)30 30 30 30 30 HMGCRa mRNA 1.000 0±0.480 1 0.789 9±0.119 6①1.185 0±0.007 1 0.735 6±0.082 0 1.123 0±0.007 1 CYP51 mRNA 1.000 0±0.232 8 0.254 7±0.033 6②0.165 9±0.032 3 0.196 5±0.017 6 0.173 2±0.054 1 CEBPA mRNA 1.000 0±0.180 9 2.110 0±0.864 1 1.490 0±0.283 2 2.110 0±0.864 1 0.994 4±0.048 7

2.11 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚氧化應激和炎癥相關(guān)基因mRNA 表達的影響 干預1 周后，各組Keap1、Nrf2 mRNA 表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚TNF-α、IL-1β mRNA 表達水平較對照組高（均P＜0.05）；沙棘醋飲組斑馬魚幼魚TNF-α mRNA 表達水平較高膽固醇飲食組低（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚IL-1β mRNA 表達水平較高膽固醇飲食組低（均P＜0.05）。見表10。

表10 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚氧化應激和炎癥相關(guān)基因mRNA 表達的影響（±s）

表10 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚氧化應激和炎癥相關(guān)基因mRNA 表達的影響（±s）

高膽固醇飲食組與對照組比較，① P＜0.05，② P＜0.001；與高膽固醇飲食組比較，③ P＜0.05，④ P＜0.001。

組別對照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)30 30 30 30 30 Keap1 mRNA 1.000±0.220 0.779±0.105 1.249±0.190 0.912±0.138 1.077±0.494 Nrf2 mRNA 1.000±0.480 0.601±0.338 0.764±0.588 0.736±0.082 0.563±0.785 TNF-α mRNA 1.000±0.063 1.907±0.420①1.562±0.023 1.092±0.155③1.839±0.246 IL-1β mRNA 1.000±0.232 10.110±0.841②0.661±0.074④0.916±0.040④1.017±0.124④

3 討論

MAFLD 被認為是全球性的公共衛(wèi)生問題[7]。尋找有效的防控措施，對積極應對MAFLD 意義重大。脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應激和炎癥是MAFLD 發(fā)生的重要原因。近年流行病學研究顯示，日常食物及食物中的功能成分可以有效應用于疾病治療和預防[8]。醋在改善MAFLD 方面具有一定作用，已有學者對發(fā)酵醋飲進行研究，發(fā)現(xiàn)其有很好的降脂[9]、抗氧化[10]等特性，能夠緩解脂肪性肝病。沙棘具有抗氧化、護肝等藥理活性，可能歸因于其高含量的多酚化合物，主要是黃酮類化合物[11]，目前已成為新功能食品的合適候選者[12]?？嗍w為藥食同源類糧食作物，起源于我國西南部地區(qū)，屬蓼科，富含黃酮類化合物，主要為蘆丁[13]，具有降血脂、降血糖、保護心血管等功效[14]。鑒于沙棘、苦蕎對人體健康有諸多益處，含豐富的生物活性物質(zhì)，本研究將沙棘醋飲、苦蕎醋飲納入研究，是在傳統(tǒng)老陳醋釀造的配料基礎(chǔ)上，將富含黃酮類化合物的藥食同源食物沙棘、苦蕎分別與老陳醋原料結(jié)合，經(jīng)過多次發(fā)酵、多菌共酵、后酵處理等工藝加工而成的藥食同源醋飲產(chǎn)品，既保持了原釀，還提高了其中生物活性物質(zhì)含量。

3.1 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚一般情況的影響 本研究結(jié)果顯示，干預1 周后，苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組的斑馬魚幼魚存活率與對照組、高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。對斑馬魚幼魚的體長進行測量，結(jié)果顯示，各組間斑馬魚幼魚體長比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），與Ma 等[15]研究結(jié)果一致。提示體長可能不能作為高膽固醇飲食誘導斑馬魚MAFLD 相關(guān)實驗的敏感指標。但斑馬魚幼魚體重測量結(jié)果顯示，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚體重較對照組重（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚體重較高膽固醇飲食組輕（均P＜0.05），說明喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚具有減重作用。

3.2 喂食醋飲對高膽固醇飲食斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝的影響 脂質(zhì)積累是MAFLD 的基本病理特征，三酰甘油、總膽固醇是脂質(zhì)代謝的主要生化指標。本研究對斑馬魚幼魚三酰甘油、總膽固醇含量進行測量，結(jié)果顯示，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚三酰甘油、總膽固醇均高于對照組，在5%高膽固醇飲食誘導下，醋飲干預組斑馬魚幼魚三酰甘油與高膽固醇飲食組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），提示本研究中的喂食醋飲劑量無法達到降低三酰甘油水平的效果。但沙棘醋飲組斑馬魚幼魚總膽固醇較高膽固醇飲食組低（P＜0.05），可能與沙棘醋飲中富含豐富的有機酸有關(guān)。此外，斑馬魚幼魚冰凍切片油紅O 染色與HE 染色結(jié)果顯示，喂食醋飲對斑馬魚幼魚肝臟脂質(zhì)積累與肝臟組織病理學改變改善效果不明顯。

為進一步觀察喂食醋飲對斑馬魚幼魚肝臟脂質(zhì)積累的影響，對斑馬魚幼魚進行q-PCR 實驗，檢測喂食醋飲對斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)的mRNA 表達變化的影響，以期揭示喂食醋飲對斑馬魚幼魚MAFLD 脂質(zhì)代謝的潛在機制，結(jié)果顯示，高膽固醇飲食組HMGCRa mRNA 表達較對照組下降（P＜0.05），可能是斑馬魚幼魚攝入過多外源性的高膽固醇飲食后反而抑制了肝內(nèi)內(nèi)源性膽固醇的合成。與戴文聰[16]采用高脂高膽固醇飲食喂食斑馬魚幼魚顯示HMGCRa 顯著下降結(jié)果一致。但本研究中，苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚HMGCRa mRNA 表達與高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），提示喂食醋飲后斑馬魚幼魚體內(nèi)的膽固醇未能被小腸很好地吸收，因此HMGCRa mRNA 表達未見明顯下調(diào)。這種反饋性的調(diào)節(jié)機制還體現(xiàn)在對參與膽固醇生物合成的CYP51 調(diào)節(jié)方面，也有相關(guān)研究報道，肝細胞可以感知膽固醇水平的降低并上調(diào)CYP51以補償這種變化[17]。本研究結(jié)果顯示，高膽固醇飲食組CYP51 mRNA 表達較對照組下降，可能是由于大量外源性膽固醇攝入抑制了膽固醇合成相關(guān)酶的活性，抑制了CYP51 基因表達。此外，本研究結(jié)果還顯示，醋飲組CYP51 mRNA 表達較高膽固醇飲食組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與脂肪細胞分化相關(guān)的基因CEBPA mRNA表達在各組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。已有研究顯示，菠蘿醋[18]、椰子水醋[19]、蘋果醋[20]等發(fā)酵醋飲可以降低體重，提示醋飲可能通過參與其他基因表達調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝。因此，醋飲對MAFLD 斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝的影響有待進一步研究。

3.3 喂食醋飲對斑馬魚幼魚氧化應激、炎癥的影響

氧化應激在MAFLD 中起著至關(guān)重要的作用。MAFLD 病人的抗氧化系統(tǒng)受損，表現(xiàn)為脂質(zhì)過度積累導致脂質(zhì)過氧化，釋放ROS，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和氧化應激標志物水平升高。ROS 是機體應激時產(chǎn)生的一種高活性分子，產(chǎn)生過多會導致體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡。丙二醛含量通常反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本研究結(jié)果顯示，苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚丙二醛較高膽固醇飲食組低（P＜0.05），提示喂食苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲可以提高體內(nèi)抗氧化反應水平，改善高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟氧化損傷，保護肝臟。原因可能為沙棘和苦蕎含豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物具有抗氧化應激活性[21]。

肝臟發(fā)生脂肪變性后會誘發(fā)MAFLD 的“二次打擊”，誘導脂肪細胞釋放趨化因子，導致巨噬細胞浸潤，提高促炎細胞因子水平，包括TNF-α 和IL-1β，使肝臟發(fā)生炎癥，進一步加劇對肝臟的損傷，使非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 進展為肝硬化，最終發(fā)展為肝癌[22]。Keap1 與Nrf2 是氧化應激通路中較重要的調(diào)節(jié)因子。TNF-α 可啟動炎癥細胞，進而對肝細胞發(fā)起攻擊，TNF-α 水平高低與脂肪肝嚴重程度呈正相關(guān)。IL-1β也是與炎癥相關(guān)的因子。本研究進一步在分子水平對以上基因的mRNA 表達量進行檢測，沙棘醋飲組斑馬魚幼魚TNF-α mRNA 表達水平較高膽固醇飲食組低（P＜0.05），苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚IL-1β mRNA 表達水平較高膽固醇飲食組低（均P＜0.05）。說明喂食醋飲有利于下調(diào)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚炎癥相關(guān)基因的表達，可以對肝臟起到一定的保護作用。與人參醋研究結(jié)果[23]一致，人參醋在預防實驗中抑制了促炎因子的表達，且研究結(jié)果顯示，與乙酸處理相比，人參醋處理對TNF-α和IL-6 水平的影響更明顯，說明促炎細胞因子不受乙酸處理影響，本研究中醋飲發(fā)揮的抗炎效果可能與醋飲中所含的生物活性物質(zhì)有關(guān)，苦蕎醋飲和沙棘醋飲中均富含黃酮類化合物。

4 小結(jié)

研究苦蕎醋飲、沙棘醋飲在MAFLD 斑馬魚幼魚中的作用有利于指導臨床護理人員對MAFLD 病人實施科學的飲食護理，幫助臨床護理人員適當進行醋飲干預，改善MAFLD 病人肝臟損傷。喂食醋飲對MAFLD 斑馬魚幼魚的基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，喂食醋飲有利于降低高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體重，苦蕎醋飲和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲有利于降低肝臟活性氧水平，苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲有利于改善脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛對肝臟的損傷，沙棘醋飲有利于降低膽固醇水平，喂食醋飲有利于抑制高膽固醇飲食斑馬魚幼魚炎癥，提示喂食醋飲可能主要通過減輕氧化應激、抑制炎癥反應發(fā)揮對MAFLD 斑馬魚幼魚的保護作用，其對脂質(zhì)代謝的影響有待進一步研究。