基于 Ca2+-CaMKII 信號通路的濟(jì)川煎治療陽虛便秘的作用及分子機(jī)制

劉 聰，張 悅，張潤濤，荊 然，郭丁丁，倪 艷，康 永

(山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，山西 太原 030045)

陽虛便秘(Yang deficiency constipation)屬中醫(yī)便秘癥范疇，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的結(jié)腸慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)，為功能型便秘的主要分型之一。多數(shù)是由于結(jié)腸傳輸能力減弱、腸神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂所誘發(fā)，主要表現(xiàn)以便次減少、腹脹、排出困難、便意缺乏、大便干燥、久蹲難下為特征的頑固型排便障礙[1]，同時(shí)伴有不同程度的情緒低落、易激惹、失眠、焦慮等抑郁癥狀。隨著病程的遷延不愈會繼發(fā)器質(zhì)性病變，也是結(jié)腸癌、直腸癌、大腸癌的重要危險(xiǎn)因素之一。近年來，隨著人們生活節(jié)律及飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國陽虛便秘的發(fā)病率逐年攀升且呈年輕化趨勢[2]。研究證實(shí)，鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ (calmodulin-dependent protein kinases Ⅱ，CaMKⅡ)調(diào)節(jié)胃腸平滑肌收縮的作用是由鈣離子(Ca2+)誘發(fā)，胃腸神經(jīng)釋放遞質(zhì)促進(jìn)Ca2+與鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)結(jié)合形成 Ca2+- CaM 復(fù)合物與 CaMKⅡ 調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合使其構(gòu)象改變，致使 CaMKⅡ 失活，導(dǎo)致不規(guī)則慢波誘發(fā)的動作電位，使胃腸道平滑肌產(chǎn)生不規(guī)則收縮運(yùn)動，結(jié)腸運(yùn)動遲緩[3]。

濟(jì)川煎為治療陽虛便秘的代表方劑之一，出自明代醫(yī)家張景岳的《景岳全書》，具有溫腎益精、潤腸通便功能，主要治療由腎陽虛弱、精津不足所致的大便秘結(jié)、畏寒怕冷、精神不振等癥，為著名的“寓通于補(bǔ)之劑”，療效確切；并于2018年收入國家中醫(yī)藥管理局會同國家藥品監(jiān)督管理局共同制定的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》(63#)。濟(jì)川煎課題組前期研究證明，濟(jì)川煎具有一定的雄性激素樣作用，可糾正模型動物的腎陽虛狀態(tài)及明顯的促排便作用，均與機(jī)體激素分泌、環(huán)核苷酸系統(tǒng)紊亂存在密切關(guān)系[4-5]。本研究通過建立陽虛便秘大鼠模型，結(jié)合相關(guān)蛋白差異表達(dá)，分析濟(jì)川煎調(diào)控Ca2+- CaMKII 信號途徑達(dá)到治療陽虛便秘作用及分子機(jī)制，從而為濟(jì)川煎臨床治療陽虛便秘提供新靶點(diǎn)、新途徑及可靠的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康SD大鼠，SPF級，120只，♀♂各半，體質(zhì)量(200±20) g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，SCXK(京)2016-0002，批號：1103241911021763。動物飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，室溫維持在(20～25) ℃，相對濕度40%～45%，晝夜明暗交替時(shí)間12/12 h。實(shí)驗(yàn)動物用常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)動物用水為純凈水；實(shí)驗(yàn)動物墊料為木質(zhì)刨花墊料；飼養(yǎng)籠和飼養(yǎng)墊料每周更換1次，期間對飼養(yǎng)籠采取清洗滅菌處理。

1.2 藥物與試劑濟(jì)川煎(JCJ，肉蓯蓉 9 g、當(dāng)歸 9 g、牛膝 6 g、枳殼 3 g、澤瀉 4.5 g、升麻 3 g)，藥物飲片購自于山西省中醫(yī)院中藥房，生藥水溶液最終濃度為1.725 kg·L-1，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ｈ蹤此崮潮乩?魯南貝特制藥有限公司，批號：215130511，規(guī)格 5 mg × 24 片)；復(fù)方地芬諾酯片(仁和堂藥業(yè)有限公司，批號：190202，規(guī)格：100 片/瓶)；白醋(總酸度為 6 g / 100 mL，上海寶鼎釀造有限公司生產(chǎn)，批號：20191203)；活性炭粉末(河南省淼源水處理材料有限公司生產(chǎn)，批號：20190405)；RNA提取試劑盒(QIAGEN/Gmb，Lot：163048069)；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche，Lot：43112721)；QuantiNova SYBR Green PCR Kit(500)(QIAGEN/Gmb，Lot：163039888)；增強(qiáng)型RIPA裂解液(武漢博士德生物工程有限公司，Lot：15G23C02)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，Lot：15F08A46)；飛克特超敏ECL發(fā)光液(Meilunbio，Lot：MAO186-Dec-31E)；鼠單抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司，BM0627)、兔多單抗CaMKⅡβ(Abcam，ab34703)、鼠單抗CaMKⅡγ(Abcam，ab201966)、鼠單抗CaMKⅡδ(Abcam，ab181052)、鼠單抗CaMKⅡ(Abcam，ab22609)、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司，BA1051)；Rat cAMP ELISA Kit(Bioswamp，Exp：202102)；Rat cGMP ELISA Kit(Bioswamp，Exp：202102)。

1.3 儀器Cytation-5多模式微孔板檢測儀(美國BioTek)；Navios 10 COLORS/3 LASER流式細(xì)胞儀(美國貝克曼)；PM.10AD光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；T25數(shù)顯高速勻漿機(jī)(德國IKA)；WT-L6K 迷你離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)；Veriti-96 PCR(美國ABI)；7500 Real-Time PCR System(美國ABI)；Allegra X-30R centrifuge(美國ABI)；HD2高能成像分析儀(美國阿爾法)；Mini-sub Cell電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD)；Mini-sub Cell水平電泳槽(美國BIO-RAD)；凝膠成像儀 (日本Fuji)；全能型蛋白快速轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD)。

2 方法

2.1 模型制備健康SD大鼠120只，♀♂各半。取100只大鼠，按每只首劑量5 mL給予4 ℃白醋(總酸6%)灌胃，從第二次開始按 15 mL·kg-1體質(zhì)量給予4 ℃白醋，兩次間隔1 d，共9次。在每次給予白醋后d 2，按25 mL·kg-1體質(zhì)量灌胃給予每只大鼠 16.67 mol·L-1的0 ℃活性炭冰水(活性炭300目)，亦9次；于造模開始d 14，每只大鼠在灌胃結(jié)束3 h后加灌復(fù)方地芬諾酯(20 mg·kg-1)，連續(xù)5 d[6-7]。同時(shí)滿足兩條判定標(biāo)準(zhǔn)視為模型成功：①根據(jù)造模大鼠一般評分標(biāo)準(zhǔn)，大于2～3分；②首粒黑便排出時(shí)間大于空白組均數(shù)。

2.2 分組及給藥濟(jì)川煎一日臨床推薦口服生藥量為34.5 g，按人60 kg體質(zhì)量計(jì)算，34.5 g/60 kg=0.575 g·kg-1，則大鼠等效劑量(中劑量)為：0.575 g·kg-1×7.5倍=4.31(生藥)g·kg-1，得到高劑量8.62(生藥)g·kg-1，低劑量為2.16(生藥)g·kg-1。將模型成功大鼠隨機(jī)分為5組，即模型對照組、莫沙必利組(1.88 mg·kg-1)、濟(jì)川煎高(8.26 g·kg-1)、中(4.31 g·kg-1)、低(2.16 g·kg-1)劑量組，每組10只，灌胃給藥每日1 次，連續(xù)7 d；另取10只健康大鼠為空白組?？瞻捉M和模型組給予等體積的生理鹽水。末次給藥結(jié)束，室溫制備血清，-20 ℃保存?zhèn)溆貌⒄〗Y(jié)腸組織制備結(jié)腸平滑肌單細(xì)胞懸液。

2.3 一般狀態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)開始后觀察各組動物形體、皮膚毛發(fā)、行為狀態(tài)、情緒反應(yīng)、大便數(shù)量、性狀等變化，并按表(Tab 1)評分每天記錄每只實(shí)驗(yàn)動物的一般狀態(tài)及末次體質(zhì)量。

Tab 1 Score sheets by performance status of rats

2.4 排便功能測定末次給藥結(jié)束，禁食不禁水12 h，稱質(zhì)量，定量給予各組大鼠16.67 mol·L-1的0 ℃活性炭冰水灌胃，立刻將實(shí)驗(yàn)動物逐只置于代謝籠內(nèi)進(jìn)行觀察，記錄首粒排黑便時(shí)間及6 h內(nèi)排黑便粒數(shù)。

2.5 大鼠結(jié)腸平滑肌鈣離子(Ca2+)濃度測定把經(jīng)過分離處理的結(jié)腸平滑肌細(xì)胞置入負(fù)載液內(nèi)(由0.2 g·L-1Pluronic F-127與8.5μmol·L-1的 Fluo-3AM 混制而成)，在37 ℃條件下，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(95% O2，5% CO2)內(nèi)孵育1 h后在1 000 r·min-1條件下進(jìn)行5 min的離心處理，棄上清。選擇無染料的PBS對細(xì)胞進(jìn)行沖洗，離心棄上清，洗2次。在37 ℃條件下，把經(jīng)過負(fù)載處理的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5 h，然后選擇流式細(xì)胞儀作檢測處理：發(fā)射光、激光波長分別為528 nm、488 nm，采用Cell Quest 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、分析。

2.6 RT-PCR法檢測各組大鼠結(jié)腸組織中CaM、CaMKII亞型收集細(xì)胞，離心2 000g,5 min，去上清液，標(biāo)記細(xì)胞樣本放置-20 ℃?zhèn)溆?。按照RNA提取試劑盒說明書配置工作液并標(biāo)記日期，樣本常溫融化后用200 μL PBS重懸，加入400 μL Lysis Binding Buffer，渦旋15 s后將樣本轉(zhuǎn)移至組合套管內(nèi)，離心10 000r，棄廢液，每個(gè)樣本加入100 μL混合液(DNaseI incubation 90 μL+DNaseI 10 μL)，常溫孵育15 min 后加入500 μL wash Buffer I，離心棄液，加入500 μL wash Buffer Ⅱ，離心棄液，加入200 μL wash Buffer Π，離心3 min，17 000r，棄液，將內(nèi)管轉(zhuǎn)至去蓋的1.5 mL離心管中，打開內(nèi)管的蓋子3～5 min后加入60 μL Elution Buffer，常溫孵育5 min，離心2 min，后收集內(nèi)管的總RNA，置于-80 ℃保存。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒，常溫融化試劑和樣本，配置工作液按照說明書加入液體，在Veriti 96 PCR儀器進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 置于-20 ℃保存。用PCR-water 按照說明稀釋目標(biāo)引物至10 μmol·L-1，按熒光定量PCR檢測試劑盒說明書加入試劑，擴(kuò)增，共40個(gè)循環(huán)(95 ℃，10 s 和59.5 ℃，34 s)，引物序列見Tab 2。

Tab 2 Primer sequence of target gene

2.7 Western blot檢測各組大鼠結(jié)腸組織中 CaM、CaMKⅡ 亞型按照比例將蛋白酶抑制劑和細(xì)胞裂解液加入裝有結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的 EP 管中，4 ℃，12 000 轉(zhuǎn) 離心15 min，取上清，即得總蛋白。采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。調(diào)整各組蛋白為統(tǒng)一濃度，用 4×SDS緩沖液稀釋(按照3 ∶1比例)取出的上樣量后，100 ℃煮沸10 min，將電泳緩沖液加入電泳槽內(nèi)，然后緩慢加入樣品，參照蛋白Maker位置，當(dāng)目的條帶到達(dá)最佳凝膠分離區(qū)時(shí)，停止電泳，立刻轉(zhuǎn)印至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜置入5%脫脂奶粉的封閉溶液中封閉2 h。加入 CaM、CaMKII亞型的一抗中4 ℃搖床孵育過夜，次日取膜，洗膜脫3次，每次5 min。后將膜放入相應(yīng)二抗中，室溫孵育1 h。之后再次TBST搖床洗脫每次5 min，3次。將配置好的發(fā)光液均勻加到PVDF膜上，暗室發(fā)光。利用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

2.8 ELISA法檢測大鼠血清中 cAMP、cGMP含量-20 ℃取出大鼠血清，室溫溶解，按照 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行預(yù)處理，每孔設(shè)置復(fù)孔，微孔板檢測儀450 nm進(jìn)行測定。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)觀察Tab 3結(jié)果顯示，造模期間，空白組皮毛光亮，活動自如、靈敏，體質(zhì)量增長持續(xù)、穩(wěn)定；實(shí)驗(yàn)組大鼠造模開始后出現(xiàn)明顯腹脹、反應(yīng)遲鈍、活動減少、倦怠蜷縮，隨著造模時(shí)間增長繼而出現(xiàn)攝食飲水量減少，排便減少，腹脹的表現(xiàn)，同時(shí)飼養(yǎng)籠墊料濕度明顯增大，評分明顯升高(P<0.01)；在造模d 14加灌復(fù)方地芬諾酯后，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)排便粒數(shù)驟減的狀況，大便干硬狀若米粒，體質(zhì)量降低明顯(P<0.001)，提示模型成功。濟(jì)川煎的高、中劑量組給藥后狀態(tài)緩解(P<0.01)，體質(zhì)量增長明顯(P<0.05)。

Tab 3 Effect of JCJ on performance status and

3.2 排便功能測定Tab 4結(jié)果顯示，模型組大鼠的首粒排便時(shí)間推遲，6 h內(nèi)排便粒數(shù)明顯減少(P<0.01)；莫沙必利組及濟(jì)川煎各劑量組首粒排便時(shí)間明顯縮短，排便粒數(shù)明顯增加(P<0.05或P<0.01)。

Tab 4 Effect of JCJ on defecation function of rats n=10)

3.3 大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定如Fig 1鑒定結(jié)果顯示，紅色熒光為α-SMA陽性，陽性率>90%，即：結(jié)腸平滑肌細(xì)胞純度>90%，提示可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 1 Cells from colonic smooth muscle of rats and identified by immunofluorescence staining

3.4 濟(jì)川煎對模型大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞Ca2+濃度的影響Tab 5結(jié)果顯示，模型組[Ca2+]i明顯升高(P<0.01)；經(jīng)過不同劑量的濟(jì)川煎干預(yù)，結(jié)腸平滑細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i明顯下降(Fig 2)，且呈劑量依賴性 (P<0.05或P<0.01)。

Tab 5 Effect of JCJ on intracellular Ca2+ concentration from colonic smooth muscle cells of rats

3.5 濟(jì)川煎對模型大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)CaM、CaMKⅡ 亞型 mRNA 表達(dá)的影響Tab 6 結(jié)果顯示，模型組CaM及CaMKⅡ β、γ、δ亞型mRNA表達(dá)較空白組明顯升高(P<0.05或P<0.01)；濟(jì)川煎各劑量對模型大鼠進(jìn)行干預(yù)治療后，CaM及CaMKⅡ β、γ、δ亞型mRNA都明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

3.6 濟(jì)川煎對模型大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞CaM、CaMKⅡ亞型蛋白表達(dá)的影響Tab 7結(jié)果顯示，模型組CaM及CaMKⅡ β、γ、δ亞型蛋白表達(dá)較空白組明顯升高(P<0.01)；濟(jì)川煎各劑量組給藥后，CaM及CaMKⅡ β、γ、δ亞型蛋白表達(dá)均明顯降低(Fig 3)，尤以中、高劑量組明顯(P<0.05或P<0.01)。

Tab 6 The mRNA expression of CaM and CaMKⅡ subtypes analyzed by RT-PCR

Tab 7 The protein expression of CaM and CaMKⅡ subtypes analyzed by Western blot

Fig 2 Effect of JCJ on intracellular Ca2+ concentration from colonic smooth muscle cells of ratsA：Normal group；B：Model group；C：Mosapride citrate group ( 1.88 mg·kg-1)；D：JCJ low-does group ( 2.16 g·kg-1)；E：JCJ middle-does group( 4.31 g·kg-1)；F：JCJ high-does group( 8.26 g·kg-1).

Fig 3 Effect of JCJ on protein expression of CaM and CaMKⅡ subtypes in colonic smooth muscle cells of ratsA：Normal group；B：Model group；C：JCJ low-does group( 2.16 g·kg-1) ；D：JCJ middle-does group( 4.31 g·kg-1)；E：JCJ high-does group( 8.26 g·kg-1);F：Mosapride group( 1.88 mg·kg-1).

3.7 濟(jì)川煎對模型大鼠血清中cAMP、cGMP含量及其比值的影響Tab 8 結(jié)果表明，與空白組相比，模型組cAMP含量明顯下降，cGMP 含量明顯升高(P<0.01)；給藥后，濟(jì)川煎中、高劑量組可增加cAMP含量，減少cGMP的含量，cAMP/cGMP比值增加明顯(P<0.05或P<0.01)。

Tab 8 Effect of JCJ on content of cAMP，cGMP in serum of rats

4 討論

4.1 流行病學(xué)及病因病機(jī)陽虛便秘證以女性及老年人為主要高發(fā)人群，是由于腎臟受邪，虛而津液枯燥，致令腸胃干燥，傳導(dǎo)糟粕能力減弱，故大便難下。大量的基礎(chǔ)和臨床研究表明，導(dǎo)致陽虛便秘的危險(xiǎn)因素主要包括：精神壓力、濫用藥物、運(yùn)動量減少、胃腸傳輸功能減弱、腸神經(jīng)遞質(zhì)分泌合成受阻、腸道菌群功能紊亂等，其中胃腸傳輸功能減弱是引起該疾病的主要原因。所以，針對由于胃腸傳輸功能減弱引發(fā)的且癥狀輕微者進(jìn)行藥物導(dǎo)瀉治療，長期使用會出現(xiàn)毒副作用，并對藥物產(chǎn)生明顯耐受；對癥狀嚴(yán)重的患者進(jìn)行手術(shù)治療，但術(shù)后并發(fā)癥的產(chǎn)生或無明顯癥狀改善等情況時(shí)有發(fā)生，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及精神狀態(tài)，還會加重患者家庭及社會負(fù)擔(dān)。因此，尋找新的治療陽虛便秘的靶向藥物至關(guān)重要，而中醫(yī)藥在治療陽虛便秘上顯示出獨(dú)特優(yōu)勢。

4.2 陽虛便秘與陰陽“二元論”關(guān)系陽虛便秘主要是指腎陽虛便秘，與HPA軸、甲狀腺軸及性腺軸的紊亂密切相關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)采用白醋與0 ℃活性炭冰水聯(lián)合復(fù)方地芬諾酯片復(fù)制腎陽虛便秘大鼠模型。造模后，大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、被毛疏松、精神倦怠、弓背蜷縮、肢涼尾冷、自主活動減少、排便驟減且質(zhì)硬等明顯的“陽虛及便秘體征”。研究證明，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)參與細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)，具有相互拮抗作用，CAMP和cGMP的相對平衡有益于維持機(jī)體的穩(wěn)定生理狀態(tài)，據(jù)此提出生物控制二元論，即陰陽學(xué)說[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組cAMP明顯降低，cGMP明顯增加，且cAMP/cCMP比值明顯降低，表明大鼠機(jī)體環(huán)核苷酸系統(tǒng)失衡，腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)受到抑制；給予濟(jì)川煎后，血清cAMP含量明顯升高，cGMP明顯降低，cAMP/cGMP比值明顯升高，表明濟(jì)川煎可以改善機(jī)體環(huán)核苷酸系統(tǒng)失衡狀態(tài)及腸道傳輸功能，增加排便量。

4.3 CaMKⅡ 與陽虛便秘密切相關(guān)CaMKⅡ是一種多功能、作用底物廣泛的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化蛋白激酶，具有α、β、γ、δ 4個(gè)不同轉(zhuǎn)錄亞基，主要調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動、肌肉收縮、細(xì)胞周期控制等。研究發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ的4種亞基進(jìn)行選擇性拼接可以形成同源多聚體和異源多聚體，且功能強(qiáng)大，由3個(gè)單元域組成，即高度保守的氨基端催化域、變化較多的中間連接域及羧基端結(jié)合域，其中羧基端結(jié)合域與4種亞基會形成六元環(huán)結(jié)構(gòu)對CaMKⅡ感受Ca2+信號的振幅和頻率產(chǎn)生重要影響；中間連接域大小發(fā)生的變化影響CaMKⅡ?qū)︹}信號的頻率敏感性；氨基端催化域呈放射結(jié)構(gòu)對蛋白與CaMKⅡ的結(jié)合起到關(guān)鍵作用[8]。當(dāng)胞內(nèi) Ca2+濃度升高形成Ca2+-CaM復(fù)合物，導(dǎo)致CaMKⅡ的β、γ、δ亞基發(fā)生快速磷酸化激活 CaMKⅡ 產(chǎn)生活性[9-10]；當(dāng)Ca2+濃度下降或CaM從CaMKⅡ解離后，而發(fā)揮抑制功能[12]。本實(shí)驗(yàn)中，采用FCM技術(shù)對濟(jì)川煎干預(yù)陽虛便秘模型大鼠的結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中Ca2+濃度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)模型組Ca2+濃度較空白組明顯升高，推測是由于 Ca2+- CaM 復(fù)合物增多，直接或間接激活CaMKⅡ產(chǎn)生活性，導(dǎo)致結(jié)腸平滑肌收縮障礙；給予濟(jì)川煎后，胞內(nèi)Ca2+濃度下降明顯，表明濟(jì)川煎能夠有效降低結(jié)腸平滑肌胞內(nèi)Ca2+增多現(xiàn)象，而莫沙必利組則對胞內(nèi)Ca2+變化無明顯的調(diào)節(jié)作用。隨后，采用 RT-PCR及Western blot法對胞內(nèi)CaM、CaMKⅡ亞型蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)模型組 CaM、CaMKⅡ的β、γ、δ亞型確有在結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，且較空白組均明顯增多，在給予濟(jì)川煎后下降明顯，表明濟(jì)川煎對 CaM、CaMKⅡ的β、γ、δ亞型具有明確的直接或間接的調(diào)節(jié)作用；同樣，莫沙必利組對CaMKⅡ的β、γ、δ亞型較空白組無明顯的調(diào)節(jié)作用，推測莫沙必利促進(jìn)胃腸蠕動與調(diào)節(jié) CaMKⅡ無關(guān)。

本研究結(jié)果表明，濟(jì)川煎作用于陽虛便秘模型大鼠，可明顯緩解造模出現(xiàn)的明顯腹脹、反應(yīng)遲鈍、活動減少、倦怠蜷縮及排便減少狀態(tài)，縮短排便時(shí)間，增加排便粒數(shù)；并明顯降低模型大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、CaM、CaMKⅡ β、γ、δ的表達(dá)；濟(jì)川煎還能明顯恢復(fù)機(jī)體環(huán)核苷酸系統(tǒng)紊亂狀態(tài)。提示，濟(jì)川煎可能是通過調(diào)控Ca2+-CaMKⅡ信號通路達(dá)到治療陽虛便秘的目的，或成為陽虛便秘潛在的臨床生物標(biāo)志物，但其可行性尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。