基于網絡藥理學探究加味獨活寄生合劑對膝骨關節(jié)炎作用機制及實驗驗證

曾 凡，陳柏屹，王 康，米倚林，段 航，廖小林,4，鄺高艷，盧 敏

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一中醫(yī)臨床學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院四肢關節(jié)科，湖南 長沙 410007；3.懷化市中醫(yī)院小兒骨科，湖南 懷化 418000；4.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種常見、多發(fā)的慢性筋骨疾病，疼痛為大多數(shù)患者就醫(yī)的首要癥狀[1]，因此，目前KOA治療目的主要集中在減輕炎癥，最大程度減少疼痛并維持關節(jié)功能。非甾體類抗炎藥是KOA疼痛治療的基石，但療效有限，并且長期使用此類藥物產生的副作用給臨床醫(yī)生帶來了巨大的挑戰(zhàn)。由于KOA為一種慢性疾病，長期治療是不可避免的，因此，找到可長期使用并安全有效的治療方案極為重要。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥中眾多經典復方經過現(xiàn)代科學諸多臨床試驗驗證其療效穩(wěn)定，安全可靠，近年來，在KOA的治療過程中愈加廣泛使用。加味獨活寄生合劑為《備急千金要方》中經典中藥復方獨活寄生湯的基礎上加用黃芩、木瓜、威靈仙、制天南星四味中藥而成的改革制劑(湘藥制備字：Z20190064，批號：20191111)，本課題組前期通過大量臨床及基礎研究證實其可有效改善KOA患者臨床癥狀，療效可靠[2]。但由于中藥成分復雜，目前尚缺乏對其有效發(fā)揮顯著治療作用的物質基礎及作用機制的科學認識，阻礙了中藥成分的應用，因此，亟需揭示中藥治療疾病的作用機制。

網絡藥理學因其具備良好的整體性與系統(tǒng)性，使其迅速成為應用于闡明中藥方劑的活性成分和潛在作用機制的一種新策略，在新藥發(fā)現(xiàn)、藥物再利用和合理配方發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮關鍵作用[3]。因此，本研究借助網絡藥理學方法探究加味獨活寄生合劑發(fā)揮治療KOA作用的潛在靶點及通路，并通過動物實驗進行初步驗證，以期為加味獨活寄生合劑的臨床合理應用和進一步實驗研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 加味獨活寄生合劑治療KOA的網絡藥理學研究

1.1.1藥物化學成分檢索與篩選 將加味獨活寄生合劑中包含的19味中藥依次輸入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)[4]進行檢索相關化學成分的藥動力學特性(ADME)參數(shù)，設定類藥性(drug likeness，DL)≥0.18及口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30進行篩選，獲得藥物的主要活性成分及對應靶點信息，不符合TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選條件的藥物則借助中藥分子機制生物信息學分析工具(BATMAN-TCM)數(shù)據(jù)庫查詢，篩選條件設為校正后P值<0.05及分數(shù)截斷值≥30[5]。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)將加味獨活寄生合劑中有效成分靶點信息進行標準化。

1.1.2膝骨關節(jié)炎疾病靶點 從GeneCards、OMIM和GEO 3個數(shù)據(jù)庫中獲取KOA疾病靶點。其中，在GEO數(shù)據(jù)庫中獲得的基因數(shù)據(jù)集使用R軟件(version 3.6.2)中的Limma軟件包在|log FC|值>0.5的篩選條件下對數(shù)據(jù)進行分析，獲得KOA的差異表達基因。將上述3個數(shù)據(jù)庫中獲得的所有KOA相關基因進行匯總去重，獲得KOA相關靶點。

1.1.3藥物活性成分-疾病靶點網絡的構建 KOA相關靶點與“1.1.1”中獲得的藥物活性成分靶點相映射，獲得加味獨活寄生合劑治療KOA的作用靶點，即藥物-疾病共同靶點，制作Venn圖，并導入Cytoscape3.7.2軟件中，構建加味獨活寄生合劑活性成分-疾病靶點可視化網絡圖。

1.1.4靶蛋白相互作用網絡(PPI)構建 將藥物-疾病共同靶點導入STRING平臺進行分析，構建PPI網絡圖，并借助 Cytoscape軟件計算相關拓撲參數(shù)，分析PPI網絡中的關鍵靶點。網絡中某個節(jié)點與其他節(jié)點的連線數(shù)量稱之為度(degree)，度值越大，表示該節(jié)點在所構建的網絡中越重要。利用R軟件，根據(jù)度值大小繪制排序圖，篩選出核心靶點。

1.1.5交集基因GO富集與KEGG通路富集分析 借助Metascape數(shù)據(jù)庫[6](http：//metascape.org)進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。P<0.01被認為是有統(tǒng)計學意義的，前20個具有統(tǒng)計學意義的結果，根據(jù)基因比率，以直方圖顯示。

1.1.6分子對接 選取PPI圖中度值最大的疾病靶點蛋白通過PDB數(shù)據(jù)庫獲取三維結構，經AutoDockTools1.5.6軟件去水、加氫等處理后，與加味獨活寄生合劑中的主要活性成分分別作為受體和配體導入AutoDock Vina1.1.2軟件中進行分子對接，根據(jù)結合能是否小于0初步判定配體與受體能否自發(fā)結合，當結合能絕對值大于5.0代表擁有較強結合能力[7]。

1.2 實驗驗證

1.2.1動物選取與倫理聲明 24只成年新西蘭正常雄性健康白兔(體質量2.0～2.5 kg)購自湖南太平生物科技有限公司，許可證號：SCXK(湖南)2020-0005，檢疫合格后單獨飼養(yǎng)，實驗動物的日常飼料和飲水由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。本實驗已通過湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審查(倫理編號：LLBH-202006190001)。

1.2.2 主要試劑及儀器加味獨活寄生合劑購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科(批號：20191111，湘藥制備字：Z20190064)。方藥組成：桑寄生18 g，獨活6 g，當歸12 g，杜仲12 g，牛膝6 g，秦艽6 g，細辛3 g，川芎6 g，黨參12 g，茯苓12 g，肉桂3 g，防風6 g，木瓜12 g，白芍10 g，甘草3 g，熟地黃15 g，制天南星6 g，黃芩6 g，威靈仙12 g。每瓶250 mL，含生藥量為0.664 kg·L-1。白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號：CSB-E06900Rb、CSB-E06998Rb)，Bcl-2相關X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶3(Caspase 3)ELISA試劑盒(江萊生物公司，批號：JL10071、JL33424)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1(AKT1)、β-肌動蛋白抗體(β-actin)(美國Proteintech公司，批號：60203-2-Ig、66009-1-Ig)。

臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R)、多功能酶標分析儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：MB-530)、電泳儀(中國北京六一儀器廠、型號：DYY-6C)、熒光定量RCP儀(Thermo，型號：PIKOREAL96)。

1.2.3模型建立、分組與給藥 將兔隨機分為3組：對照組(Control)、模型組(Model)、中藥組(JDJM)，每組8只，模型組及中藥組均參考經典Videman造模法，即采用高分子石膏將兔右下肢固定伸直位造模建立KOA模型[8]。6周后，在模型及中藥組中隨機選取3只兔拍攝膝關節(jié)X線片。X線見造模側關節(jié)間隙較健側狹窄，且可見軟骨下硬化或骨贅形成提示造模成功[9]。隨后，中藥組予以3.4 mL·kg-1加味獨活寄生合劑灌胃，劑量按體表面積劑量換算法計算得出，模型組每日給予等量蒸餾水灌胃，每日2次，持續(xù)4周。

1.2.4影像學及ELISA檢測 給藥4周后，每組隨機挑選5只兔右側膝關節(jié)予以X片拍攝；禁食禁水一晚，于d 2處死兔子，抽取關節(jié)液、血液室溫放置2 h后，于2 ℃、3 000 r·min-1(離心半徑10 cm)離心15 min，取上清-80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明，測定關節(jié)液及血清中IL-1β、TNF-α、BAX 、Caspase 3的含量。

1.2.5qRT-PCR檢測關鍵靶點 根據(jù)PPI分析結果，選取度值最大的關鍵靶點AKT1進行驗證。通過TRIzol法提取兔膝關節(jié)軟骨組織總RNA，使用SYBR法進行qRT-PCR反應，引物采用Primer5軟件設計，由上海生物技術有限公司合成。引物序列如下：AKT1(上游：5′-AAGGATGAAGTCGCCCACAC-3′;下游：5′-GACGATTTCCGCACCGTAGA-3′)。PCR反應的循環(huán)條件為：95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

1.2.6Western Blot檢測關鍵靶點 加入300 μL RIPA裂解液裂解0.025g關節(jié)軟骨組織10 min，在4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，然后用BCA法測定蛋白濃度。裂解液總蛋白經SDS-PAGE電泳后轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封膜90 min，將一抗溶液按一定比例稀釋(AKT1 ∶1 ∶2 000)與膜一起孵育，置于4 ℃冰箱中過夜。然后用二抗在室溫下孵育90 min，用ECL化學發(fā)光液顯影，曝光后用Quantity one軟件對曝光膜進行掃描分析。

2 結果

2.1 加味獨活寄生合劑-KOA共同靶點和活性成分篩選依據(jù)設定的檢索條件，19味中藥共獲得309個有效成分，其中白芍13個，川芎7個，茯苓15個，當歸2個，黨參21個，獨活9個，秦艽2個，杜仲28個，熟地2個，防風18個，黃芩36個，木瓜4個，牛膝20個，甘草92個，桑寄生2個，天南星7個，威靈仙7個，細辛8個，肉桂16個，去重后獲得194種活性成分、278個作用靶點。從GeneCard、OMIM數(shù)據(jù)庫中分別獲得2 564、2 593個與KOA相關的靶點。在GEO數(shù)據(jù)庫中，獲得包含5例正常受試者和6例KOA患者樣本的基因表達數(shù)據(jù)集(GSE169077)，分析后獲得差異表達基因345個，包含151個上調基因以及194個下調基因(Fig 1A,B)。所有靶點匯總去重后，共獲得2 783個KOA相關靶點。將疾病靶點與藥物作用靶點匹配，得到152個共同靶點(Fig 1C)。

2.2 加味獨活寄生合劑成分-疾病靶點網絡及PPI網絡分析將上述數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 3.7.2軟件中構建成分-疾病靶點網絡，結果顯示152個共同靶點與加味獨活寄生合劑中180種活性成分相映射，其中作用靶點較多的活性成分為：槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)等。

Fig 1 Screening of JDJM-KOA common targets and active ingredientsA：Heatmap of the GSE169077 gene expression dataset;B：Volcano plot of the GSE169077 gene expression dataset;C：Venn diagram of JDJM-related and KOA-related targets.

篩選獲得的共同靶點基因導入STRING平臺進行PPI網絡分析，分析結果導入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化并計算度值，根據(jù)度值大小，針對前20個進行繪制直方圖(Fig 2)，其中，AKT1為度值最大的靶點。

Fig 2 Key proteins in PPI network diagram

2.3 GO富集分析及KEGG通路富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫對2.2中獲得的152個共同靶點基因進行GO富集分析，結果可分為生物過程(BP)、分子功能(MF)、細胞組成(CC)3類，其中，生物過程占比最多(Fig 3 A-D)，說明生物過程起主要作用，內容主要富集于炎癥反應、凋亡信號通路有關。因此，加味獨活寄生合劑可能主要通過抗炎和抗凋亡過程發(fā)揮對KOA的治療作用。KEGG富集分析顯示，加味獨活寄生合劑治療KOA的機制可能涉及314條相關通路，主要包括TNF信號通路、HIF-1信號通路、NF-κB信號通路、p53信號通路和Wnt信號通路(Fig 3E)，這些通路均已被證實與KOA的病理發(fā)展密切相關。

2.4 分子對接驗證基于PPI分析結果，本研究選用AKT1作為疾病靶點蛋白作為受體與加味獨活寄生合劑中的主要有效活性成分進行分子對接。加味獨活寄生合劑中主要活性成分與疾病靶點蛋白AKT1結合能均為負值，說明其能自發(fā)結合；AKT1與槲皮素、山奈酚、木犀草素對接結合能分別為：-6.0 kcal·mol-1、-5.9 kcal·mol-1、-6.1 kcal·mol-1，結合能均小于-5 kcal·mol-1，體現(xiàn)了較強的結合能力( Fig 4)。

2.5 加味獨活寄生合劑對KOA兔膝關節(jié)影像學的影響為初步評估加味獨活寄生合劑對KOA兔膝關節(jié)的影響，本研究通過拍攝其膝關節(jié)X片來評估KOA的嚴重程度。與對照組相比，模型組兔膝關節(jié)僵硬，屈伸活動受限，X片示內外側關節(jié)間隙明顯變窄，部分出現(xiàn)軟骨下骨硬化以及骨贅形成；與模型組相比，中藥組外側關節(jié)間隙較均勻，以內側關節(jié)間隙變窄為主，偶見軟骨下骨硬化，未見明顯骨贅形成。參考Kellgren-Lawrence評分系統(tǒng)評估膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的嚴重程度，結果顯示，中藥組評分明顯低于模型組(P<0.05) ( Fig 5)。

Fig 3 Bar chart of GO function and KEGG pathway enrichment analysisA：GO analysis results percentage chart;B：Top 20 significantly enriched terms in GO-BPs;C：Top 20 significantly enriched terms in GO-MFs;D：Top 20 significantly enriched terms in GO-CCs;E：KEGG pathway analysis

Fig 4 The docking diagram of AKT1 with Quercetin (A),Kaempferol (B) and Luteolin (C)

Fig 5 Effects of JDJM on severity of knee osteoarthritis in rabbits Median(Q25,Q75) (n=5)A：Anteroposterior X-rays of rabbit knee joint;B：Lateral X-rays of rabbit knee joint;C：KL score.*P<0.05 vs Control；#P<0.05 vs Model

Fig 6 Effect of JDJM on inflammatory cytokines in KOA 或6)A：Relative expression levels of IL-1β and TNF-α in serum;B：Relative expression levels of IL-1β and TNF-α in joint fluid;**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model.

2.6 加味獨活寄生合劑對KOA兔炎癥因子表達情況的影響本研究通過檢測各組兔IL-1β和TNF-α表達變化情況，評估加味獨活寄生合劑對炎癥反應的影響。與對照組比較，模型組兔血清中IL-1β、TNF-α含量均升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組血清中IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05)(Fig 6 A)。隨后，通過檢測關節(jié)液中IL-1β和TNF-α表達變化情況進一步驗證。模型組兔關節(jié)液中IL-β、TNF-α的表達明顯高于對照組；中藥組關節(jié)液中TNF-α和IL-1β含量較模型組明顯降低(P<0.05)(Fig 6 B)。

2.7 加味獨活寄生合劑對KOA兔凋亡相關因子表達情況的影響ELISA結果顯示，與對照組比較，模型組兔血清及關節(jié)液中Caspase 3、BAX含量均升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組Caspase 3、BAX含量降低(P<0.05)( Fig 7)。

Fig 7 Effect of JDJM on apoptosis factors in KOA 或6)A：Relative expression levels of Caspase 3 and Bax in serum;B：Relative expression levels of Caspase 3 and Bax in joint fluid;*P<0.05,**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model.

2.8 加味獨活寄生合劑對軟骨組織中AKT1表達的影響采用Real-time PCR、Western blot對加味獨活寄生合劑抗KOA核心靶點AKT1的mRNA及蛋白表達水平進行驗證。同對照組相比，模型組AKT1的mRNA及蛋白表達水平均升高(P<0.01)；同模型組相比，中藥組AKT1的mRNA及蛋白表達水平均降低(P<0.01)( Fig 8)。

Fig 8 Effect of JDJM on AKT1 n=4)**P<0.01 vs Control;##P<0.01 vs Model

3 討論

骨痹多因虛實之邪夾雜所致，而肝腎不足、正氣虧虛是其發(fā)病的重要內因。獨活寄生湯為治痹經方，功可補益肝腎，祛風除痹，加味獨活寄生合劑在其基礎上增加黃芩、木瓜、制天南星、威靈仙，使其解毒除痹、祛風除濕之效加強，可有效緩解患者疼痛等相關癥狀，運用于臨床治療KOA卓有成效，表現(xiàn)出其抗KOA的巨大潛力。本研究采用網絡藥理學的方法探索加味獨活寄生合劑抗KOA的作用機制，并進一步對其藥效進行動物實驗驗證。

網絡藥理學結果顯示，槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)可能為加味獨活寄生合劑發(fā)揮主要作用的有效活性成分。槲皮素、山奈酚、木犀草素3者同屬于黃酮類化合物，是植物為抵御外界脅迫而產生天然化合物，諸多研究均證實槲皮素可以通過抑制炎癥相關信號通路、降低促炎性細胞因子的表達發(fā)揮保護關節(jié)軟骨的作用，從而延緩OA進展[10]。山奈酚因在多種疾病治療過程中表現(xiàn)出突出的抗炎和抗氧化作用而被廣泛關注，其可通過抑制MAPK相關途徑有效下調基質金屬蛋白酶水平，在一定程度上減緩了軟骨退變的程度[11]。施鳳超等[12]通過實驗表明，木犀草素可通過降低血液及關節(jié)液中炎癥因子水平，改善Treg/Th17細胞免疫失衡達到抗骨關節(jié)炎的作用。炎癥反應貫穿KOA病程的始終。關節(jié)液中的IL-1β水平可在一定程度上反映骨關節(jié)炎的病變程度，是誘導關節(jié)軟骨基質分解代謝及炎癥反應的主要細胞因子，在OA關節(jié)的軟骨、滑液及滑膜中均可檢測到表達水平升高，其生物活性復雜多樣，能夠作用于骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展病理過程中諸多環(huán)節(jié)，加重關節(jié)的炎癥程度[13]；TNF-α是導致OA發(fā)病的關鍵細胞因子，IL-1β可通過與TNF-α的協(xié)同刺激激活多條炎癥相關信號通路，誘導大量促炎因子的產生，進而導致進行性細胞外基質損傷和軟骨破壞[14]。本研究采用動物實驗驗證，結果顯示，予以加味獨活寄生合劑治療后，血清及關節(jié)液中炎癥因子IL-1β、TNF-α表達水平較模型組同時出現(xiàn)明顯降低。因此，加味獨活寄生合劑很可能通過黃酮類化合物如槲皮素、山奈酚、木犀草素等關鍵有效成分發(fā)揮抗炎作用達到治療KOA的目的。

為進一步探究加味獨活寄生合劑作用于KOA的關鍵靶點，本研究構建了加味獨活寄生合劑-KOA蛋白互作網絡，排名第一的靶點絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1(AKT1)可能為其治療KOA最重要的關鍵潛在靶點。軟骨內骨化不僅是生理性骨骼生長的重要過程，也是骨關節(jié)炎進展過程中骨贅形成等病理表現(xiàn)的重要過程，AKT1在調節(jié)軟骨細胞中的軟骨鈣化過程中發(fā)揮關鍵作用，降低AKT1水平可減少骨贅的形成[15]，同時，AKT1也是PI3K/AKT信號通路中重要下游靶點，Pan等[16]研究報道了抑制PI3K/AKT信號通路的激活可抑制炎癥和凋亡；Caspase 3和BAX是細胞凋亡過程的重要參與者和執(zhí)行者，Caspase 3在OA的軟骨高表達能夠調節(jié)軟骨細胞凋亡并破壞OA中結構和生化穩(wěn)態(tài)，與OA的嚴重程度呈正相關[17]。本次動物實驗結果表明，予以加味獨活寄生合劑治療后，中藥組兔的KOA影像學嚴重程度較模型組明顯改善，血清及關節(jié)液中Caspase 3、BAX表達水平出現(xiàn)明顯降低，AKT1m RNA及蛋白表達水平均較模型組明顯下降。因此，抑制AKT1的表達可能在使用加味獨活寄生合劑治療KOA中起關鍵作用，然而可能還有其他分子機制尚未探索，需要進一步研究。

通過功能富集分析可更加方便揭示和理解基因產物如何相互作用，進一步探尋加味獨活寄生合劑在KOA的治療過程中發(fā)揮的潛在作用機制。從其GO、KEGG富集分析結果可見大量與KOA有關的GO功能及KEGG通路顯現(xiàn)出顯著富集，GO富集分析中生物過程占比最多，內容主要富集于炎癥反應、凋亡信號通路有關，KEGG通路主要富集TNF信號通路、HIF-1信號通路、NF-kB信號通路等。TNF信號通路在炎癥反應中起顯著作用，通路中的TNF-α可誘導大量炎癥和分解代謝因子的產生并激活NF-κB信號通路，誘導基質金屬蛋白酶的產生，加速軟骨破壞[14]；HIF-1信號通路可在軟骨細胞處于嚴重缺氧環(huán)境下出現(xiàn)過度激活，抑制軟骨細胞內能量代謝和生物合成，影響軟骨細胞增殖，研究表明缺氧誘導因子參與關節(jié)軟骨的退化過程，在軟骨細胞存活及維持正常缺氧環(huán)境中軟骨細胞的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[18]。以上網絡藥理學結果反映了在KOA疾病進展過程中諸多分子、生物過程及信號通路出現(xiàn)紊亂，涉及炎癥、凋亡、氧化應激等信號通路表現(xiàn)出異?；钴S狀態(tài)。

綜上，本研究借助網絡藥理學方法，初步探究得出加味獨活寄生合劑治療KOA具有多成分、多靶點、多通路的特征，動物實驗驗證其作用機制可能與抗炎癥及抗凋亡相關。但是，本研究仍存在很多不足，動物實驗只選取了少量核心靶點進行驗證，未完全驗證涉及的相關信號通路，這也是今后課題組團隊研究的方向，將進行更加深入的動物實驗及細胞實驗來加以驗證加味獨活寄生合劑治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的作用機制，為加味獨活寄生合劑的臨床合理應用提供更加堅實的理論基礎。