補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)控自噬抗大鼠腦缺血/再灌注損傷的作用

單玉棟，趙艷萌，靳曉飛，周曉紅，葉佳蓓，馬秀娟，田 甜，蔡國(guó)英，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091)

腦卒中是人類(lèi)第二大死亡原因，也是導(dǎo)致殘疾的主要原因，給家庭與社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，缺血性腦卒中是其最常見(jiàn)的類(lèi)型之一[1]。因此，更有效的防治缺血性腦卒中是迫切需要解決的重要問(wèn)題。由動(dòng)脈閉塞引起的缺血性卒中，通過(guò)靜脈溶栓和血管內(nèi)血栓清除術(shù)進(jìn)行快速再灌注是治療的重點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為，缺血性腦卒中屬于“中風(fēng)”范疇，氣虛血瘀是其根本病因，補(bǔ)氣活血化瘀是治療要義。在治療上與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有異曲同工之妙。

中醫(yī)藥是治療腦卒中的重要療法之一，補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療缺血性腦卒中和卒中致殘的經(jīng)典方劑，已經(jīng)有數(shù)百年的歷史。補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自清·王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，方名寓含治法，是補(bǔ)氣活血的代表方劑之一。從中醫(yī)的觀點(diǎn)來(lái)看，該湯用于改善經(jīng)絡(luò)氣血，促進(jìn)血液循環(huán)，廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中的臨床防治。已有文獻(xiàn)[2]及本課題組前期研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)調(diào)節(jié)自噬減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷，但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。

研究表明PI3K/AKT通路對(duì)腦缺血/再灌注后的細(xì)胞存活至關(guān)重要[3]。因此，本研究將通過(guò)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注(middle cerebral artery occulusion/ reperfusion,MCAO/R)模型為研究對(duì)象，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯是否通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)控自噬起到神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂，體質(zhì)量(220～250)g，SPF級(jí)，SD大鼠50只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：DWLL2020075)，所有操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。

1.2 主要試劑與耗材PI3K通路抑制劑LY294002(HY-10108)購(gòu)自MCE公司；p62抗體(18420-1-AP)購(gòu)自Proteintech公司；β-actin抗體(23660-1-AP)購(gòu)自Proteintech公司；SDS-PAGE試劑盒、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(A0516)、抗熒光淬滅封片液含DAPI(P0131)購(gòu)自beyotime公司；LC3B抗體(L7543)購(gòu)自SIGMA公司；LC3B抗體(ZRB100)購(gòu)自SIGMA公司；PI3K抗體(4249S)、AKT抗體(4691S)、p-AKT抗體(4060S)購(gòu)自CST公司；蘇木精染液(G1004-100ML)、伊紅染液(G1001-100ML)、TTC(G1017)購(gòu)自servicebio公司；MCAO線栓(2636-A3)購(gòu)自北京西濃公司；黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，地龍3 g，川芎3 g，赤芍5 g，桃仁3 g，紅花3 g，購(gòu)自北京同仁堂有限公司后本課題組進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)，檢測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯中黃芪甲苷含量為0.133 mg·g-1生藥、毛蕊異黃酮苷含量為0.139 mg·g-1生藥、芍藥苷含量為0.492 mg·g-1生藥、阿魏酸含量為0.04 mg·g-1生藥并做成凍干粉。

1.3 主要儀器51700全自動(dòng)腦立體定位儀(Stoelting公司)；EG11508組織包埋機(jī)(Leica公司)；RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica公司)；DM5000B光學(xué)顯微鏡(Leica公司)；THUNDER免疫熒光顯微鏡(Leica公司)；Fusion FX5 Spectra成像系統(tǒng)(Vilber公司)；Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀(Thermofisher公司)，恒壓電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、動(dòng)物模型制備及腦室內(nèi)注射隨機(jī)將50只SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham)10只、模型組(Model)10只、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組(BYHWD)10只、PI3K抑制劑組(LY294002)10只與溶媒劑組(Vehicle)10只。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠造模完成后，應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯凍干粉3.02 g·kg-1·d-1灌胃處理。大鼠MCAO/R模型制備參照本課題組前期基礎(chǔ)[4-5]，1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉，在頸前橫過(guò)矢狀面做中線切口，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端。4-0單絲尼龍線結(jié)扎頸外動(dòng)脈近端，并將多聚賴氨酸包被的線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈送入大腦中動(dòng)脈，MCAO 2 h后撤回線栓并結(jié)扎端口。72 h后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。手術(shù)全過(guò)程使用加熱墊，使大鼠保持37 ℃肛溫。

LY294002溶于DMSO后加入Tween-80助溶，后用生理鹽水稀釋到20 μmol·L-1，MCAO造模前30 min取5 μL進(jìn)行腦立體定位注射[6]。在顱骨鉆孔，將10 μL Hamilton注射器的針頭經(jīng)顱骨鉆孔插入左側(cè)腦室。定位注射參數(shù)[7]：以前囟為坐標(biāo)零點(diǎn)定位，AP為0.8 mm；ML為1.4 mm；DV為3.6 mm，1 μL·min-1注射完畢后留針15 min拔針，消毒縫合。

2.2 大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分采用盲法對(duì)各組大鼠進(jìn)行Zea longa[8]評(píng)分：無(wú)神經(jīng)功能損傷0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)爪1分；向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈2分；向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒3分；意識(shí)喪失4分。選擇1～3分大鼠入組。

2.3 腦梗死體積測(cè)定斷頭取腦，-20 ℃中冷凍30 min，切成冠狀面切片，厚度2 mm。放入小培養(yǎng)皿中，37 ℃ 0.5% TTC避光孵育20 min，中途翻面1次，吸出多余的TTC，放入4%多聚甲醛中固定24 h后拍照。梗死體積/%=(正常側(cè)半腦面積-梗死側(cè)正常面積)/2×正常側(cè)半腦面積×100%[9]。

2.4 HE染色觀察腦組織病理?yè)p傷大鼠麻醉后，心臟灌流快速取腦。4 ℃中性甲醛固定48 h，石蠟包埋，行冠狀切片，厚5 μm。進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下拍照，觀察腦組織IP神經(jīng)細(xì)胞的損傷情況。

2.5 免疫熒光檢測(cè)LC3B表達(dá)石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、雙氧水封閉。免疫染色封閉液封閉15 min，LC3抗體(1 ∶200)4 ℃過(guò)夜。Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(1 ∶500)37 ℃避光孵育1 h，封片液封片。Leica熒光顯微鏡拍攝圖片并分析熒光強(qiáng)度。

2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白提取大鼠缺血側(cè)半暗帶蛋白，測(cè)定組織蛋白濃度。將蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉，將膜與一抗LC3(1 ∶1 000)、p62(1 ∶2 000)、PI3K(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶2 000)、AKT(1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1 ∶20 000)37 ℃孵育1 h，混合ECL A/B液，置于多功能成像系統(tǒng)中顯影，用軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)神經(jīng)功能缺損的影響與Sham組比較，大鼠MCAO/R后，Model組神經(jīng)功能缺損明顯(P<0.01)；與Model組比較，BYHWD組神經(jīng)功能缺損明顯改善(P<0.05)；BYHWD改善神經(jīng)功能缺損的作用被LY294002降低(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)Fig 1。

3.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦梗死體積的影響與Sham組比較，大鼠MCAO/R后，Model組腦梗死體積明顯增加(P<0.05)；與Model組比較，BYHWD組腦梗死體積明顯縮小(P<0.05)；BYHWD降低腦梗死體積的作用被LY294002所減弱(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)Fig 2。

Fig 1 Neurological scores of each 1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.##P<0.01 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

3.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦組織缺血半暗帶病理?yè)p傷的影響Sham組大鼠腦組織IP形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)致密，核仁清晰；Model組腦組織IP空泡化嚴(yán)重，大量神經(jīng)元丟失和死亡，部分核溶解和凝聚；與Model組比較，BYHWD組大鼠腦組織IP損傷情況明顯緩解；BYHWD改善大鼠腦組織IP病理?yè)p傷的作用被LY294002所抑制；BYHWD組與Vehicle組比較無(wú)差異，F(xiàn)ig 3。

3.4 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠腦組織LC3B免疫熒光表達(dá)的影響大鼠MCAO/R后，與Sham組比較，Model組大鼠腦組織LC3B熒光表達(dá)升高(P<0.05)；與Model組比較，BYHWD組大鼠腦組織LC3B熒光表達(dá)降低(P<0.05)；BYHWD降低大鼠腦組織LC3B熒光強(qiáng)度的作用被LY294002所減弱(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)Fig 4。

Fig 2 Representative pictures of TTC staining and relevant quantitative 1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative pictures of brain sections stained with TTC;B:Percentage of volume.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

Fig 3 HE staining of brain tissues in each group of rats(Scale=50 μm)Representative images of HE staining in the rat cerebral ischemic penumbra.A:Sham;B:Model;C:BYHWD;D:BYHWD+LY294002;E:BYHWD+Vehicle.

3.5 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)各組PI3K，p-AKT，AKT蛋白表達(dá)的影響大鼠MCAO/R后，相對(duì)于Sham組，Model組通路蛋白PI3K與p-AKT/AKT表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與Model組比較，BYHWD組通路蛋白PI3K與p-AKT/AKT表達(dá)明顯升高(P<0.05)；BYHWD的調(diào)控作用被LY294002所抑制(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)Fig 5。

3.6 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)各組自噬標(biāo)志蛋白LC3、p62的影響Sham組比較，Model組LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)升高，p62表達(dá)降低(P<0.05)；與Model組比較BYHWD組LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)降低，p62表達(dá)升高(P<0.05)；BYHWD降低LC3Ⅱ/Ⅰ與升高p62表達(dá)的作用被LY294002所減弱(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)Fig 6。

4 討論

缺血性腦卒中是臨床常見(jiàn)病，當(dāng)大腦某個(gè)區(qū)域的血液供應(yīng)因栓塞或血栓而突然中斷，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙甚至腦細(xì)胞死亡時(shí)，就會(huì)發(fā)生缺血性腦卒中。缺血性腦卒中患者最初的臨床缺陷很大程度上是由大腦中低灌流、生物電異常的缺血性半暗帶所致[10]。隨著時(shí)間的推移，這一區(qū)域逐漸轉(zhuǎn)化為不可逆轉(zhuǎn)的損傷組織即缺血核心區(qū)。因此，梗死組織半暗帶恢復(fù)再通是治療首選，但腦缺血/再灌注會(huì)引發(fā)一系列生化和細(xì)胞損傷。

細(xì)胞自噬是腦缺血/再灌注后細(xì)胞死亡的重要途徑之一。自噬是一種自我保護(hù)的細(xì)胞分解代謝途徑，通過(guò)該途徑，不需要的蛋白質(zhì)被降解成代謝元素，并被循環(huán)利用，進(jìn)而維持細(xì)胞自身的動(dòng)態(tài)平衡和其正常生命活動(dòng)[11-12]。在分子角度上，自噬主要由多個(gè)自噬相關(guān)基因(Atg)執(zhí)行，同時(shí)也受多種信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。自噬小體的形成過(guò)程需要兩個(gè)泛素樣蛋白Atg12和Atg8，LC3-Ⅰ存在于胞質(zhì)中，是Atg8蛋白家族中最具特征性的成員。在磷脂酰乙醇胺參與下LC3-Ⅰ偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ參與自噬體膜的形成，因此LC3Ⅱ/Ⅰ的變化反應(yīng)自噬程度[13]。p62(也稱(chēng)SQSTM1蛋白)是負(fù)責(zé)溶酶體降解的自噬適配器，可以被自噬機(jī)制識(shí)別，運(yùn)送到溶酶體并進(jìn)行降解，故自噬發(fā)生時(shí)p62含量下降[14]。有研究表明[15-16]基于自噬的PI3K/AKT通路在腦缺血/再灌注損傷中扮演著重要的角色。

Fig 4 Representative immunofluorescence staining images of LC3B in each group n=3)1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative immunofluorescence staining images of LC3B in each group B:Analysis of LC3B mean fluorescence intensity of each group.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

Fig 5 The protein expressions of PI3K,p-AKT and AKT in each n=3)1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative Western blot images of PI3K,p-AKT and AKT levels.B:PI3K and p-AKT/AKT expression.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

Fig 6 The protein expressions of LC3Ⅰ,LC3Ⅱ and p62 in each n=3)1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative Western blot images of LC3Ⅰ,LC3Ⅱ and p62 levels.B:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio.C.p62 expression.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

本研究以大鼠MCAO/R模型，模擬腦缺血/再灌注過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠改善大鼠腦缺血/再灌注引起的損傷，同時(shí)能夠使PI3K，p-AKT/AKT，LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)升高，使p62表達(dá)降低。而LY294002能夠減弱補(bǔ)陽(yáng)還五湯的保護(hù)作用。綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過(guò)激活PI3K/AKT通路抑制自噬抗大鼠腦缺血/再灌注損傷。