一貫煎通過調(diào)節(jié)Parp-1的翻譯后修飾保護(hù)肝細(xì)胞DNA

張宇佳,葉杰,盧艷琳,3，閆曉風(fēng)，李 華，王曉玲

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室，上海 201203;2.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海 200032)

“感受-修復(fù)-恢復(fù)”模型是機(jī)體對內(nèi)、外源性DNA損傷后做出的一系列反應(yīng)。DNA損傷修復(fù)是保障基因組穩(wěn)定的關(guān)鍵[1]。當(dāng)DNA損傷時(shí)，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly ADP-ribose polymerase 1,Parp-1)作為最明顯的DNA損傷“感受器”被募集到損傷處，無論是對單鏈還是雙鏈DNA斷裂損傷都有快速應(yīng)答能力，在DNA損傷后幾秒到幾分鐘之內(nèi)就被募集到損傷區(qū)[2]。Parp-1被損傷的DNA激活后，首先將腺苷二磷酸核糖單體轉(zhuǎn)移到底物蛋白包括自身上，催化合成多聚腺苷二磷酸核糖(poly ADP-ribose,Par)聚合物，此聚合物大分子作為平臺(tái)募集其它DNA損傷修復(fù)相關(guān)酶，共同參與DNA損傷修復(fù)。Parp-1過度活化可導(dǎo)致DNA碎片化，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡，被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞死亡介導(dǎo)者[3]，但過度抑制Parp-1活性也將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，如腫瘤治療中采用Parp-1抑制劑引發(fā)癌細(xì)胞凋亡[4]。因此，在DNA損傷修復(fù)過程中，Parp-1的活性調(diào)節(jié)對細(xì)胞存活或死亡至關(guān)重要。

肝細(xì)胞是肝臟組織中含量最為豐富的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，約占肝質(zhì)量的80%以及肝臟細(xì)胞總量的80%左右。藥物、酒精、病毒感染以及自身免疫等因素均可能導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，甚至死亡。肝細(xì)胞死亡造成數(shù)量減少既是各種因素所致肝病的病理表現(xiàn)，也是影響疾病預(yù)后的重要因素。氧化應(yīng)激是致肝細(xì)胞損傷、死亡的重要因素之一[5]，可通過損傷細(xì)胞膜、溶酶體、DNA等引發(fā)細(xì)胞損傷和死亡[6-7]。

一貫煎(Yiguanjian decoction,YGJ)是中醫(yī)滋陰柔肝的名方，出自清代醫(yī)家魏之琇的《續(xù)名醫(yī)類案》。方中重用生地黃滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)益肝腎為君，內(nèi)寓滋水涵木之意。當(dāng)歸、枸杞養(yǎng)血滋陰柔肝；北沙參、麥冬滋養(yǎng)肺胃，養(yǎng)陰生津，意在佐金平木，扶土制木，四藥共為臣藥；佐以少量川楝子疏肝理氣。既往研究發(fā)現(xiàn)，YGJ治療慢性肝病的主要作用靶標(biāo)在肝細(xì)胞，其修復(fù)了損傷的肝細(xì)胞，所以沒有造成肝細(xì)胞數(shù)量減少[8]。在此基礎(chǔ)上，本文研究過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)肝細(xì)胞DNA損傷修復(fù)時(shí)，YGJ通過調(diào)節(jié)Parp-1活性保護(hù)肝細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一貫煎制備 YGJ(北沙參9 g、麥冬9 g、當(dāng)歸身9 g、生地黃30 g、枸杞子12 g、川楝子5 g)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑中心一次制備成濃縮液，水浴干燥成流浸膏后由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院真空干燥成干粉，冷藏保存，每克藥粉含生藥2.196 g。稱取0.5 g凍干粉+5 mL DMEM配制成母液，0.45 μm濾膜過濾，分裝，-80 ℃保存。臨用時(shí)，先以無血清DMEM培養(yǎng)液配制成100 g·L-1生藥濃度，再以無血清培養(yǎng)液配制成使用濃度。

1.1.2細(xì)胞 小鼠胚胎來源肝細(xì)胞系BNL CL2(ATCC?TIB-73TM)購自中國科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫。

1.1.3 試劑胎牛血清(Gibco)，DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone)，過氧化氫(H2O2)和HRP-羊抗兔二抗購自凱基生物；一抗：γ-H2AX(ab11174)、Parp1(#227244)、Sirt-1(ab189494)、兔多克隆抗體GAPDH(ab00073877)購自abcam公司，Par(CST，83732s),EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(碧云天)。Cy3-標(biāo)記羊抗兔熒光二抗(威奧，WH1123)，兔抗小鼠一抗Acetylated-Lysine(1 ∶1 000，CST，#9441S)，二抗為羊抗兔HRP-linked二抗(1 ∶5 000，CST，#7074)。

1.2 方法

1.2.1EDU摻入檢測細(xì)胞增殖及γ-H2AX檢測細(xì)胞DNA損傷 1×104個(gè)細(xì)胞種于激光共聚焦皿，培養(yǎng)24 h，加入H2O2或YGJ刺激。干預(yù)后，每孔加入2 μL EDU原液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以4%多聚甲醛(4 ℃預(yù)冷)室溫固定細(xì)胞。洗滌后，0.3% Triton-X-100 PBS冰浴透膜15 min。加入200 μL Click反應(yīng)液，室溫避光30 min。γ-H2AX檢測時(shí)，收集細(xì)胞洗滌后，加入含10%羊血清的PBS封閉液30 min，γ-H2AX一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜。洗滌后，Cy3-標(biāo)記羊抗兔熒光二抗(1 ∶200)，37 ℃，避光孵育2 h。Hoechst33342(1 ∶1 000)，室溫避光孵育6 min標(biāo)記細(xì)胞核。加入抗熒光淬滅劑，ZEISS激光共聚焦成像系統(tǒng)成像，隨機(jī)視野成像5張，以IPP軟件，紅色相對熒光強(qiáng)度(relative fluorescence intensity,RFI)記作γ-H2AX表達(dá)量，同時(shí)檢測Hochest記作總細(xì)胞數(shù)，檢測綠色熒光值記作EDU陽性細(xì)胞，EDU陽性細(xì)胞率/%=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.2Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞按5×105個(gè)/皿接種至60 mm培養(yǎng)皿中，50 mg·L-1YGJ預(yù)處理細(xì)胞，然后按不同時(shí)間點(diǎn)加入終濃度500 μmol·L-1H2O2收集細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化細(xì)胞，離心后，將細(xì)胞重懸在1×Annexin V binding buffer中(確保細(xì)胞濃度1×106L-1)，加入5 μL Annexin V和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，置冰上，輕輕混勻，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.2.38-OhdG比色法檢測細(xì)胞DNA氧化損傷 細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。依據(jù)試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀波長650 nm測讀。

1.2.4Western blot檢測細(xì)胞蛋白質(zhì) 細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h后，加入500 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞，H2O2/YGJ用藥組分別按50 mg·L-1YGJ作用不同時(shí)間，棄上清，收集細(xì)胞，測定蛋白質(zhì)濃度，與SDS上樣緩沖液混合，95 ℃變性5 min；制膠，上樣，電泳，切膠，恒壓70 V轉(zhuǎn)膜1.5 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%BSA/TBST封閉液室溫封閉1.5 h。一抗：Parp1(1 ∶1 000)、Par(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜，分別加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗(1 ∶2 000-1 ∶20 000)，室溫孵育1 h，ECL反應(yīng)后用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.5免疫沉淀(immunoprecipitation,IP) 細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)藥物處理后，RIPA裂解細(xì)胞，測定蛋白質(zhì)濃度，加入兔抗小鼠Parp1一抗(1 ∶200)，另取正常對照組樣本一份，加入兔源IgG(1 μg，碧云天，A7016)作為IgG對照組，3D搖床100 r·min-1混勻過夜。

將beads液加入樣本混合，4 ℃，水平搖床混勻，洗滌、煮沸、離心，取上清做Western blot，一抗為兔抗小鼠Acetylated-Lysine一抗(1 ∶1 000)，二抗為羊抗兔HRP-linked二抗(1 ∶5 000)。

2 結(jié)果

2.1 一貫煎對H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響加入H2O2作用不同時(shí)間，選取3、6、12和24 h時(shí)間點(diǎn)觀察，晚期凋亡的肝細(xì)胞均較正常對照組(19.6%)增加明顯，分別上升到44.5%、56.0%、32.2%和27.8%，YGJ作用后相應(yīng)地分別下降到38.5%、50.5%、29.3%和22.9%，這些結(jié)果顯示H2O2在作用3～6 h細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰，隨后凋亡細(xì)胞減少但仍高于正常對照組；YGJ可減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)作用從3 h一直持續(xù)到24 h(Fig 1)。

2.2 一貫煎對H2O2損傷肝細(xì)胞增殖的影響EDU綠色熒光細(xì)胞陽染代表細(xì)胞增殖。0 h對照組細(xì)胞綠色熒光細(xì)胞陽染率為19.01%±3.19%，加入500 μmol·L-1H2O2作用6 h、12 h和24 h后分別為10.92%±0.48%(P<0.01)、13.39%±1.46%(P<0.05)和17.60%±1.65%；而加入50 mg·L-1YGJ作用6 h、12 h和24 h，細(xì)胞陽染率分別恢復(fù)為16.22%±0.65%(P<0.05)、18.25%±0.23%(P<0.05)和18.35%±1.85%，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)H2O2組比較，6和12 h組差異明顯。這些結(jié)果提示，H2O2可明顯抑制肝細(xì)胞增殖，至6 h增殖能力達(dá)到最低，隨后逐漸恢復(fù)，24 h幾乎恢復(fù)至正常水平；YGJ在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間點(diǎn)都可以明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖(Fig 2)。

Fig 1 Time effects of Yiguanjian decoction on apoptosis of H2O2-induced hepatocytes

2.3 一貫煎對H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞DNA氧化損傷的影響比色法檢測肝細(xì)胞8-羥基脫氧鳥苷(8-OhdG)含量，結(jié)果顯示0 h對照組8-OhdG的吸光度值為0.08±0.02，加入H2O2作用不同時(shí)間，選取3 h、6 h、12 h和24 h時(shí)間點(diǎn)觀察，吸光度值分別上升至0.24±0.01(P<0.01)、0.26±0.00(P<0.01)、0.27±0.02(P<0.01)和0.29±0.02(P<0.01)，顯示H2O2可導(dǎo)致DNA氧化損傷，且持續(xù)存在于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。加入50 mg·L-1YGJ作用6、12和24 h后，細(xì)胞吸光度值分別下降至0.24±0.00(P<0.05vs6 h H2O2)、0.24±0.00和0.26±0.01。結(jié)果可見，YGJ在6 h即可明顯降低8-OhdG含量，12 h和24 h有下降趨勢(Fig 3)。

Fig 2 Time effects of Yiguanjian decoction on proliferation of *P<0.05,**P<0.01 vs 0 h H2O2 group;#P<0.05 vs H2O2 group.Scale bar=10 μm.

Fig 3 Time effects of Yiguanjian decoction on inhibiting H2O2**P<0.01 vs 0 h H2O2 group,#P<0.05 vs H2O2 group.

2.4 一貫煎對H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的影響紅色相對熒光強(qiáng)度(Relative fluorescence intensity,RFI)記作γ-H2AX表達(dá)量。0 h對照組細(xì)胞γ-H2AX含量為1.88±3.25，500 μmol·L-1H2O2作用6、12和24 h后，γ-H2AX含量分別為27.31±1.51(P<0.01)、15.77±2.56(P<0.01)和5.32±0.31，結(jié)果顯示，H2O2在整個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均可明顯提高細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX含量；加入50 mg·L-1YGJ后6 h、12 h和24 h，γ-H2AX含量分別為5.41±0.81(P<0.01)、6.51±1.26(P<0.01)和2.65±1.53，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)H2O2作用比較，在6和12 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，24 h有下降趨勢，表明YGJ在各對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)均可明顯減少H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞γ-H2AX含量(Fig 4)。

2.5 一貫煎對H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)Parp-1含量和Par化修飾的影響500 μmol·L-1H2O2作用3、6、12和24 h后，Parp-1含量分別為0.76±0.09、1.31±0.00(P<0.01)、1.21±0.20(P<0.05)和1.25±0.04(P<0.01)，與0 h對照組(0.79±0.10)比較，從6 h起各時(shí)間點(diǎn)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；加入50 mg·L-1YGJ作用3 h、6 h、12 h和24 h，Parp-1含量分別為1.27±0.13(P<0.01)、1.21±0.20、1.03±0.12和1.04±0.09(P<0.05)，在3 h明顯升高，而24 h明顯降低。以上結(jié)果顯示，H2O2作用6 h后細(xì)胞內(nèi)Parp-1含量明顯增加且持續(xù)至24 h，而YGJ作用3 h后細(xì)胞內(nèi)Parp-1含量增加，12 h后逐漸降低，提示YGJ可使細(xì)胞內(nèi)Parp-1的表達(dá)提前(Fig 5A，B)。

Fig 4 Time effects of Yiguanjian decoction on γ-H2AX **P<0.01 vs 0 h H2O2 group,##P<0.01 vs H2O2 group.Scale bar=10 μm.

H2O2作用3、6、12和24 h后，Parp-1的Par化修飾分別為0.50±0.02、0.95±0.04(P<0.01)、0.7±0.05(P<0.01)和0.74±0.03(P<0.01)，與0 h對照組(0.52±0.02)比較，除3 h外，其余組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；加入YGJ作用3、6、12和24 h后，Parp-1的Par化修飾分別為0.94±0.07(P<0.01)、1.05±0.02(P<0.05)、0.96±0.03(P<0.01)和0.84±0.05(P<0.05)。這些結(jié)果表明，H2O2作用6 h后Parp-1的Par化升高達(dá)到峰值，之后稍有下降，但與0 h對照組比較仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；YGJ在3 h即可明顯增加Parp-1的Par化，同樣至6 h達(dá)到峰值，并均高于各觀察時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)H2O2作用組，提示YGJ可明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Parp-1的Par化修飾(Fig 5C，D)。

2.6 肝細(xì)胞內(nèi)Sirt-1對Par化的影響采用不同濃度Sirt-1激動(dòng)劑SRT1720作用細(xì)胞觀察Parp-1的Par化修飾，結(jié)果可知，與對照組(1.09±0.03)相比，0.01 μmol·L-1SRT1720、0.1 μmol·L-1SRT1720和1 μmol·L-1SRT1720分別為0.86±0.05(P<0.05)、0.43±0.01(P<0.01)和0.41±0.01(P<0.01)，表明SRT1720可明顯降低Parp-1的Par化修飾(Fig 6A-B)。Sirt-1抑制劑EX527作用細(xì)胞觀察Parp-1的Par化修飾，結(jié)果顯示：與對照組(0.31±0.04)相比，0.5、1、2 μmol·L-1EX527分別為0.55±0.07、0.54±0.04(P<0.05)和0.60±0.06(P<0.05)，表明EX527可明顯提高Parp-1的Par化修飾(Fig 6C-D)。這些結(jié)果表明，Sirt-1在Parp-1活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。

Fig 5 Effects of Yiguanjian decoction on Parp-1 and its PARylation in hepatocytes induced by n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs 0 h H2O2 group,#P<0.05,##P<0.01 vs H2O2 group.

2.7 一貫煎對H2O2損傷肝細(xì)胞內(nèi)Parp-1乙酰化的影響H2O2作用3、6、12和24 h后，乙?；揎椀腜arp-1分別為0.48±0.02、2.09±0.08(P<0.01)、1.67±0.11(P<0.01)和0.63±0.02(P<0.05)，與0 h對照組(0.49±0.01)相比，從6 h開始Parp-1乙?；揎椩黾?，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；加入50 mg·L-1濃度YGJ作用3、6、12和24 h后，乙酰化修飾的Parp-1分別為1.49±0.01(P<0.01)、0.78±0.02(P<0.01)、0.71±0.02(P<0.01)和0.43±0.04(P<0.05)。這些結(jié)果表明，H2O2作用后肝細(xì)胞內(nèi)Parp-1的乙?；揎椩? h達(dá)峰值，隨后逐漸減低但仍高于0 h對照組；而YGJ作用后使其峰值提前至3 h且迅速下降，至6 h之后均低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對照組。

Fig 6 Effects of agonist and inhibitor of Sirt-1 on Parp-1 protein n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control.

3 討論

活性氧可誘發(fā)DNA中鳥嘌呤第8位碳原子上的氫原子羥基化(8-OhdG)，是導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA損傷重要的因素之一[9]。本文中，肝細(xì)胞內(nèi)8-OhdG含量隨H2O2作用時(shí)間延長而逐步升高；γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂較為敏感的生物標(biāo)志物[10]，隨H2O2作用時(shí)間延長其含量也相應(yīng)升高，表明H2O2可導(dǎo)致肝細(xì)胞DNA氧化和雙鏈斷裂等損傷、抑制細(xì)胞增殖，最終引發(fā)肝細(xì)胞凋亡；而YGJ可明顯拮抗H2O2誘導(dǎo)DNA損傷。

Fig 7 Effects of Yiguanjian decoction on Parp-1 acetylation induced by H2O2 in n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs 0 h H2O2 group,#P<0.05,##P<0.01 vs H2O2 group.

細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷有一定的修復(fù)機(jī)制，Parp-1作為DNA損傷感受器，可快速應(yīng)答DNA損傷，啟動(dòng)修復(fù)過程。Parp-1自身的Par化修飾對DNA損傷修復(fù)至關(guān)重要。本研究表明，H2O2作用6 h即可明顯增加Parp-1含量以及Parp-1的Par化，表明H2O2誘導(dǎo)DNA損傷后肝細(xì)胞可迅速啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制；H2O2作用自6～24 h，Parp-1表達(dá)均處于高位，但Par化自6 h達(dá)到峰值后即降低，兩者不完全一致；YGJ干預(yù)結(jié)果顯示自3 h起即可明顯促進(jìn)Parp-1表達(dá)，早于H2O2單獨(dú)作用，且Par化結(jié)果更顯示YGJ可迅速激活Parp-1活性，促進(jìn)DNA修復(fù)且維持時(shí)間更持久。

去乙?；窼irtuin 1(silent information regulator 1,Sirt-1)是NAD+依賴型的去乙?；?，能夠催化多種蛋白質(zhì)的乙酰賴氨酸進(jìn)行去乙?；磻?yīng)，在染色質(zhì)重塑、基因調(diào)控、代謝、癌癥等相關(guān)疾病及延緩衰老等方面發(fā)揮重要作用[11]。Parp-1與Sirt-1都是參與DNA損傷修復(fù)的重要蛋白質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)彼此之間既相互協(xié)作又相互制約而維持DNA損傷后的平衡修復(fù)，避免Parp-1過度激活或過度抑制，造成細(xì)胞死亡[12]。Parp-1和Sirt-1發(fā)揮酶活性都需要以NAD+作為輔酶，Parp-1對NAD+的親和性較Sirt-1高5～10倍，持續(xù)消耗NAD+，會(huì)導(dǎo)致Sirt-1活性降低，反過來Sirt-1可以直接抑制Parp-1基因的啟動(dòng)子，從而抑制Parp-1表達(dá)和活性[13-14]；另一方面，Parp-1催化產(chǎn)生多聚ADP核糖鏈可招募Sirt-1到達(dá)損傷位點(diǎn)，使染色質(zhì)重塑因子去乙?；鰪?qiáng)ATPase活性，促進(jìn)損傷位點(diǎn)附近核小體松散，推動(dòng)DNA修復(fù)[15]，Parp-1的乙?；筛偁幮砸种芇arp-1泛素化，從而阻遏Parp-1降解，維持Parp-1穩(wěn)定[16]。本研究中YGJ作用后Parp-1的乙酰化在6 h后降低，而其Par化反而升高，這解釋了Parp-1含量隨作用時(shí)間降低而活性卻不降低這一現(xiàn)象。Sirt-1抑制劑EX527可明顯提高Parp-1的Par化，而其激動(dòng)劑可明顯抑制Parp-1的Par化，表明Sirt-1對Parp-1的活性呈負(fù)調(diào)控機(jī)制。

總之，H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞DNA損傷可抑制DNA復(fù)制導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少，細(xì)胞死亡增加，而YGJ可通過調(diào)節(jié)Parp-1修復(fù)損傷的DNA，維持肝細(xì)胞基因組的完整性從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及抵抗H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。