基于網絡藥理學的制天南星炮制增效研究

武 旭，王 晶，鄒 婷，吳亞楠，問思華，陳 曦，賀素容,2，祁春艷,2，劉 倩，李雅娟，年 婧，張 橋，趙重博

(1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，2.陜西省中藥飲片工程技術研究中心，3.陜西省中藥炮制技術傳承基地，4.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 咸陽 712046)

天南星具有燥濕化痰、祛風止痙和散結消腫的功效，臨床多用于頑痰咳嗽、風痰眩暈、中風痰壅等證[1]。因其生品有毒，臨床使用前多以生姜白礬炮制，達到減毒增效的目的。天南星的毒性物質報道較多的是毒針晶和毒蛋白，與生姜、白礬炮制后針晶結構破壞，蛋白變性，從而降低天南星的毒性；同時，生姜可溫肺化痰止咳，白礬可燥濕化痰止咳，兩者同用有降低毒性，增強治療喘咳的作用[2]。但其發(fā)揮治療作用的藥效物質和作用機制目前尚不清楚，現有文獻報道表明炮制可影響天南星化痰止咳的作用，如采用小鼠酚紅排泄法比較天南星炮制前后“祛痰、平喘咳”的作用，結果顯示，天南星炮制前后均有化痰作用且炮制品不及生品[3]，小鼠氨水致咳模型比較止咳作用，炮制后止咳作用強于生品[2]。還有報道，生天南星長于祛風止痙，多用于破傷風、癲癇、中風；炮制后則多用于頑痰咳嗽。

“喘、痰”是慢性支氣管炎發(fā)作期的主證，病變部位涉及肺、脾、腎。從中醫(yī)角度來講，肺易貯痰，脾易生痰。痰濁藏于肺中，從而影響肺部的宣降功能，肺失其司則易感外邪，外邪束肺則痰喘發(fā)作[4]。由于肺部的痰蘊導致氣道阻塞和呼吸不良，痰是哮喘的直接病因和發(fā)病機制。過敏性哮喘模型最接近人類哮喘的病理生理機制[5]。卵清蛋白(ovalbumin，OVA)是使用最早和最廣泛的過敏原，OVA致敏和霧化觸發(fā)的過敏性哮喘動物模型在研究哮喘中使用頻次較高[6]。因此，本文對天南星炮制前后的化學成分進行分析，探討炮制對其成分的影響。選取“喘證”經典的OVA致敏的大鼠過敏性哮喘模型，初步探討天南星炮制前后對過敏性哮喘的治療作用；聯合網絡藥理學對其治療“痰、喘”疾病的靶點進行映射分析和作用機制分析，探討天南星炮制前后祛痰平喘的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器1290 UHPLC超高效液相色譜儀(Agilent)，Q Exactive Focus高分辨質譜儀(Thermo Fisher Scientific)，Heraeus Fresco17離心機(Thermo Fisher Scientific)，BSA124S-CW天平(Sartorius)，JXFSTPRP-24研磨儀(上海凈信科技有限公司)，明澈 D24 UV純水儀(Merck Millipore)，YM-080S超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司)，轉輪式切片機(徠卡-2016，德國)，JT-12S自動組織脫水機(武漢俊杰電子有限公司)，BMJ-A型包埋機(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)，RS36型全自動染色機(常州派斯杰醫(yī)療設備有限公司)，PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)，數字切片掃描儀(Pannoramic 250，濟南丹吉爾電子有限公司)，霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設備有限公司)。

1.2 藥物與試劑LC-MS級甲醇、乙腈、甲酸品牌均為CNW Technologies。組織標本固定液(10%中性甲醛固定液)，OVA(源葉生物科技有限公司)，鋁鎂佐劑(天津市天力化學試劑有限公司)，天南星購自陜西恒瑞萬壽路中藥材專業(yè)市場，由陜西中醫(yī)藥大學藥學院趙重博副教授鑒定為天南星科植物天南星的干燥塊莖。制天南星按照2020年版《中國藥典》實驗室自制。

1.3 網絡藥理學網址及軟件Pubmed(https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)，SwissTargetPrediction(http：//new.swisstargetprediction.ch/)，TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)，Uniprot(http：//www.uniprot.org/)，KEGG(http：//www.genome.jp/kegg/)，DAVID數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)等數據庫。chemdraw 19.0，Cytoscape3.8.0等軟件。

1.4 實驗動物成年雄性SPF級SD大鼠，體質量(180±20) g，購自西安交通大學實驗動物中心，合格證號SCXK(陜)2018-001。適應性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。本實驗研究獲陜西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準。

1.5 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的天南星炮制前后成分分析

1.5.1供試品的制備 分別取生天南星和制天南星粉末各約3 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇30 mL，超聲提取45 min，冷卻至室溫并補足減失重量，離心，精密量取上清液18 mL，減壓濃縮至干，加60%乙醇使之溶解，轉移至5 mL量瓶中并定容，濾過，即得生制南星醇提樣[1]。

1.5.2色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Waters C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，洗脫梯度：0～3.5 min，95%～85% A；3.5～6 min，85%～70% A；6～6.5 min，70% A；6.5～12 min，70%～30% A；12～12.5 min，30% A；12.5～18 min，30%～0%；18～25 min，0% A；25～26 min，0%～95% A；26～30 min，95% A。柱溫35 ℃，進樣量10 μL，流速400 μL·min-1。

1.5.3質譜條件 Q Exactive Focus高分辨質譜儀進行正、負2種模式掃描測定，參數如下：氣體流速：45 Arb，輔助氣體流速：15 Arb，毛細管溫度：400 ℃，全ms分辨率：70 000，ms/ms分辨率：17 500，碰撞能量：15/30/45，在NCE模式下，噴射電壓：4.0 kV(正)或-3.6kV(負)。

1.5.4成分鑒定 使用XCMS軟件將生天南星和制天南星質譜原始數據導入。進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作，利用自建二級質譜數據庫對含有MS/MS數據的峰物質鑒定。

1.6 天南星炮制前后治療“喘、痰”的網絡藥理學

1.6.1成分篩選 通過UPLC-Q-TOF-MS/MS 對天南星進行化合物表征后的主要成分，結合 TCMSP中藥系統(tǒng)藥理數據庫、PubChem數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)中收錄的化學成分，按以下方式進行篩選：(1)通過文獻數據庫可以搜索得到的已有明確藥理活性的化合物；(2)含量相對較高的化合物[7]。

1.6.2化合物的靶點預測 整理目標化合物，導入Pubchem數據庫種獲取SMILES結構式，在Swiss Target prediction網站中預測靶點基因，最后將靶點去重，整合，即得。

1.6.3“喘、痰”疾病靶點的獲取 在國內外權威數據庫知網、維普、萬方、Web of Science、pubmed等查閱文獻，結果發(fā)現“痰”與“氣道黏液分泌”有關，故選擇“phlegm”，“hypersecretion of airway mucus”定為“痰”的關鍵詞[8]，同法選擇“asthma”定位“喘”的關鍵詞，在GeneCards數據庫中搜索相關疾病靶標，篩選、整理、后得到疾病靶點。

1.6.4目標化合物靶點預測 將化合物導入Pubchem數據庫中，檢索SMILES號，然后在Swiss Target Prediction網站中預測靶點，設置“Probability”≥0.05，篩選整理目標化合物的靶點。

1.6.5藥物-疾病靶點預測 將成分靶點與“喘、痰”靶點取交集并繪圖。交集靶點則為目標成分直接作用于“喘、痰”的靶點。在Cytosecape 3.7.2軟件構建“藥物成分-疾病-靶點”網絡圖[9]。

1.6.6PPI網絡分析 將“藥物-疾病”交集靶點導入String 數據庫，進行蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡分析，選擇物種為“Homo sapiens”，隱藏沒有互作關系的節(jié)點，后保存數據為“.tsv”格式，在Cytoscape 3.7.2軟件中對網絡進行節(jié)點度值分布(node degree distribution)，介數中心性(betweenness centrality)及接近中心性(closeness centrality)等拓撲參數分析。并將PPI網絡可視化，得到核心靶點的蛋白互作網絡圖。

1.6.7GO富集分析和KEGG通路分析 應用DAVID數據庫，對“天南星-‘喘、痰’”的交集靶點，進行基因功能富集分析(gene ontology，GO)，探討藥物生物學過程功能中的分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組成(cellular component，CC)等基因靶點的功能。同時，在該數據庫中對交集基因進行京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，探討藥物作用的生物通路，分析潛在靶點所富集的信號通路。

1.7 天南星炮制前后治療“痰、喘”的藥效

1.7.1試藥的制備 根據《中國藥典》，天南星臨床用量是(3～9) g，按照中間劑量6 g計算，人的平均體質量為60 kg，平均1 d的用藥劑量為0.1 g·kg-1，大鼠以人劑量的6倍計算，即得給藥劑量為0.6 g·kg-1·d-1。稱取天南星和制天南星粉末(過4號篩)各300 g，加6倍量水浸提l h，濾過，減壓濃縮至生藥含量0.6 kg·L-1的提取液﹐-4 ℃冰箱保存[10]。

1.7.2動物的給藥與分組 取50只10～14周齡雄性SD大鼠，隨機分為空白組、造模組，空白組12只，造模組38只。適應性喂養(yǎng)后，造模組d 1、7和14用OVA 2 g·L-1與10 g·L-1氫氧化鋁的混懸液1 mL腹腔注射導致過敏，d 14～21 5% OVA霧化吸入激發(fā)哮喘，制造動物模型。根據動物行為學和肺組織HE染色對模型進行評價，造模成功后，將造模組大鼠隨機分為模型組、陽性藥組、天南星組、制天南星組，每組8只。分別灌胃0.6 g·kg-1·d-1生天南星，制天南星水提液(參考臨床劑量換算)，共35 d。陽性藥組給與孟魯斯特納5 mg·kg-1霧化，空白組給予等體積的生理鹽水[11]。

1.7.3觀察指標 各組大鼠于d 36用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，收集肺泡灌洗液，立即置于冰上，1 000 r·min-1離心10 min，取上清，-80 ℃保存，備用，檢測其炎性細胞分類百分比。取出肺組織，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，觀察肺組織PAS染色。

2 結果

2.1 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的天南星炮制前后成分分析在正、負2種不同掃描模式下，共從樣品中鑒定出27個化學成分，見Tab 1。結果發(fā)現，天南星炮制前后成分大致相同，但也存在差異，差異成分有姜黃素、6-姜烯酚、樟腦、去甲基姜黃素等。制天南星增加的成分均來源于輔料生姜。

Fig 1 TIC diagrams of Arisaematis rhizoma in positive ion (A) and negative ion (B) modes and Arisaematis rhizoma preparatum in positive ion (C) and negative ion (D) modes

Tab 1 Identification of chemical composition

2.2 網絡藥理學研究結果通過文獻挖掘和數據庫篩選等方法對天南星的化學成分進行預測，在TCMSP中設置OB≥30%，DL≥0.18，結合文獻挖掘和TCMIP數據庫得到天南星化合物見Tab 2。結合“2.1”項下的27種成分，共整合36個目標化合物，獲取成分的靶點基因共1 369個。在Gene Cards數據庫中將疾病的靶點進行整理，設置“Probability”≥0.4(中位數)，最終獲取3 825個與“喘、痰”有關的疾病相關靶點。

“成分-靶點-疾病”網絡分析：將天南星化學成分作用靶點與疾病靶點基因取交集(Fig 1)，共獲得天南星-疾病交集基因共239個；制天南星-疾病交集基因299個，使用Cytosecape 3.7.2軟件中構建天南星“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖(Fig 2)，網絡中共有335個節(jié)點(化合物35個節(jié)點，靶點300個節(jié)點)，1 042條邊。結果顯示，天南星、制天南星治療“喘、痰”相關疾病多成分，多靶點的特征。其中“Degree”值較高的化合物有秋水仙堿、6-姜烯酚、亞油酸、去甲基姜黃素、阿魏酸、壬二酸、谷甾醇、豆甾醇、鳥苷、尿苷、異夏佛塔苷等，這些化合物可能為天南星治療“喘、痰”疾病中的關鍵成分。

“以往老百姓需要跑幾個部門，輾轉才能辦完的事項，如今一窗、一網、一人就能全部辦結，我們把非涉密的數據資源都集中在華為大數據中心，利用信息技術對政務數據進行整合共享，以實現跨部門信息的互聯互通，極大提升了行政效率，真正實現讓‘數據多跑路，讓群眾少跑路’的理念。”瀘州市委常委、副市長劉春對《中國經濟周刊》表示。

Fig 2 Intersection of chemical composition target and disease target

Tab 2 Composition of TNX in database

在Cytoscape2.7.2軟件中，利用StringApp插件繪制PPI網絡圖，并進行拓撲參數分析。核心靶點詳見Tab 3。MAPK3，MAPK/ERK級聯通過調控轉錄、翻譯、細胞骨架重排等多種生物學功能，調節(jié)細胞生長、黏附和分化等生物學功能。VEGFA生長因子在血管生成和內皮細胞生長中起著重要的作用，VEGF能夠通過抑制炎癥及CD133+祖細胞調節(jié)保護肺部免受炎癥損傷。STAT3通過調節(jié)初生CD4的分化來調節(jié)炎癥反應[12]。

在DAVID數據庫中，對篩選的靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析，設置P<0.05，表示富集結果具有統(tǒng)計學意義，結果見Fig 4(TOP15)。在天南星治療“喘、痰”相關疾病生物學過程中，分子功能主要涉及蛋白質結合、ATP結合、Zn離子結合和轉錄因子活性，序列特異性DNA結合等；細胞組成主要富集在質膜、細胞質、膜整體組件、線粒體和細胞外泌體等；生物過程主要富集在RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、細胞增殖的正調控、藥物反應、轉錄的正調控、DNA 模板化以及炎癥反應、對脂多糖的反應等過程。結果顯示，天南星通過多種生物途徑治療“喘、痰”相關疾病。

Fig 3 Component-Target-Disease networkOrange：chemical composition (yellow node refers to differential composition);Purple：disease;Green：disease target

Tab 3 PPI core targets

KEGG通路分析結果中，天南星炮制前后均主要通過調控PI3K-Akt信號通路來實現治療“喘、痰”等疾病，其中制天南星在通路中調控的靶點多于生品此外還涉及MAPK信號通路，癌癥中的蛋白多糖，Rap1信號通路，HIF-1 信號通路，結核病，FoxO信號通路，鈣信號通路和cAMP信號通路等，表明天南星炮制前后在治療“喘、痰”相關疾病過程中調控多條通路。

2.3 動物實驗結果

2.3.1模型評價 觀察造模組大鼠是否持續(xù)表現出口唇黏膜顯紫紅色、腹肌痙攣、喘息頻次變多、打噴嚏、咳嗽、抓耳部和臉部等行為學的改變，去除行為學沒有改變的大鼠。從空白組大鼠，造模組的大鼠中，隨機選取3只進行肺組織病理切片，HE染色觀察，進行模型評價。如Fig 5所示，空白組大鼠肺組織結構較為正常，壁薄，無結締組織增生、增厚；各級支氣管結構完整清晰，上皮細胞形態(tài)較為正常，排列較為整齊，未見明顯水腫；未見其他明顯病理變化。造模組大鼠肺泡上皮細胞變性壞死，壞死細胞胞核固縮或裂解，不規(guī)則，病變嚴重區(qū)域肺泡形態(tài)結構模糊，肺泡隔增厚。結果表明模型建立成功。

2.3.2大鼠BALF中炎性細胞分類計數 各組大鼠BALF中炎性細胞分類計數百分比結果如Fig 6所示，與空白組相比較，模型組大鼠BALF中巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞百分比明顯上升；與模型組大鼠相比較，陽性藥組大鼠BALF中巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞百分比明顯下降，天南星組大鼠BALF中淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞百分比明顯下降，制天南星組大鼠BALF中巨噬細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞百分比明顯下降?？傮w來看，制天南星作用略優(yōu)于生天南星。

Fig 4 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis (P<0.05)A-D：AR;E-H：ARP，A，E：MF;B，F：CC;C，G：BP;D，H：KEGG

Fig 5 Effect of allergic asthma model on lung tissues of rats(A：Control，B：Model building；100×)

3 討論

天南星，味苦，性溫，是我國傳統(tǒng)的中藥，已有 2 000 多年的藥用歷史，常常用于治療“痰”證，中醫(yī)認為“痰飲病”可以誘發(fā)“哮病”，現代臨床以哮喘為多見。天南星作為有毒中藥，炮制對其毒性和功效的影響尤為重要。

本文應用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術快速檢測了天南星和制天南星中的化學成分，發(fā)現制天南星較原料中夏佛塔苷、棕櫚酸、亞油酸、精氨酸、沒食子酸、甘露醇等基礎物質略有下降，據報道夏佛塔苷是關鍵抗炎活性成分；棕櫚酸與抗前列腺增生有較好的相關性；亞油酸對DPPH和ABTS+自由基具有一定的清除效果；精氨酸具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗炎、促進細胞增殖、抗凋亡、調控脂質代謝等作用；沒食子酸可抑制結腸癌HCT-116和Caco-2細胞活性；20%甘露醇加溫至37 ℃靜脈滴注可減輕患者疼痛，降低患者靜脈炎的發(fā)生率等。同時制天南星中增加了姜黃素、6-姜烯酚、樟腦、去甲基姜黃素等成分，這些成分均來源于炮制輔料生姜，此外，精氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等成分既存在于天南星中又存在于生姜中。結合網絡藥理學的方法預測目標化合物治療疾病的作用靶點，通過“藥物-靶點-疾病”網絡分析，6-姜烯酚、秋水仙堿、亞油酸、去甲基姜黃素、阿魏酸、壬二酸、谷甾醇、豆甾醇、鳥苷、尿苷、異夏佛塔苷等成分在天南星炮制前后治療疾病中起到關鍵作用。鐘凌云等[3]通過對天南星中皂苷類成分的研究發(fā)現，皂苷類成分對胃黏膜有刺激作用，也可以增加氣管、支氣管分泌黏液，從而發(fā)揮去痰的作用。

Fig 6 Percentage count of inflammatory cells in BALF**P<0.01 vs Control，#P<0.05,##P<0.01 vs Model

Fig 7 PAS staining results of rat lung tissues (100×)A：Control；B：Model；C：Positive；D：AR；E：ARP

比較天南星和制天南星抗“喘、痰”的KEGG通路分析可知，天南星炮制前后均主要通過調控PI3K-Akt 信號通路治療疾病。不同的是，制天南星在通路中是直接調控PI3K、AKT1等關鍵靶點，而天南星是間接調控。動物實驗結果表明，天南星炮制前后均對過敏性哮喘模型大鼠肺組織有改善作用，可降低大鼠BALF中的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等炎性細胞，制天南星略優(yōu)于生天南星，但組間并無顯著性差異。由此可見，天南星“炮制-增效”的機制可能是因為有效成分的增加，進而調控更多通路和靶蛋白參與的生物過程來實現對“喘、痰”等疾病的治療。GO富集分析可知，其涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、細胞增殖的正調控、轉錄的正調控、脂多糖的反應等生物過程，體現出中藥天南星在治療“喘、痰”疾病中有多成分、多靶點的特點。

PPI分析篩選出11個核心靶點。分別為STAT3、SRC、MAPK3、PIK3CA、RELA、ESR1、VEGFA、EGFR、MAPK8、IL-6、JAK1。氣道炎癥是哮喘的典型特征之一，緩解炎癥反應可有效控制哮喘癥狀。研究發(fā)現哮喘幼年大鼠體內，IL-21/STAT3通路被激活可能與炎癥反應和免疫反應增強以及肺組織受損有關。IL-21在多種與免疫相關的疾病中可檢測出IL-21的高表達水平，并隨著疾病的控制而表達下降。STAT3蛋白是IL-21的主要信號傳導因子，其磷酸化活化后可參與多種自身免疫性疾病產生和進展過程[13]。RELA (p65) 是NF-κB家族成員之一，作為關鍵的抗凋亡信號和二聚體狀態(tài)下NF-κB最重要的功能亞基，RELA在中性粒細胞的凋亡中發(fā)揮著重要的作用，而KLF-2/RELA的比例失衡能夠調控哮喘患者中性粒細胞的凋亡，并且隨著病情的加重，KLF-2/RELA比值逐漸降低[14]。VEGFA在肺組織，尤其是肺泡上皮中表達豐富，參與肺泡發(fā)育和成熟，可通過促進前列環(huán)素產生、增加超氧化物歧化酶表達等維持肺的正常結構和生理功能，并對肺損傷起修復作用;VEGFA、Periostin過度合成和分泌可能加重氣道和肺組織酸性粒細胞和中性粒細胞浸潤，加重氣道和肺組織損傷，引起肺功能降低，EGFR在哮喘的發(fā)生與發(fā)展中起著至關重要的作用，哮喘患者氣道的支氣管上皮、腺體、平滑肌等均可明顯觀察到EGF及EGFR的免疫反應[15]。哮喘的病理特征之一是氣道平滑肌的增生與肥大，而SRC在氣道平滑肌的增殖與遷移中具有重要作用[16]。多種細胞包括巨噬細胞均可產生IL-6和IL-8，研究表明，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中肺泡巨噬細胞分泌的IL-6和IL-8較對照組明顯增高，肺部受到過敏原刺激后，產生過多的IL-6和IL-8參與哮喘免疫炎性反應發(fā)生與進展[17]。由此可見，天南星可能通過這些核心靶點發(fā)揮治療“喘、痰”等肺部疾病的作用。

本實驗在比較研究天南星炮制前后成分變化的基礎上，聯合網絡藥理學初步探討了天南星炮制增效的原理可能是由于炮制后化學成分的增加，在治療“喘、痰”等疾病的藥理機制中共涉及299個核心靶點，作用調控124條信號通路。通過OVA致敏的大鼠過敏性哮喘模型，比較天南星炮制前后的藥效作用，結果發(fā)現，制天南星抗過敏性哮喘的作用優(yōu)于生品，其治療“喘、痰”等疾病的作用機制仍需深入研究?！八幬?成分-靶點”關系網絡中關鍵成分分析，發(fā)現原料藥材與炮制輔料均在治療疾病的過程中發(fā)揮重要作用，進而為臨床規(guī)范化應用制天南星提供參考依據。此外，根據文獻和數據庫挖掘天南星有效成分的結果，天南星的化學成分還有待補充研究。