延齡草總皂苷對(duì)D-gal誘導(dǎo)的衰老大鼠認(rèn)知功能及線(xiàn)粒體自噬的影響

王 剛，謝 雅，楊麗君，覃曉莉，趙方毓，，向家鵬，何一多，陳顯兵，

(1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000)

根據(jù)第七次全國(guó)人口普查結(jié)果顯示，截止2020年我國(guó)65歲及以上人口約有1.9億人，占總?cè)丝诘?3.5%，與第六次普查相比上升了4.63%，現(xiàn)已成為世界上老齡化速度最快的國(guó)家之一[1]。研究顯示，在人體衰老的進(jìn)程中，大腦是最先衰老的器官之一，腦衰老可誘發(fā)阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病等多種神經(jīng)退行性疾病，給老年人的健康帶來(lái)嚴(yán)重影響。

線(xiàn)粒體自噬是一種選擇性的自噬，可特異性的清除功能失調(diào)或受損的線(xiàn)粒體，是維持線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)及功能的重要途徑[2]。在衰老的進(jìn)程中，存在大量錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)及功能老化的線(xiàn)粒體，且隨著年齡的增加，線(xiàn)粒體自噬的水平逐漸減弱，對(duì)受損細(xì)胞器和蛋白的降解能力降低，同時(shí)自噬水平的減弱也加速衰老的進(jìn)程[3]。腦衰老會(huì)引起多種機(jī)體功能障礙，其中以學(xué)習(xí)記憶功能減退最為突出。研究顯示PTEN誘導(dǎo)假定激酶1(Pink1)/E3泛素-連接酶活性帕金森病蛋白2(Parkin)介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬與學(xué)習(xí)記憶能力有著密切的關(guān)系，且Pink1、Parkin基因的突變可誘發(fā)線(xiàn)粒體自噬異常，使受損線(xiàn)粒體聚集增多從而引起神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞損傷以及神經(jīng)軸突退化變性，這也是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要致病機(jī)制之一[4]。此外Pink1/Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬在異常線(xiàn)粒體清除，緩解突觸消失和認(rèn)知損害方面也發(fā)揮著重要的作用。

延齡草(Trilliumtschonoskiimaxim，TTM)為湖北省恩施州土家族地區(qū)珍貴藥材，味甘、性平，有小毒，其活性成分皂苷類(lèi)具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、改善心功能及抗衰老等作用[5-6]。前期研究顯示，TST具有延緩衰老、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等功效[7-8]，但作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過(guò)給大鼠注射D-gal誘導(dǎo)衰老模型，探究延齡草總皂苷(total saponins fromTrilliumtschonoskiimaxim，TST)對(duì)D-gal誘導(dǎo)的衰老大鼠認(rèn)知功能及線(xiàn)粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響，深入探討其作用機(jī)制，為延齡草總皂苷延緩衰老尤其是延緩腦部衰老作用提供現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選取SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量達(dá)(220±20) g，購(gòu)自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK (鄂)2015-0018。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼養(yǎng)溫度保持在22 ℃～26 ℃、相對(duì)濕度保持在50%～55%之間，12 h自然交替給予照明，自由進(jìn)食飲水。本次實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑藥材采自恩施州，由湖北民族大學(xué)中藥實(shí)驗(yàn)室殷智教授鑒定為延齡草植物的干燥根莖(TTM)。TST由該校中藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心自制，除去藥材非藥用部位及泥土雜質(zhì)后，經(jīng)60 ℃恒溫箱干燥后進(jìn)行粉碎處理，將藥材粉末置于圓底燒瓶后加入適量75%乙醇浸泡萃取，將提取后的藥液過(guò)濾并濃縮干燥，得TST總提取物。加入雙蒸水，將總提取物完全溶解，采用飽和正丁醇再次萃取，減壓濃縮干燥，得到含量為61.48%TST。通過(guò)TST對(duì)照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定得總皂苷含量為14.72 mg·g-1生藥。

D-gal(批號(hào)：G5388)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司，Anti-rabbit IgG(批號(hào)：7074S)購(gòu)自CST 公司，Parkin(批號(hào)：bs-1865R)購(gòu)自博奧森生物公司，尼氏(Nissl)染液(批號(hào)：C0117)、β-actin(批號(hào)：0831171710)、PINK1(批號(hào)：AF7755)、LC3(批號(hào)：AF5225)、p62(批號(hào)：AF5312)及Beclin1(批號(hào)：AF5123)購(gòu)自碧云天生物公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自邁新生物公司。

1.3 儀器酶標(biāo)儀(1510型)購(gòu)自Thermo Scientific公司；Morris水迷宮系統(tǒng)(DMS-2型)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；Western印跡全套設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；熒光顯微鏡(Eclipse80i)購(gòu)自日本Nikon公司；-80 ℃冰箱購(gòu)自SANYO公司；全自動(dòng)曝光成像系統(tǒng)(Tanon-5200)購(gòu)自上海天能科技公司。

1.4 動(dòng)物分組、造模及干預(yù)方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為5組：正常對(duì)照組(Normal control)、模型組(D-gal model)、TST低、中、高(TST50、100、200 mg·kg-1)劑量組，每組10只。模型組及TST各劑量組的大鼠經(jīng)頸背部皮下注射D-半乳糖(D-gal，100 mg·kg-1，注射容積為10 mL·kg-1·d-1)構(gòu)建大鼠腦衰老模型，Normal control注射等量生量鹽水，連續(xù)注射6周。TST各劑量組每日分別給予50、100、200 mg·kg-1的TST進(jìn)行灌胃干預(yù)，Normal control和D-gal model每日給予等體積的雙蒸水灌胃，連續(xù)灌胃6周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1Morris水迷宮 水迷宮實(shí)驗(yàn)在封閉隔音、無(wú)光環(huán)境中進(jìn)行，于造模d 36～40行定位航行實(shí)驗(yàn)：系統(tǒng)自動(dòng)將圓形水池分為四個(gè)象限，在第三象限放置一個(gè)略低于水面0.6～1 cm的圓形逃生平臺(tái)，設(shè)定好水中游泳最長(zhǎng)時(shí)間為60 s，每組7只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大鼠面向池壁分別沿1、2、4象限邊緣緩慢放下，此時(shí)系統(tǒng)記錄大鼠游泳軌跡和上平臺(tái)時(shí)間，在大鼠掉入水后由于求生本能會(huì)尋找逃離水的方法，若在60 s內(nèi)沒(méi)有找到逃生平臺(tái)則需人為引導(dǎo)站在臺(tái)上并停留15 s使其形成記憶，記錄并分析大鼠在d5的平臺(tái)潛伏期；水迷宮實(shí)驗(yàn)的d 6休息，d 7行空間探索實(shí)驗(yàn)：將求生平臺(tái)撤去，大鼠沿第一象限邊緣放入，記錄60 s內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)、第一次上平臺(tái)及在目標(biāo)象限停留時(shí)間，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.2組織灌注和取材 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。每組隨機(jī)選取7只大鼠，斷頭取海馬組織并儲(chǔ)存至-80 ℃冰箱；剩余3只大鼠麻醉后將其固定，用有齒鑷夾持胸骨劍突，剪刀垂直打開(kāi)胸腔，從心尖稍左側(cè)位置插入穿刺針至升主動(dòng)脈處，剪開(kāi)右心耳。先快速灌注溫生理鹽水直至血液流凈，再換4%多聚甲醛溶液灌注固定，脫水后石蠟包埋切片備用。

1.5.3HE、Nissl染色 各組大鼠腦組織切片常規(guī)脫蠟后，蘇木精染色5～10 min，雙蒸水洗滌，0.5%鹽酸乙醇分化5～10 s，雙蒸水沖洗，0.2%氨水反藍(lán)40 s，雙蒸水沖洗，伊紅染色5 min后用雙蒸水速洗，再行脫水、透明、封固；標(biāo)本切片脫蠟后，放入尼氏染液中染色15 min，雙蒸水洗滌數(shù)秒后進(jìn)行脫水、透明、封固等步驟完成尼氏染色，最后掃描切片。

1.5.4免疫組化檢測(cè) 取制備的腦組織蠟塊樣本，4 μm切片，70 ℃烤片過(guò)夜，二甲苯梯度脫蠟3次，梯度乙醇水化。高壓鍋抗原修復(fù)5 min，待切片冷卻至常溫后再用PBS漂洗3次，每次3 min，甩干后滴加3%H2O2以清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS漂洗3次甩干，滴加5%BSA封閉液，濕盒靜置30 min，甩去封閉液，滴加一抗Pink1和Parkin，4 ℃孵育過(guò)夜。次日室溫環(huán)境中復(fù)溫30 min，PBS漂洗3次甩干，滴加生物標(biāo)記山羊抗兔IgG靜置1 h。PBS漂洗3次甩干，滴加DAB顯色液避光靜置10 min，此時(shí)可以鏡下觀(guān)察著色程度。純水洗滌數(shù)秒后蘇木精復(fù)染1 min，1%鹽酸酒精分化1 min，反藍(lán)30 s，無(wú)水乙醇2 min，二甲苯透明2 min，中性樹(shù)膠封固、切片掃描。

1.5.5海馬組織蛋白的提取及Western blot檢測(cè) 從-80 ℃低溫冰箱中取出適量海馬組織，按照1 mg組織加入9 μL裂解液、0.09 μL蛋白酶抑制劑的比例進(jìn)行組織勻漿、超聲，勻漿液低溫高速離心(4 ℃，12 000 r·min-1，15 min)后取上清液，用BCA試劑盒測(cè)組織蛋白濃度并進(jìn)行配平。

制備SDS-PAGE凝膠(12%分離膠，5%濃縮膠)，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、4 ℃孵育一抗Pink1(1 ∶1 000)、Parkin(1 ∶2 000)、p62(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶1 000)、Beclin1(1 ∶1 000)過(guò)夜。次日洗膜、二抗孵育1 h、洗膜，最后采用化學(xué)發(fā)光法在成像系統(tǒng)下顯影并記錄其灰度值。以目標(biāo)蛋白/內(nèi)參蛋白(β-actin)的灰度值比值進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 TST對(duì)衰老大鼠學(xué)習(xí)能力的影響與正常對(duì)照組比較，D-gal模型組大鼠游泳軌跡雜亂，逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)，第1次抵達(dá)求生平臺(tái)時(shí)間明顯增加(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，停留在目標(biāo)象限時(shí)間縮短(P<0.05)。與D-gal模型組比較，TST各劑量組大鼠表現(xiàn)出一定的目標(biāo)趨向性，逃避潛伏期明顯縮短，第1次抵達(dá)求生平臺(tái)時(shí)間明顯減少(P<0.05)，穿越求生平臺(tái)次數(shù)增加，停留在目標(biāo)象限的時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)(Fig 1，2，Tab 1)。

Tab 1 Results in spatial probe test of each

2.2 TST對(duì)衰老大鼠腦組織結(jié)構(gòu)的影響如Fig 3所示，正常對(duì)照組海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)著色較深，神經(jīng)元數(shù)目較多、排列整齊，胞漿豐富、胞核清晰飽滿(mǎn)；D-gal模型組海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)著色較淺，神經(jīng)元稀疏、排列紊亂，細(xì)胞核丟失，可見(jiàn)細(xì)胞腫脹空泡化，其海馬組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量明顯少于正常組；TST各劑量組海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)著色較D-gal模型組深，細(xì)胞損傷性改變減輕，海馬組織內(nèi)神經(jīng)元尼氏小體的數(shù)量明顯多于模型組，且排列相對(duì)整齊，胞體之間的間隔較小(Fig 3)。

Fig 1 Results in place navigation test of each groupA：Swimming track in each group;B：The relative change of time of escape latency in each group.1：Normal control；2：D-gal model；3：D-gal+TST 50 mg·kg-1；4：D-gal+TST 100 mg·kg-1；5：D-gal+TST 200 mg·kg-1.#P<0.05 vs normal control，*P<0.05 vs D-gal model.

Fig 2 Results in spatial probe test of each groupA：The relative change of target-zone frequency in each group;B：The relative change of target-zone duration.1：Normal control；2：D-gal model；3：D-gal+TST 50 mg·kg-1；4：D-gal+TST 100 mg·kg-1；5：D-gal+TST 200 mg·kg-1.#P<0.05 vs normal control，*P<0.05 vs D-gal model.

2.3 TST對(duì)衰老大鼠海馬組織Pink1、Parkin表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，D-gal模型組海馬CA1、CA3、DG區(qū)Pink1、Parkin的陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，著色較淡；與D-gal模型組相比，TST中、高劑量組Pink1、Parkin在海馬CA1、CA3、DG區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，著色加深；低劑量組Pink1在CA1、CA3區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，DG區(qū)無(wú)明顯差別，低劑量組Parkin在CA1區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞增加，CA3區(qū)無(wú)明顯差別、DG區(qū)減少(Fig 4A)；Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，D-gal模型組海馬Pink1、Parkin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，與D-gal模型組相比，TST各劑量組海馬Pink1、Parkin蛋白表達(dá)增加(P<0.05)(Fig 4B)。

2.4 TST對(duì)衰老大鼠海馬組織LC3-Ⅱ、Beclin1、p62表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，D-gal模型組海馬LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，分別是正常組的0.49倍、0.77倍。p62的表達(dá)明顯上升，是正常對(duì)照組的1.98倍(P<0.05)，提示大腦海馬組織自噬活性降低，且海馬組織損傷嚴(yán)重；與D-gal模型組相比，TST低、中、高劑量組海馬LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.05)，分別是D-gal模型組的1.74倍、2.09倍、2.58倍。Beclin1蛋白的表達(dá)量明顯上升(P<0.05)，分別是D-gal模型組的1.77倍、1.62倍、1.69倍。p62蛋白的表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，分別是D-gal模型組的1.17倍、0.59倍、0.63倍，說(shuō)明TST可以激活自噬，減輕海馬組織損傷(Fig 5)。

3 討論

在腦衰老進(jìn)程中主要有反應(yīng)遲緩、感覺(jué)遲鈍、記憶力下降等癥狀，其中學(xué)習(xí)記憶障礙為衡量腦衰老模型的重要指標(biāo)[9]。研究表明[10]過(guò)量注射D-gal可誘導(dǎo)大量氧自由基的產(chǎn)生與累積，降低抗氧化酶活性，加速脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)，損傷組織細(xì)胞，引起動(dòng)物衰老。本研究通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠注射D-gal后逃避潛伏期時(shí)間增加，穿越平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間減少，均說(shuō)明大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，而不同劑量TST干預(yù)可改善D-gal所致的模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，表明TST具有改善衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。

研究顯示[10]，神經(jīng)元衰老后，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，而線(xiàn)粒體自噬是清除這類(lèi)物質(zhì)的主要途徑之一。Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Pink1/Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬激活時(shí)，腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡受到抑制，延緩腦部的衰老。Du等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Pink1/Parkin的蛋白表達(dá)，導(dǎo)致線(xiàn)粒體自噬水平下降，從而加重了AD大鼠認(rèn)知功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量注射D-gal可引起衰老模型大鼠神經(jīng)元受損和Pink1、Parkin的表達(dá)降低，通過(guò)TST干預(yù)后上調(diào)了海馬組織內(nèi)Pink1和Parkin的表達(dá)，從而提高了對(duì)衰老大鼠海馬中受損線(xiàn)粒體的清除水平，因而表明TST改善衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙可能與上調(diào)Pink1/Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬有關(guān)。

Fig 3 Morphology of hippocampus and cortex in each group by hematoxylin-eosin staining and Nissl staining HE staining(Ai 40×，Aii 400×)；Nissl staining(Ai 40×，Aii 400×).

Fig 4 Expression of Pink1，Parkin in hippocampus of each A.Immunohistochemistry staining；B.Relative expression of Pink 1 and Parkin.#P<0.05 vs normal control，*P<0.05 vs D-gal model.

LC3、p62、Beclin1對(duì)于調(diào)控自噬起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3會(huì)被酯化成LC3-Ⅱ，此時(shí)位于損傷線(xiàn)粒體外膜上的Pink1蛋白維持其激酶活性，同時(shí)招募Parkin蛋白并使其磷酸化，從而將受損的線(xiàn)粒體分離出來(lái)；活化后的Parkin蛋白繼而招募泛素結(jié)合因子p62，并與LC3-Ⅱ結(jié)合形成自噬小體并包裹受損的線(xiàn)粒體片段，隨后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體從而將線(xiàn)粒體片段降解[13-14]。LC3-Ⅱ可評(píng)估自噬體的穩(wěn)定狀態(tài)；p62可作為溶酶體降解活性的標(biāo)志；Beclin1與自噬的活性呈正相關(guān)，也是自噬過(guò)程中最重要的調(diào)節(jié)因子。在本實(shí)驗(yàn)的研究中，對(duì)比正常組，D-gal模型組海馬組織中p62蛋白的表達(dá)量有所上調(diào)，Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量下調(diào)；對(duì)比D-gal模型組，在各劑量TST干預(yù)后，大鼠海馬組織中p62的表達(dá)量下調(diào)，Beclin1、LC3-Ⅱ的表達(dá)量有所上調(diào)，說(shuō)明TST能夠在一定程度上激活線(xiàn)粒體自噬，以延緩衰老。

綜上所述，TST干預(yù)能夠改善D-gal誘導(dǎo)的衰老大鼠認(rèn)知功能障礙，并上調(diào)海馬組織中Pink1和Parkin的表達(dá)，激活線(xiàn)粒體自噬，減輕神經(jīng)元損傷，從而發(fā)揮抗衰老作用。

Fig 5 Expressions of LC3-Ⅱ，p62 and Beclin1 in hippocampus of each