兒茶素干預(yù)硬脂酰輔酶A去飽和酶-1表達(dá)抗小鼠肝纖維化損傷

萬(wàn) 星，陶柏楠，邵文翠，金錚鈺，黃德斌，袁 林

(湖北民族大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)部、2.風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000)

肝纖維化(liver fibrosis,LF)是肝臟中激活的肌成纖維細(xì)胞(主要是肝星狀細(xì)胞)分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白產(chǎn)生纖維性瘢痕的病理過(guò)程。肝纖維化若不及時(shí)治療會(huì)向肝硬化肝癌發(fā)展，最終引起死亡[1]。目前，針對(duì)肝纖維化的高效藥特別少，因此需要開(kāi)發(fā)新的高效和特異性的藥物來(lái)預(yù)防或治療肝纖維化，尤其是晚期肝纖維化，即所有慢性肝病的有害下游。肝纖維化發(fā)生機(jī)制和涉及的基因眾多，但隨著社會(huì)環(huán)境及生活方式改變，非酒精性脂肪肝誘導(dǎo)的肝纖維化人數(shù)大量增多，在對(duì)非酒精性脂肪肝機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝中的脂肪酸作為新機(jī)制與肝纖維化關(guān)系密切，如：脂肪酸可影響肝星狀細(xì)胞凋亡[2]，肝星狀細(xì)胞活化釋放基質(zhì)需要巨大能量，為了滿足這一需求，肝星狀細(xì)胞發(fā)生代謝重編程，包括warburg效應(yīng)、脂質(zhì)代謝增加等[3-4]。因此，本研究著重探討兒茶素(catechin,CA)對(duì)脂質(zhì)代謝這一新機(jī)制的影響，CA最早在茶葉中被提取研究，后研究人員發(fā)現(xiàn)其存在多種中草藥中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管等作用[5～7]。課題組在前期研究鬼箭羽醇提物抗肝纖維化功效時(shí)，發(fā)現(xiàn)CA抗纖維化的效能極高[8]，后通過(guò)基因芯片篩查差異性基因，硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1)引起我們關(guān)注，SCD1是脂肪酸代謝限速酶，催化飽和脂肪酸變成單不飽和脂肪酸，影響脂質(zhì)代謝[9-10]，加之文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)CA可干擾脂質(zhì)代謝抗酒精性脂肪肝[11]，因此，我們合理提出假說(shuō)：CA可能通過(guò)影響SCD1表達(dá)干擾脂質(zhì)生成抗肝纖維化，通過(guò)實(shí)驗(yàn)論證，為進(jìn)一步討論CA抗肝纖維化機(jī)制奠定基礎(chǔ)并為L(zhǎng)F治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物C57BL /6 小鼠，♂，體質(zhì)量(18±2) g，SPF級(jí)，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。

1.2 藥物與試劑(+)-兒茶素(上海源葉生物，LOT：P20O7F23087)；CCl4(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，臨用前溶于橄欖油)；AST/ALT試劑盒(南京建成，AST批號(hào)：20201219，ALT批號(hào)：20201221)；TG試劑盒(南京建成，批號(hào)：20210603)；鼠SCD1(英國(guó)Abcam，LOT:GR3297026-12)；內(nèi)參GAPDH一抗和二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser(日本Takara，LOT:AJ60796A)、TB Greenpremix EX TaqTMⅡ(日本TaKaRa，LOT：AI62517A)；油紅O套盒(Biossci,BP037)。

1.3 儀器顯微鏡(Nikon E200，日本)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan GO，美國(guó))；蛋白電泳電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad，美國(guó))；冰凍切片機(jī)(Thermo，美國(guó))；正置顯微鏡(Olympus CX-31，日本)。

1.4 方法

1.4.1藥物配制 CA濃度400、200、100 mg·kg-1。稱取500 mg CA加生理鹽水31.25 mL配成高劑量16 g·L-1，稱取500 mg CA加生理鹽水62.5 mL配成中劑量8 g·L-1，在配好的中劑量中取15 mL加生理鹽水稀釋至30 mL配成低劑量4 g·L-1，水飛薊賓給藥劑量200 mg·kg-1，按上述方法配成8 g·L-1。每管溶液約為8只小鼠1周的使用量。

1.4.2實(shí)驗(yàn)分組與模型 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為6組：對(duì)照組(normal group,NG)、CCl4組、100 mg·kg-1CA組(CA-L)、200 mg·kg-1CA組(CA-M)、400 mg·kg-1CA組(CA-H)、200 mg·kg-1水飛薊賓組(Sil)。模型組小鼠腹腔注射含 25% CCl4的橄欖油溶液 1.6 mL·kg-1，每周 2 次，共6周。藥物組在造模同時(shí)，前3周給小鼠灌胃CA和水飛薊賓，每次灌0.5 mL，正常組灌胃等體積生理鹽水。所有小鼠6周后禁食不禁水，24 h后處死，按要求做后續(xù)操作。

1.4.3肝臟外觀和肝指數(shù)測(cè)定 稱質(zhì)量，小鼠眼球采血，頸椎脫臼處死，取出肝臟，用高倍相機(jī)在同背景同視野下拍大體形態(tài)。肝指數(shù)/%=肝臟質(zhì)量(g) /體質(zhì)量(g)×100%。

1.4.4血清學(xué)指標(biāo) ALT、AST、TG按照南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.5HE染色、Masson染色、α-SMA和Collagen Ⅰ免疫組織化學(xué) 參照本課題組已發(fā)表文章[8]。

1.4.6油紅O染色 10%甲醛固定標(biāo)本，冰凍切片，厚約6～10 μm,蒸餾水稍洗；將固定好的切片入60%異丙醇中漂洗30 s，取油紅O儲(chǔ)備液6 mL，加蒸餾水4 mL，混合后靜置10 min，即可用來(lái)染色，染色時(shí)間8 min，60%異丙醇稍洗去多余染液，蒸餾水洗；用濾紙將切片周?chē)帜ǜ?，專用封片劑進(jìn)行封片。

1.4.7QPCR檢測(cè)SCD1的表達(dá) 約稱取30 mg小鼠肝臟，加1 mL TRIzol研磨，靜置5 min，4 ℃，12 000 r·min-1，離心8 min，取800 μL上清，加160 μL氯仿，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r·min-1,離心10 min，取400 μL上清轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的EP管，加等體積異丙醇，混勻，靜置10 min，4 ℃，12 000 r·min-1,離心15 min，倒掉上清，扣干，加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃，12 000 r·min-1,離心10 min，倒掉上清，扣干，風(fēng)干。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄1 000 ng RNA，再進(jìn)行40循環(huán)的PCR，SCD1引物：F:5′-TTCGTTGCCACTTTCTTGCG-3′，R:5′-AAGTTGATGTGCCAGCGGTA-3′，GAPDH引物：F:5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′,R:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。以2-ΔΔCt計(jì)算表達(dá)。

1.4.8Western blot檢測(cè)SCD1的表達(dá) 參照本課題組已發(fā)表文章[8]，SCD1一抗?jié)舛? ∶1 000，二抗?jié)舛? ∶10 000。

1.4.9分子對(duì)接技術(shù)檢測(cè)CA與SCD1的互作 用Schrodinger先畫(huà)出2D結(jié)構(gòu)的CA，再轉(zhuǎn)變成3D結(jié)構(gòu)的CA，用CHARMm力場(chǎng)對(duì)受體結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化；靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)利用Discovery Studio中的BLAST Search(DS Server)模塊獲得，然后使用cdocker方法執(zhí)行分子對(duì)接，并使用Discovery Studio的智能最小化器最小化算法進(jìn)行最小化，在計(jì)算結(jié)束時(shí)保存每個(gè)配體的十個(gè)得分最高的構(gòu)象，最后，對(duì)CA化合物與SCD1的結(jié)合物進(jìn)行自由能計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 CA對(duì)肝纖維化小鼠肝指數(shù)的影響肝纖維化會(huì)損傷肝臟。肝腫脹是肝損指標(biāo)之一，肝指數(shù)可部分反應(yīng)肝臟腫脹程度。CCl4組肝指數(shù)高于正常組(P<0.01)，不同濃度CA量效依賴地降低CCl4引起地肝指數(shù)升高(P<0.01)，水飛薊賓也降低了CCl4引起地肝指數(shù)升高(P<0.01)，同劑量CA和水飛薊賓的作用無(wú)差異，見(jiàn)Fig 1。

2.2 CA對(duì)對(duì)肝纖維化小鼠肝臟形態(tài)的影響肝臟受損還可通過(guò)顏色、表面光滑度、組織結(jié)構(gòu)來(lái)觀察。HE染色可以觀察炎癥水腫、組織結(jié)構(gòu)異常。正常組小鼠肝臟表面光滑，無(wú)褶皺，呈紅褐色，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，CCl4組小鼠肝臟表面出現(xiàn)凹陷褶皺，泛白，出現(xiàn)明顯水腫，有炎癥浸潤(rùn)，肝小葉被破壞，假小葉生成，CA組呈濃度梯度地減少泛白水腫和炎性浸潤(rùn)，Sil組也減少水腫、炎癥，減少肝損，相同劑量CA和Sil作用無(wú)差別，見(jiàn)Fig 2。

2.3 CA對(duì)肝纖維化小鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響ALT、AST是肝損金指標(biāo)。肝纖維化越嚴(yán)重對(duì)肝臟損害越大。CCl4組較正常組ALT、AST明顯升高(P<0.01)，CA可量效依賴地降低其表達(dá)(P<0.01)，Sil也可降低其表達(dá)(P<0.01)，同劑量CA降低數(shù)值大于Sil，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)Fig 3。

Fig 1 Effect of different doses of CA and **P<0.01 vs NG;#P<0.05 vs CCl4,##P<0.01 vs CCl4

Fig 2 Effect of different doses of CA and Sil on liver morphology and HE staining A:liver morphology,B：HE staining

2.4 CA對(duì)肝纖維化小鼠α-SMA和細(xì)胞外基質(zhì)膠原的影響肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化的關(guān)鍵，α-SMA是星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志，CollagenⅠ是肝星狀細(xì)胞激活后釋放的主要的細(xì)胞外基質(zhì)。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)α-SMA和CollagenⅠ的表達(dá)，可反映肝纖維化的程度。CCl4組α-SMA和CollagenⅠ明顯升高(P<0.01)，CA可量效依賴地降低二者的表達(dá)，Sil也可以減少其表達(dá)(P<0.01)。為了證明細(xì)胞外基質(zhì)膠原的變化，同時(shí)使用了Masson染色觀察膠原堆積，正常組無(wú)膠原生成，CCl4組大量膠原生成，CA組呈濃度梯度地減少膠原生成，Sil組也減少膠原的生成，相同劑量CA和Sil作用無(wú)差別，見(jiàn)Fig 4。

Fig 3 Effect of different doses of CA and Sil on ALT and AST **P<0.01 vs NG;##P<0.01 vs CCl4

2.5 CA對(duì)肝纖維化小鼠脂質(zhì)的影響為檢測(cè)肝纖維化時(shí)脂質(zhì)變化，我們采用油紅O染色檢測(cè)脂質(zhì)堆積情況，試劑盒檢測(cè)甘油三酯生成。CCl4組較正常組脂質(zhì)明顯增多，CA量效依賴地降低脂質(zhì)合成，Sil也降低脂質(zhì)合成；為了進(jìn)一步量化脂質(zhì)含量，檢測(cè)了血清中TG含量，CCl4組較正常組TG明顯增多(P<0.01)，CA量效依賴地降低TG合成，Sil也降低TG合成(P<0.01)，同劑量CA降低地?cái)?shù)值更多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)Fig 5、Fig 6。

2.6 CA對(duì)肝纖維化小鼠SCD1的影響CCl4組中小鼠肝臟脂質(zhì)發(fā)生變化，而SCD1是脂質(zhì)代謝的限速酶，于是利用QPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)SCD1mRNA和蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)CCl4組中SCD1在mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.01)，CA量效依賴地降低其表達(dá)，Sil也降低其表達(dá)(P<0.01)，同劑量CA和Sil對(duì)SCD1的結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)Fig 7。

2.7 CA與SCD1的作用方式為了弄清CA是否能靶向作用SCD1蛋白，在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用分子對(duì)接技術(shù)，初步檢測(cè)CA與SCD1是否存在直接作用并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA與SCD1的結(jié)合親和力較高(-5.4 kcal·mol-1)，觀察到SCD1有4個(gè)氫鍵(Arg74,Asn148,Trp184和Val187)，還有6個(gè)氨基酸通過(guò)范德華力和CA相互作用，CA-SCD1的復(fù)合物通過(guò)在CA與SCD1氨基酸殘基之間形成非共價(jià)相互作用而穩(wěn)定，見(jiàn)Fig 8。

Fig 4 Effect of different doses of CA and Sil on expression of α-SMA,collagen I by IHC and Masson staining

Fig 5 Effect of different doses of CA and Sil on lipid in oil red O staining

Fig 6 Effect of different doses of CA and Sil on TG n=8)**P<0.01 vs NG;##P<0.01 vs CCl4

3 討論

肝纖維化治療方法主要包括病因治療、抗纖維化藥物、原位肝移植、細(xì)胞療法及中醫(yī)治療等[12]。課題組在前期研究鬼箭羽醇提物時(shí)發(fā)現(xiàn)CA具有良好抗纖維化能力，可激活TGFβ-Smad信號(hào)通路，為了進(jìn)一步探討其機(jī)制，做了正常組、模型組和藥物組基因芯片篩查，篩出系列基因。在研究非酒精性脂肪肝機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)中的脂肪酸對(duì)非酒精性脂肪肝引起的肝纖維化意義重大，而芯片結(jié)果中SCD1基因恰好是脂肪酸代謝限速酶，可影響脂肪酸含量影響脂質(zhì)代謝，因此，我們提出假說(shuō)：CA是否能作用SCD1干擾脂質(zhì)生成抗肝纖維化？為了驗(yàn)證假說(shuō)，本研究完成以下內(nèi)容：

Fig 7 Effect of different doses of CA and Sil on expression of n=8)A:SCD1 mRNA,B:SCD1 protein bands,C:SCD1 protein statistical chart.**P<0.01 vs NG;##P<0.01 vs CCl4

Fig 8 Binding site and mode of CA to SCD1

首先，驗(yàn)證CA抗肝纖維化作用。肝纖維化導(dǎo)致肝臟損傷，所以同時(shí)檢測(cè)了肝損指標(biāo)：肝指數(shù)、ALT、AST和肝纖維化標(biāo)志：α-SMA和Collagen Ⅰ，結(jié)果提示CCl4可增高上述指標(biāo)的表達(dá)，誘發(fā)肝纖維化，CA可量效依賴地降低其表達(dá)，減輕肝纖維化的發(fā)生，同時(shí)，HE染色進(jìn)一步說(shuō)明CCl4導(dǎo)致肝臟損傷，CA減輕損傷，Masson染色顯示，CA可減輕膠原堆積，結(jié)論一致。

其次，驗(yàn)證肝纖維化時(shí)脂質(zhì)改變及藥物作用。油紅O染色可檢測(cè)脂質(zhì)生成，結(jié)果提示CCl4組脂質(zhì)明顯增多，CA可量效依賴地減少脂質(zhì)生成，TG是脂質(zhì)重要組成成分，CCl4組TG明顯增多，CA可量效依賴地減少TG生成，兩項(xiàng)指標(biāo)初步證實(shí)脂質(zhì)參與肝纖維化的發(fā)生，CA可干擾脂質(zhì)生成。

SCD1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶，是脂肪酸從頭合成途徑中最終步驟的限速酶[16,10]，脂肪酸合成是脂質(zhì)代謝的重要環(huán)節(jié)，結(jié)果顯示，CCl4增加SCD1mRNA和蛋白的表達(dá)，CA量效依賴地降低其表達(dá)，表明CA可影響SCD1的表達(dá)。CA和SCD1的作用關(guān)系和模式：CA與SCD1的結(jié)合能為- 5.4 kcal·mol-1，小于0，表明親和力較強(qiáng)，CA可通過(guò)氫鍵和范德華力與SCD1直接作用。

另，文中使用陽(yáng)性對(duì)照水飛薊賓，發(fā)現(xiàn)在同等中劑量下，CA抗纖維化能力統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異，表明中劑量CA與水飛薊賓抗纖維化能力相同。綜上，CA可影響SCD1并通過(guò)模擬表明兩者有直接作用，但CA是否通過(guò)靶向SCD1發(fā)揮作用需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，同時(shí)CA減少脂質(zhì)生成，是通過(guò)SCD1干擾脂肪酸從頭合成途徑還是其它路徑，也需進(jìn)一步研究。