基于HIF-1α/ERK通路探討異丙酚對缺氧大鼠海馬神經(jīng)元線粒體損傷的影響*

妙永惠，閻文軍

（1.臨夏州人民醫(yī)院 麻醉科，甘肅 臨夏 731100；2.甘肅省人民醫(yī)院 麻醉科，甘肅 蘭州 730000）

腦缺血性疾病屬于發(fā)病率、致死率和致殘率高的臨床常見疾病，嚴重威脅患者生命安全[1]。海馬神經(jīng)元對缺氧反應(yīng)十分敏感，線粒體損傷是神經(jīng)元缺氧損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探討海馬神經(jīng)元缺氧損傷機制有重要的臨床意義[2]。近年來，麻醉藥的腦保護作用逐漸成為研究熱點。異丙酚對臟器保護及缺血再灌注損傷影響的研究已有報道[3-4]。既往研究顯示[5]，異丙酚具有減輕腦缺血再灌注損傷的保護作用，但其對線粒體損傷的影響及具體機制尚無定論。本研究通過體外培養(yǎng)大鼠原代海馬神經(jīng)元，并應(yīng)用糖氧剝奪法復制海馬神經(jīng)元缺氧損傷模型，旨在觀察不同劑量異丙酚對缺氧海馬神經(jīng)元線粒體損傷的作用，并探討其可能的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級新生SD 大鼠（24 h 內(nèi)）2 只，性別不限，體重（8±2）g，健康（皮膚黏膜紅潤，運動正常），購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2018-005]。

1.2 主要試劑與儀器

異丙酚（英國阿斯利康制藥有限公司，批準文號：H20130535），缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）/細胞外調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）特異性抑制劑U0126（武漢艾美捷科技有限公司），DMEM-F12培養(yǎng)液、Neurobasal-A 培養(yǎng)液（美國HyClone 公司），多聚賴氨酸（美國Sigma 公司），鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin,GaN）檢測試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白濃度測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），鈣離子熒光探針（FLuo-AM）、聚乳酸聚合物（Pluronic F127）（海門市碧云天生物技術(shù)研究所），2，7-二氯熒光素二乙酸酯探針（2，7-Dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA）（北京百奧萊博科技有限公司），兔抗大鼠HIF-1α、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（cysteine-containing aspartate-specific proteases 3,Caspase-3）多抗（一抗）及辣根或氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 單抗（二抗）（美國Abcam 公司）。QP-80 型三氣培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），CKX53 型倒置光學顯微鏡、FV3000 型激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），Infinite F50 型酶標儀（瑞士TECAN 公司），Mini-PROTEAN Tetra 型電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 原代海馬神經(jīng)元分離和培養(yǎng) 新生SD 大鼠斷頭處死，無菌取海馬組織，置于DMEM-F12 培養(yǎng)液（20%胎牛血清），更換0.25%胰蛋白酶消化處理25 min，吸管吹打均勻，加入DMEM-F12 培養(yǎng)液終止消化，消化液過200 目濾網(wǎng)，濾液經(jīng)1 000 r/min 離心5 min，取沉淀，DMEM-F12 培養(yǎng)液重懸。調(diào)整細胞密度為5×105個/mL，培養(yǎng)于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，95% O2、5% CO2、37℃及飽和濕度條件下，培養(yǎng)24 h 后替換Neurabasal-A 培養(yǎng)液（2% B27+1% L-谷氨酰胺+1%丙酮酸鈉），倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，培養(yǎng)至第3 天加入4 mg/L 的阿糖胞苷抑制非神經(jīng)細胞過度增殖，每3 天半量換液1 次，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，培養(yǎng)至第8 天采用免疫細胞化學染色法觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達，細胞漿和突起棕褐色陽性染色細胞即為海馬神經(jīng)元細胞，陽性細胞占總細胞數(shù)92%以上即可用于后續(xù)實驗[6]。

1.3.2 分組及干預(yù)方法 培養(yǎng)至第8 天原代海馬神經(jīng)元細胞分為6 組，每組3 個復孔。對照組：用高糖DMEM 培養(yǎng)液替換Neurabasal-A 培養(yǎng)液；缺氧組：用低糖DMEM 培養(yǎng)液替換Neurabasal-A 培養(yǎng)液；低劑量異丙酚組（LP 組）、中劑量異丙酚組（MP 組）和高劑量異丙酚組（HP 組）：用含終濃度分別為3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L 異丙酚的低糖DMEM 培養(yǎng)液替換Neurabasal-A 培養(yǎng)液；U0126 組：用含終濃度12 mg/L異丙酚+50 μmol/L U0126 的低糖DMEM 培養(yǎng)液替換Neurabasal-A 培養(yǎng)液。對照組細胞于95% O2、5%CO2、37℃及飽和濕度條件培養(yǎng)24 h；缺氧組、LP 組、MP 組、HP 組和U0126 組細胞于95% N2、5% CO2、37℃及飽和濕度條件培養(yǎng)24 h。

1.3.3 透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元細胞形態(tài) 收集干預(yù)24 h 后的各組細胞，PBS 吹洗3 次后，加入胰蛋白酶消化獲得細胞沉淀，加入20 倍沉淀體積的固定液于4℃固定48 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次后，參照文獻[7]制作厚度為50 nm 超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾雙面染色后，于透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)，并拍攝照片。

1.3.4 MTT 法檢測細胞存活率 收集干預(yù)24 h 后的各組細胞，分別加入0.5 g/L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，加入20%的十二烷基磺酸鈉溶液，充分混勻溶解結(jié)晶，應(yīng)用酶標儀測定490 nm 波長處的吸光度值。計算細胞存活率=各干預(yù)組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡檢測Ca2+、活性氧（ROS）的熒光強度 原代海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)于加有載玻片的24 孔板，按照上述缺氧和干預(yù)方法處理24 h，Hank's 液洗滌3 次。每孔加入5 μmol/L FLuo-AM 和質(zhì)量濃度0.05% Pluronic F127 混合液（Ca2+熒光強度檢測），或每孔加入10 μmol/L DCFH-DA 探針（ROS熒光強度檢測）。37℃避光孵育30 min，Hank's 液洗滌3 次，并用Hank's 液繼續(xù)避光孵育30 min，然后用4%多聚甲醛固定、封片，激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)波488 nm、發(fā)射波525 nm）觀察拍照，應(yīng)用Image J 圖像分析軟件分析熒光強度。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細胞GaN 活性 收集干預(yù)24 h 后的各組細胞，PBS 洗滌并重懸細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解20 min，12 000 r/min 離心15 min（離心半徑12 cm），取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度，按照GaN 檢測試劑盒說明書步驟操作，檢測細胞GaN 活性。

1.3.7 Western blotting檢測細胞的HIF-1α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量 收集干預(yù)24 h 后的各組細胞，PBS 洗滌并重懸細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解20 min，12 000 r/min 離心15 min（離心半徑12 cm），取上清液，于沸水水浴10 min 變性，再次離心取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度。取50 μg 待測蛋白進行恒定電流的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳約1.5 h，分離膠電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋一抗HIF-1α（1∶400）、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3（1∶500），4℃過夜，含Tris-Hcl 的吐溫20 緩沖液（TBST）洗滌3 次，每次10 min，加入稀釋二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 再次洗滌，加入電化學發(fā)光液顯色，以β-actin為內(nèi)參，蛋白條帶應(yīng)用Image J 圖像分析軟件分析目的蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬神經(jīng)元形態(tài)改變

對照組線粒體膜和嵴結(jié)構(gòu)完整清晰，數(shù)量多；缺氧組線粒體數(shù)量少且腫脹，嵴完整性和連續(xù)性破壞，空泡化嚴重；LP 組、MP 組和HP 組線粒體上述損傷均有所減輕，其中HP 組減輕最為明顯；U0126 組線粒體損傷較HP 組嚴重。見圖1。

圖1 各組海馬神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)（透射電鏡×15 000）

2.2 各組海馬神經(jīng)元細胞存活率的比較

各組海馬神經(jīng)元細胞存活率分別為：對照組（95.65±4.20）%、缺氧組（42.30±3.64）%、LP 組（45.41±4.22）%、MP 組（59.54±5.19）%、HP 組（70.81±6.47）%、U0126 組（53.08±5.61）%，各組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=174.790，P=0.000）；進一步兩兩比較，結(jié)果：與對照組比較，缺氧組海馬神經(jīng)元細胞存活率降低（P＜0.05）；與缺氧組比較，MP 組、HP 組及U0126 組海馬神經(jīng)元細胞存活率升高，且HP 組高于MP 組和U0126 組（P＜0.05）；缺氧組與LP 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組海馬神經(jīng)元Ca2+、ROS熒光強度的比較

各組海馬神經(jīng)元Ca2+、ROS 熒光強度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=155.230 和224.164，均P=0.000）；進一步兩兩比較，與對照組比較，缺氧組海馬神經(jīng)元Ca2+、ROS 熒光強度均升高（P＜0.05）；與缺氧組比較，LP 組ROS 熒光強度降低（P＜0.05），Ca2+熒光強度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與缺氧組比較，MP 組、HP 組及U0126 組海馬神經(jīng)元Ca2+、ROS 熒光強度均降低，且HP 組低于MP 組和U0126 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元細胞Ca2+、ROS熒光強度的比較（±s）

表1 各組海馬神經(jīng)元細胞Ca2+、ROS熒光強度的比較（±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與缺氧組比較，P ＜0.05；③與LP 組比較，P ＜0.05；④與MP 組比較，P ＜0.05；⑤與HP 組比較，P ＜0.05。

2.4 各組海馬神經(jīng)元細胞GaN活性的比較

各組海馬神經(jīng)元細胞GaN 活性分別為：對照組（0.23±0.02）u/mg、缺氧組（0.61±0.05）u/mg、LP 組（0.59±0.06）u/mg、MP 組（0.50±0.05）u/mg、HP 組（0.37±0.04）u/mg、U0126 組（0.54±0.04）u/mg，各組海馬神經(jīng)元細胞GaN 活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=123.120，P=0.000）；進一步兩兩比較，與對照組比較，缺氧組海馬神經(jīng)元GaN 活性升高（P＜0.05）；與缺氧組比較，MP 組、HP 組及U0126 組海馬神經(jīng)元GaN 活性降低，且HP 組低于MP 組和U0126 組（P＜0.05）；缺氧組與LP 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 各組海馬神經(jīng)元細胞HIF-1 α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量比較

各組海馬神經(jīng)元細胞HIF-1α、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各組ERK1/2 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；進一步兩兩比較，與對照組比較，缺氧組HIF-1α、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與缺氧組比較，LP 組、MP 組、HP 組及U0126 組HIF-1α、p-ERK1/2 蛋白相對表達量升高，且HP 組高于LP 組、MP 組和U0126 組（P＜0.05）；與缺氧組比較，LP 組、MP 組、HP 組 及U0126 組Caspase-3 蛋白相對表達量降低，且HP 組低于LP組、MP 組和U0126 組（P＜0.05）；缺氧組與LP 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2 和表2。

圖2 各組海馬神經(jīng)元細胞HIF-1α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3蛋白表達

表2 各組海馬神經(jīng)元細胞HIF-1α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3蛋白相對表達量的比較（±s）

表2 各組海馬神經(jīng)元細胞HIF-1α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3蛋白相對表達量的比較（±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與缺氧組比較，P ＜0.05；③與LP 組比較，P ＜0.05；④與MP 組比較，P ＜0.05；⑤與HP 組比較，P ＜0.05。

3 討論

腦組織對缺氧十分敏感，尤其是海馬神經(jīng)元，短時間的缺氧即可造成不可逆損傷，其機制十分復雜，目前仍未完全闡明[8-9]。研究認為，氧化應(yīng)激、胞內(nèi)鈣超載是神經(jīng)元缺氧損傷的重要機制，腦組織缺氧后，突觸過度激活引起Ga2+通道開放，細胞外Ga2+大量內(nèi)流，同時自由基大量生成，導致線粒體膜去極化發(fā)生結(jié)構(gòu)改變[10]。進一步促使Ga2+通道開放，胞內(nèi)鈣超載，加重神經(jīng)元損傷。胞內(nèi)鈣超載導致的線粒體損傷可加速神經(jīng)元凋亡，目前該機制已成為研究的熱點領(lǐng)域[11-13]。目前關(guān)于異丙酚對缺氧海馬神經(jīng)元線粒體損傷的影響及具體機制仍需深入研究，為其臨床應(yīng)用提供理論支持。

本研究結(jié)果顯示，缺氧組海馬神經(jīng)元存活率低于對照組，細胞內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷嚴重，Ca2+、ROS 熒光強度、GaN 活性高于對照組，說明缺氧可導致細胞外Ga2+大量內(nèi)流，造成海馬神經(jīng)元線粒體損傷，最終引起海馬神經(jīng)元死亡。本研究進一步應(yīng)用不同濃度異丙酚作用于體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MP 組、HP 組線粒體損傷減輕，且細胞存活率高于缺氧組，Ca2+、ROS 熒光強度、GaN 活性均低于缺氧組，提示異丙酚具有減少海馬神經(jīng)元鈣超載，清除自由基，緩解胞內(nèi)線粒體損傷的作用。研究表明，異丙酚可激活γ-氨基丁酸A 型（GABAA）受體，可以選擇性地讓Cl-通過，引起細胞膜超極化，Ga2+內(nèi)流[14]。另有研究表明，異丙酚可通過抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體毒性，變構(gòu)調(diào)節(jié)門控通道，發(fā)揮細胞保護作用[15]。動物實驗研究顯示[16]，丙泊酚可有效緩解七氟烷誘導的大鼠海馬神經(jīng)細胞損傷，抑制炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮認知損傷保護作用。XU 等[17]的研究顯示，低濃度丙泊酚可增強海馬神經(jīng)元活力，抑制其凋亡，與本研究結(jié)果相似，但在其研究中高濃度丙泊酚可降低海馬神經(jīng)元活力，促進其凋亡，可能與p38 絲裂原活化蛋白激酶磷酸化水平有關(guān)，這與本研究結(jié)果不一致，其原因可能為本研究選用的細胞糖氧剝奪模型而使研究結(jié)果差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧組HIF-1α、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量均高于對照組，不同濃度異丙酚干預(yù)后上述蛋白表達量降低，提示丙泊酚抑制細胞內(nèi)線粒體損傷的作用可能與抑制HIF-1α/ERK 信號通路激活有關(guān)。HIF-1α/ERK 是細胞缺氧損傷相關(guān)的關(guān)鍵信號通路之一。HIF-1α 屬于細胞內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，缺氧條件下大量表達調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，以適應(yīng)缺氧環(huán)境[18]。ERK1/2 磷酸化水平與缺氧及細胞凋亡關(guān)系密切，可直接影響HIF-1α 轉(zhuǎn)錄活性，同時可調(diào)控下游凋亡關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3 的表達[19-20]。本研究在高劑量異丙酚基礎(chǔ)上應(yīng)用HIF-1α/ERK 信號通路抑制劑U0126 干預(yù)，結(jié)果顯示，與HP 組比較，U0126 組線粒體損傷程度較重，細胞存活率降低，Ca2+、ROS熒光強度及GaN 活性升高，且HIF-1α、p-ERK1/2 蛋白相對表達量降低，Caspase-3 蛋白表達量升高，進一步說明異丙酚可通過激活HIF-1α/ERK 信號通路發(fā)揮減輕大鼠海馬神經(jīng)元線粒體損傷的作用。

綜上所述，不同濃度異丙酚作用于體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元可減少細胞內(nèi)Ca2+、ROS 熒光強度，抑制GaN 活性，減輕缺氧大鼠海馬神經(jīng)元線粒體損傷，其調(diào)控機制可能與HIF-1α/ERK 信號通路有關(guān)。海馬神經(jīng)元糖氧剝奪損傷是多種分子機制共同作用的結(jié)果，線粒體損傷導致的能量代謝異常是導致細胞凋亡的主要原因之一，其機制也存在復雜性。本研究僅從HIF-1α/ERK 信號通路分析了異丙酚對線粒體損傷影響的機制，后續(xù)研究重點將探討異丙酚能否通過其他途徑影響神經(jīng)元線粒體損傷，為臨床提供更多的理論依據(jù)。