蛇床子素對髓核致神經(jīng)根炎性痛大鼠脊髓背角Wnt3a/β-catenin信號通路的影響

楊琳，張嘉明，何仲賢，劉苑婷，魯楊，孫來保，江偉航

（1.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東廣州511400；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院，廣東廣州510655；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510080）

椎間盤突出髓核的生化致炎特性和對脊髓背角神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的作用是引發(fā)周圍神經(jīng)根炎癥反應(yīng)并引起腰腿痛的重要原因[1]。蛇床子素（osthole）又名甲氧基歐芹酚（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1），具有抗炎鎮(zhèn)痛作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在髓核致炎神經(jīng)根痛大鼠硬膜外腔注射蛇床子素可抑制炎性痛的外周及中樞敏化，從而達(dá)到緩解痛覺過敏的作用[2-4]，但其具體作用機(jī)制尚不完全明確。脊髓背角神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中Wnt3a/β-catenin信號通路的激活是導(dǎo)致炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵因素之一[5]。因此，本研究觀察蛇床子素對Wnt3a/β-catenin信號通路及相關(guān)分子的影響，進(jìn)一步探討蛇床子素的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用于腰腿痛的治療提供新的實驗依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

圖1 蛇床子素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of osthole

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～280 g，由中山大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2016-0029。實驗單位為中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，動物使用許可證號：SYXK（粵）2020-0233。飼養(yǎng)環(huán)境：分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，室溫（23±2）℃，相對濕度55%～65%，維持12 h循環(huán)晝夜節(jié)律。本研究動物實驗方案已經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核通過，倫審號：[2010]94號。本實驗所有過程步驟均嚴(yán)格按照中山大學(xué)動物實驗中心的操作相關(guān)指南進(jìn)行。

1.2 藥物、試劑與儀器蛇床子素（C15H16O3，MW=244.29，美國Selleckchem公司生產(chǎn)，批號：S2337）。10%二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；兔抗Wnt3a抗體、兔抗β-catenin抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、山羊抗兔IgG、Alex-488標(biāo)記的驢抗兔IgG、Alex-594標(biāo)記的驢抗兔IgG（美國Abcam公司）；白細(xì)胞介素18（IL-18）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（深訓(xùn)欣博盛生物科技公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa公司）。Von Frey纖毛測痛儀（美國Stoelting公司）；熱痛覺測試儀（美國IITC Life Science公司）；醫(yī)用顯微手術(shù)電鉆（XSZ-G-1型，上海光電技術(shù)有限公司）；倒置熒光顯微鏡（美國Leica公司）；電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；PE-10導(dǎo)管（英國Smiths Medical公司）。

1.3 分組與處理將54只大鼠隨機(jī)均分為3組，即假手術(shù)組、模型組、治療組，每組18只。除假手術(shù)組外，模型組和治療組構(gòu)建髓核致炎模型。術(shù)后2 d，治療組經(jīng)硬膜外導(dǎo)管給予20 g·L-1蛇床子素50 μL（給藥劑量參考文獻(xiàn)研究[4，6]），模型組和假手術(shù)組經(jīng)硬膜外導(dǎo)管給予100 mL·L-1的DMSO 50 μL。所有大鼠術(shù)前3、1 d及術(shù)后1、3、7、10、14 d均進(jìn)行疼痛行為學(xué)指標(biāo)50%機(jī)械性撤足閾值（MWT）和熱傷害性撤足潛伏期（TWL）測定，于術(shù)后7 d（即硬膜外給藥后第5天）取術(shù)側(cè)脊髓背角組織進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.4 造模方法參考Sasaki等[7]的方法建立大鼠髓核致炎模型：用10 g/L戊巴比妥鈉麻醉大鼠后俯臥位固定在動物用手術(shù)操作臺上，背部區(qū)域備皮后消毒鋪巾，以兩側(cè)髂嵴點連線中點切開約2.5 cm。逐層暴露組織肌肉直至看清L4～L5半椎板。取醫(yī)用顯微手術(shù)電鉆在半椎板中央鉆孔，暴露出左側(cè)背根神經(jīng)結(jié)。將PE-10導(dǎo)管經(jīng)孔向頭側(cè)輕柔置入（3～4 mm），并將PE-10導(dǎo)管固定好。導(dǎo)管的另一端經(jīng)皮下從大鼠兩耳之間引出約3 cm并固定，回抽確認(rèn)無血和腦脊液后，用灼燒法封閉導(dǎo)管。模型組和治療組從尾椎取出約0.4 mg髓核組織，放置于已經(jīng)暴露好的背根神經(jīng)結(jié)表面，而假手術(shù)組取出大鼠尾部自體髓核，但不放置自體髓核組織于背根神經(jīng)上，其余步驟相同。逐層縫合傷口，并用抗感染的聚維酮碘藥膏擦拭皮膚傷口，所有手術(shù)操作后的大鼠均單籠飼養(yǎng)。術(shù)后將撕咬肢體、下肢運動功能障礙和大小便失禁的大鼠剔除，并通過導(dǎo)管注射2%利多卡因10 μL，觀察30 s內(nèi)是否出現(xiàn)雙后肢麻痹驗證導(dǎo)管位置。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 機(jī)械性撤足閾值（MWT）測定測試前，將大鼠放置于有機(jī)透明玻璃測試盒內(nèi)至少30 min，使動物習(xí)慣于測試環(huán)境。待其安靜后，使用直徑約0.2 mm均勻尖端圓柱形探針垂直刺激大鼠患側(cè)后爪的足底，力度由弱至強(qiáng)，當(dāng)大鼠患側(cè)后肢出現(xiàn)迅速撤回、抬起或舔足等躲避應(yīng)激行為時，記錄該壓力數(shù)值。每只大鼠刺激5次，通過5個讀數(shù)的平均值計算每只動物的50%MWT。

1.5.2 熱傷害性撤足潛伏期（TWL）測定測試前，將大鼠放入有機(jī)透明玻璃盒子內(nèi)約15 min以適應(yīng)環(huán)境，并置放于裝有溫度控制的透明玻璃板上（厚度為3 mm）。將輻射熱源聚焦在大鼠患側(cè)后爪足底皮膚上，當(dāng)后爪出現(xiàn)迅速撤回、抬起或舔足等躲避應(yīng)激行為時，關(guān)閉熱源開關(guān)，并記錄時間數(shù)值。每只大鼠患側(cè)后足底以5 min的時間間隔測試熱刺激3次，取平均值作為TWL。

1.5.3 定量聚合酶鏈反應(yīng)（Q-PCR）法檢測脊髓背角組織Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)水平采用20 g/L戊巴比妥鈉（60～80 mg/kg）深麻醉大鼠后，在冰面上迅速取出大鼠L5節(jié)段脊髓背角組織，按TRIzol抽提法提取脊髓背角總RNA，測定RNA濃度和純度。以RNA為模板應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，變性到延伸總共35個循環(huán)。計算每個樣本的循環(huán)閾值（Ct值），運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software 1.6數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt法計算Wnt3a和β-catenin的mRNA相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.4 Western Blot法檢測脊髓背角組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平將大鼠L5節(jié)段脊髓背角組織用顯微剪剪成小碎片，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液，依次進(jìn)行超聲波勻漿、水浴及離心后取上清。選用10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜后用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別與Wnt3a一抗（體積比1∶1 000稀釋），β-catenin一抗（體積比1∶1 000稀釋），GAPDH一抗（體積比1∶1 000稀釋）置于4℃冰箱孵育過夜，然后與山羊抗兔二抗（體積比1∶500稀釋）室溫下孵育2 h。將PVDF膜與增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑反應(yīng)后即刻顯影，用ImageJ 6.0軟件分析PVDF膜條帶的灰度值。實驗重復(fù)3次，將各樣品中Wnt3a和β-catenin灰度值分別與相應(yīng)內(nèi)參GAPDH灰度值相除作為相應(yīng)目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5.5 免疫熒光染色法檢測脊髓背角組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平取出大鼠L5節(jié)段脊髓背角組織，40 g/L多聚甲醛固定后，進(jìn)行脫水及冰凍切片（厚度為20 μm）。然后將冰凍切片漂洗3次，每次10 min，再用含有5%（V/V）驢血清和0.3%TritonX-100的溶液均勻覆蓋組織，室溫封閉切片1 h。隨后用濾紙吸干封閉液，滴加對應(yīng)的一抗，放入濕盒中4℃輕搖孵育過夜。次日取出切片于常溫復(fù)溫1 h并吸去一抗。漂洗3次，每次10 min。加入二抗，在避光及室溫條件下孵育1 h，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次10 min。最后封片，在熒光顯微鏡下觀察，并采用CCD攝像頭拍攝圖像。

1.5.6 ELISA法檢測脊髓背角組織炎癥因子IL-18、TNF-α水平將大鼠L5節(jié)段脊髓背角組織剪成小碎片，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液。按100 μL/孔加入稀釋后的Cytokine Standard至標(biāo)準(zhǔn)品孔，然后各加入100 μL待測樣品至樣品孔，用Dilution Buffer R（1×）代替樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置空白孔。封孔后避光搖床孵育1.5 h。甩除孔內(nèi)液體，封孔后孵育90 min，再在每孔加入100 μL稀釋后的Streptavidin-HRP（1×），孵育30 min。最后于顯色后終止反應(yīng)后的10 min內(nèi)，置于450 nm波長處檢測吸光度，計算待測樣品的濃度。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 7.0軟件作圖。各組計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果，采用重復(fù)測量的方差分析，然后用Turkey Post Hoc Test法檢測組間差異或使用T檢驗進(jìn)行組間差異比較分析。Western Blot、ELISA以及免疫熒光染色結(jié)果的數(shù)據(jù)比較則采用單因素方差分析（One-way ANOVA），2組間比較采用Student-test檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠機(jī)械痛閾值比較圖2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組和治療組術(shù)后出現(xiàn)50%MWT下降及TWL潛伏期縮短（P＜0.05或P＜0.01），表明髓核致神經(jīng)根性疼痛動物模型建立成功。治療組術(shù)后3 d出現(xiàn)50%MWT上升及TWL潛伏期延長，并持續(xù)到術(shù)后第14天，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 各組大鼠機(jī)械性撤足閾值（MWT）變化（A）與熱傷害性撤足潛伏期（TWL）變化（B）比較（±s，n=6）Figure 2 Comparison of the change in mechanical withdrawal threshold（A）and the change in thermal withdrawal latency（B）among various groups of rats（±s，n=6）

2.2 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的mRNA表達(dá)比較圖3結(jié)果顯示：術(shù)后7 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角Wnt3a、β-catenin的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；而治療組Wnt3a、β-catenin的mRNA表達(dá)水平降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的mRNA相對表達(dá)量比較（±s，n=6）Figure 3 Comparison of the relative mRNA expressions of Wnt3a and β-catenin in the spinal dorsal horn among various groups of rats（±s，n=6）

2.3 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的蛋白表達(dá)比較圖4結(jié)果顯示：術(shù)后7 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角Wnt3a、β-catenin的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；而治療組Wnt3a、β-catenin的蛋白表達(dá)水平均明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的Western Blot電泳條帶（A）及其蛋白相對表達(dá)量（B）比較（±s，n=6）Figure 4 Comparison of Western Blot electrophoretic band of Wnt3a and β-catenin in the spinal dorsal horn（A）and their relative protein expressions（B）among various groups of rats（±s，n=6）

2.4 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的熒光蛋白表達(dá)比較圖5結(jié)果顯示：術(shù)后7 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角組織Wnt3a、β-catenin的熒光蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；而與模型組比較，治療組Wnt3、β-catenin的熒光蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的免疫熒光染色結(jié)果（A）（比例尺：50 μm）及其半定量（B）比較Figure 5 Comparison of immunofluorescence staining results of Wnt3a and β-catenin in the spinal dorsal horn（A）（Scale bar：50 μm）and their semi-quantification（B）among various groups of rats

2.5 各組大鼠脊髓背角中炎癥因子IL-18、TNF-α水平比較圖6結(jié)果顯示：術(shù)后7 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角中炎癥因子IL-18、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠脊髓背角IL-18、TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠脊髓背角炎癥因子IL-18（A）與TNF-α（B）水平比較（±s，n=6）Figure 6 Comparison of the levels of inflammatory factors IL-18（A）and TNF-α（B）in the spinal dorsal horn among various groups of rats（±s，n=6）

3 討論

腰腿痛屬于慢性疼痛疾病，其最常見的病因是腰椎間盤突出癥（lambar disc hemiation，LDH）[8-9]。腰椎間盤突出的髓核組織可作為抗原被人體的免疫系統(tǒng)識別，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致炎性物質(zhì)增加過度，引起神經(jīng)根腫脹，加重腰腿疼痛的反應(yīng)，而有效控制炎癥能夠明顯降低根性痛的發(fā)病率及嚴(yán)重程度，這正成為國內(nèi)外腰腿痛研究的熱點與方向[10]。

Wnt是一種約40 kDa控制發(fā)育的分泌蛋白，其作用包括細(xì)胞轉(zhuǎn)運極化及遷移等，Wnt信號通路的異常與許多疾病的發(fā)生有關(guān)[11-12]。既往研究表明，該通路參與了神經(jīng)免疫及炎癥系統(tǒng)疾病的病理生理過程[13-14]。Wnt3a/β-catenin是經(jīng)典的Wnt信號通路，Wnt3a為激活劑，在神經(jīng)病理性疼痛中，Wnt3a蛋白在脊髓水平顯著地增加，其受體在脊髓背角神經(jīng)元上表達(dá)增多，進(jìn)而引起Wnt信號通路下游分子β-catenin長時程地表達(dá)。β-catenin是影響神經(jīng)發(fā)育的重要分子[15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin可干預(yù)白細(xì)胞介素18（IL-18）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）等重要炎癥因子的形成和釋放[16]。在坐骨神經(jīng)壓迫和骨癌痛2種疼痛模型中，Wnt信號通路在脊髓背角中被激活，通過刺激炎癥物質(zhì)的產(chǎn)生，使實驗動物的疼痛行為學(xué)發(fā)生相關(guān)改變[17]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，髓核致炎模型大鼠術(shù)后脊髓背角中出現(xiàn)Wnt3a、β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，而硬膜外給予Wnt3a抑制劑后則出現(xiàn)50%MWT、TWL的 上 升 和Wnt3a、β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)的下降，提示W(wǎng)nt3a/β-catenin信號通路可能參與了髓核致神經(jīng)根炎性痛的發(fā)生發(fā)展。與前期研究結(jié)果相符，本研究結(jié)果亦顯示，模型組在術(shù)后1 d即出現(xiàn)50%MWT及TWL的持續(xù)下降，術(shù)后7 d模型組脊髓背角中Wnt3a、βcatenin mRNA和蛋白的表達(dá)及炎癥因子IL-18、TNF-α的含量較假手術(shù)組明顯升高，表明異?；罨腤nt信號可能通過激活下游通路，進(jìn)而上調(diào)炎性因子的表達(dá)而發(fā)揮作用，誘發(fā)大鼠的痛覺過敏。

蛇床子素是獨活寄生湯的主要藥用活性成分，其對椎間盤突出癥導(dǎo)致的下腰痛和坐骨神經(jīng)痛有顯著療效。研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素除了具有良好的抗心律失常、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等作用外，其抗炎鎮(zhèn)痛作用也非常突出。在HIV gp120誘發(fā)的周圍神經(jīng)病理痛模型中，蛇床子素可通過抑制神經(jīng)元P2X3R等相關(guān)受體，抑制炎性反應(yīng)及疼痛的程度[18]。更有研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可在不同時期通過下調(diào)組織炎癥反應(yīng)對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用[19-20]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在髓核致炎大鼠模型中，通過硬膜外腔注射蛇床子素可明顯提高大鼠50%MWT和TWL，即減輕了大鼠的機(jī)械痛敏及熱痛敏[6，21-23]。但蛇床子素是否通過干預(yù)Wnt3a/β-catenin信號通路達(dá)到鎮(zhèn)痛效應(yīng)尚不明確。本研究結(jié)果顯示，治療組大鼠術(shù)后2 d經(jīng)硬膜外腔給予蛇床子素后，在術(shù)后3 d出現(xiàn)50%MWT上升及TWL潛伏期延長，術(shù)后7 d脊髓背角Wnt3a、β-catenin mRNA及蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，IL-18和TNF-α的表達(dá)也明顯下降，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。因此，認(rèn)為蛇床子素干預(yù)髓核致炎模型后，可以通過抑制脊髓背角中Wnt3a/β-catenin信號通路活化，下調(diào)炎性因子表達(dá)，從而減輕疼痛的程度。

綜上所述，Wnt3a/β-catenin信號通路在脊髓背角參與了髓核致炎大鼠神經(jīng)根性疼痛的發(fā)展過程，蛇床子素可通過下調(diào)Wnt3a神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，阻斷β-catenin信號通路的活化，進(jìn)而抑制IL-18和TNF-α的表達(dá)，緩解炎性疼痛的中樞敏化，起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用。