蒙脫石對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)、主要消化酶和免疫酶活性的影響

李君華，劉佳亮，李 靜，孫路平，劉石林，王玉本

( 1.山東東方海洋科技股份有限公司，國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺(tái) 264003； 2.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所，山東 青島 266071 )

蒙脫石是一類硅鋁酸鹽礦物，含有多種常量元素和微量元素及生物活性物質(zhì)，具有良好的吸水性、膨脹性、分散性和離子交換性等特性，還具有無(wú)藥物殘留、無(wú)耐藥性、無(wú)激素和無(wú)腐蝕性等優(yōu)點(diǎn)。蒙脫石可通過(guò)物理和化學(xué)方法對(duì)其表面基團(tuán)和電荷的分布進(jìn)行適當(dāng)?shù)母男裕嵘擅撌奈叫阅?，殺菌和脫毒效果更好[1-3]。蒙脫石可吸附動(dòng)物腸道中的霉菌毒素、重金屬、細(xì)菌等，修復(fù)和保護(hù)消化道黏膜，防治腹瀉[4-5]；還可吸附飼料中的霉菌毒素，延長(zhǎng)飼料的保質(zhì)期，提高飼料適口性[6-7]。另外，蒙脫石含有的多種礦物質(zhì)元素是動(dòng)物體內(nèi)各種新陳代謝過(guò)程和骨骼建造的不可缺少的成分，是酶、激素等生物活性物質(zhì)的組成成分，并影響其活性或免疫反應(yīng)等，且以離子和可溶性鹽的形式存在，利于動(dòng)物吸收[8]。

蒙脫石已在禽畜業(yè)和環(huán)保方面得到了廣泛應(yīng)用，并有大量的研究報(bào)道[8-12]，在飼料脫霉、治療動(dòng)物腹瀉和提高生產(chǎn)性能等方面有顯著的效果，如：在斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加載銅蒙脫石可提高仔豬日增加質(zhì)量和飼料利用率，促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)[9]；改性蒙脫石可通過(guò)抗氧化、抗炎和抗凋亡功能等途徑降低仔豬腹瀉，并促進(jìn)其生長(zhǎng)[10]；蒙脫石還可緩解黃曲霉毒素B1污染的飼糧對(duì)肉雞引起的不良影響[12]。其在漁業(yè)方面的使用研究報(bào)道卻很少，如：蒙脫石可有效地促進(jìn)魚蝦機(jī)體代謝，提高抗病力和生長(zhǎng)率等[13-14]；載銅蒙脫石對(duì)水產(chǎn)病原菌具有抑制和殺滅作用[15]；Hu等[16]發(fā)現(xiàn)，添加0.15%的載銅蒙脫石可提高尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的生長(zhǎng)。蒙脫石優(yōu)良的吸附性能可降低水體中硫、重金屬等離子的含量，吸附池底腐敗有機(jī)物，改善養(yǎng)殖水環(huán)境[17]。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)作為我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖種類，存在種質(zhì)退化、養(yǎng)殖環(huán)境惡化等問(wèn)題，許多學(xué)者以仿刺參飼料優(yōu)化和微生態(tài)制劑研發(fā)作為切入點(diǎn)進(jìn)行研究[18-19]。筆者將蒙脫石作為飼料添加劑，以期增強(qiáng)仿刺參消化性能和免疫能力，進(jìn)而促進(jìn)仿刺參生長(zhǎng)，并獲得蒙脫石最適添加量，為蒙脫石在仿刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼料來(lái)自山東東方海洋科技股份有限公司，其主要成分為馬尾藻(Sargassumpolycystum)、鼠尾藻(S.thunbergii)、羊棲菜(S.fusiforme)、脫膠海帶(Laminariajaponica)、豆粕、次粉等，粗蛋白含量為19.84%，粗脂肪含量為 4.28%。高純度納米蒙脫石由赤峰市恒潤(rùn)工貿(mào)有限公司生產(chǎn)(純度95%)，以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組，在基礎(chǔ)飼料中添加0.20%、0.40%、0.60%和0.80%的蒙脫石作為4個(gè)處理組。

1.2 仿刺參來(lái)源及日常管理

試驗(yàn)仿刺參選自山東東方海洋科技股份有限公司海參育苗車間，初始體質(zhì)量(1.37±0.07) g。試驗(yàn)容器為100 L的藍(lán)色塑鋼水箱，每個(gè)水箱45頭仿刺參，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)分配3個(gè)水箱。養(yǎng)殖期間，鹽度29.0±1.0，水溫15.8～21.0 ℃，保持24 h充氧，日換水約50%，換水時(shí)收集糞便并清理殘餌，保持水箱內(nèi)清潔。日投餌量為仿刺參體質(zhì)量的3%～5%，基礎(chǔ)飼料與海泥以1∶1(質(zhì)量比)混合投喂，投喂前過(guò)100目篩絹。仿刺參暫養(yǎng)7 d，停食2 d后開始試驗(yàn)，試驗(yàn)周期為75 d。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 樣品采集及處理

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱取仿刺參體質(zhì)量，停食72 h后，解剖仿刺參取腸道和體腔液。每個(gè)水箱隨機(jī)抽取6頭仿刺參，使其排空消化道內(nèi)的食物殘?jiān)?，用濾紙輕輕吸干體表水分，逐頭稱量質(zhì)量，置冰盤上，用解剖刀沿仿刺參泄殖腔剖開0.5 cm，立即置于準(zhǔn)備好的10 mL離心管上方收集體腔液，于4 ℃，4000 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min，取上清液分裝于0.5 mL離心管中，-80 ℃保存，用于測(cè)定各項(xiàng)免疫指標(biāo)。待仿刺參體腔液取樣完畢，取出仿刺參消化道，剔除與消化道末端相連的呼吸樹，用預(yù)冷重蒸水配制的pH 7.0磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4-NaH2PO4)沖洗后，用濾紙輕輕吸干水分，稱量腸道質(zhì)量，-80 ℃保存，用于測(cè)定腸道消化酶活性。

腸道粗酶液的制備：仿刺參消化道在冰浴中用玻璃研磨器勻漿10～15 min，按1 g樣品10 mL緩沖溶液的比例分次加入pH 7.0的磷酸鹽緩沖液。然后將勻漿液在高速冷凍離心機(jī)中以4 ℃，5000 r/min(離心半徑10 cm)冷凍離心30 min，其上清液即為粗酶提液，4 ℃保存。24 h內(nèi)分析完畢。

1.3.2 測(cè)定指標(biāo)

仿刺參生長(zhǎng)指標(biāo)按下式計(jì)算：

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，RSG為特定生長(zhǎng)率(%/d)，m0和mt分別為初始體質(zhì)量和試驗(yàn)t時(shí)間的體質(zhì)量(g)，t為試驗(yàn)時(shí)間(d)。

仿刺參飼料干物質(zhì)表觀消化率計(jì)算方法如下：

R=100%-(100%×Adiet/Afeces)

式中，R為干物質(zhì)表觀消化率(%)，Adiet和Afeces分別為飼料和糞便中酸不溶性灰分含量。

參照文獻(xiàn)[20]的方法測(cè)定幼參腸道蛋白酶和淀粉酶活性。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)測(cè)定粗酶液蛋白質(zhì)濃度。體腔液的超氧化物化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶的活性均用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒測(cè)定，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較組間差異顯著性采用鄧肯多重比較，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參生長(zhǎng)性能及干物質(zhì)表觀消化率的影響

飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參生長(zhǎng)性能的影響見表1，仿刺參的存活率為(88.67±2.31)%～(90.00±2.00)%，添加蒙脫石對(duì)仿刺參存活率無(wú)顯著影響(P>0.05)。添加蒙脫石提高了仿刺參特定生長(zhǎng)率，隨著蒙脫石添加量的增加，特定生長(zhǎng)率呈先升后降的趨勢(shì)。其中以添加量0.40%組最高，達(dá)(1.03±0.16)%/d，其次為0.20%組，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

蒙脫石顯著提高了仿刺參干物質(zhì)表觀消化率(P<0.05)(表1)，其隨著蒙脫石添加量的增加而降低。其中，0.20%組最高(35.09±1.15)%，其次為0.40%組，兩組間差異不顯著(P>0.05)，均顯著高于其他各組(P<0.05)。

表1 飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參生長(zhǎng)性能及干物質(zhì)表觀消化率的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)

2.2 飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參腸道蛋白酶和淀粉酶活性的影響

飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參腸道蛋白酶和淀粉酶活性的影響見表2，添加0.20%～0.60%的蒙脫石顯著提高了仿刺參腸道蛋白酶和淀粉酶活性(P<0.05)，隨著蒙脫石添加量的增加呈先升后降的趨勢(shì)。添加0.40%的蒙脫石仿刺參腸道蛋白酶和淀粉酶活性最高，分別為(73.27±3.73) U/mg和(70.63±1.96) U/mg，較對(duì)照組分別提高 39.30% 和30.68%；添加0.80%的蒙脫石對(duì)仿刺參腸道蛋白酶和淀粉酶無(wú)顯著影響(P>0.05)，但低于對(duì)照組。

表2 飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參幼參腸道蛋白酶和淀粉酶活性的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3) U/mg

2.3 飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參體腔液非特異性免疫酶活性的影響

飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參體腔液非特異性免疫酶活性的影響見表3，不同添加量的蒙脫石對(duì)仿刺參體腔液免疫因子超氧化物歧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶活性有不同程度的影響，其中，對(duì)仿刺參體腔液中溶菌酶活性的影響最大。添加 0.20% 和0.40%的蒙脫石顯著提高了仿刺參體腔液中超氧化物歧化酶活性(P<0.05)，0.60%組和0.80%組蒙脫石對(duì)仿刺參體腔液超氧化物歧化酶活性無(wú)顯著性影響(P>0.05)，組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；添加0.20%～0.80%的蒙脫石顯著提高了仿刺參體腔液溶菌酶活性(P<0.05)，以0.60%組最高(20.72±1.05) U/mL，較對(duì)照組提高50.04%；添加0.40%～0.80%的蒙脫石顯著提高了仿刺參體腔液堿性磷酸酶活性(P<0.05)，以0.40%組最高(0.195±0.016) U/mL，較對(duì)照組提高44.42%。

表3 飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參幼參體腔液中免疫酶活性的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=3) U/mL

3 討 論

3.1 飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參生長(zhǎng)和干物質(zhì)表觀消化率的影響

蒙脫石是一種新型的飼料添加劑，它可降低飼料通過(guò)消化道的速度，促進(jìn)飼料在胃腸中的消化吸收，提高飼料的轉(zhuǎn)化利用率，降低成本；它還能提高飼料的適口性和改進(jìn)飼料的松散性，并明顯延長(zhǎng)飼料的保質(zhì)期等[6-7]。蒙脫石在家禽生產(chǎn)中作為飼料添加劑使用，可提高家禽生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)[21-22]；蒙脫石在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中，通常用于養(yǎng)殖蝦池，能起到調(diào)節(jié)、補(bǔ)充水產(chǎn)養(yǎng)殖中微量元素的作用，可有效地促進(jìn)魚蝦類機(jī)體代謝，防病抗病，提高成活率[17]。胡彩虹等[13,16]比較系統(tǒng)地報(bào)道了飼料中添加載銅蒙脫石對(duì)羅非魚生長(zhǎng)和腸道菌群的影響，添加0.15%載銅蒙脫石提高了羅非魚腸道屏障功能、飼料轉(zhuǎn)化率和飼料養(yǎng)分表觀消化率。本試驗(yàn)中，添加0.20%～0.40%的蒙脫石可顯著提高仿刺參特定生長(zhǎng)率，添加0.40%的蒙脫石仿刺參特定生長(zhǎng)率最高，最適添加量較尼羅羅非魚[16]的最適載銅蒙脫石添加量(0.15%)偏高，這可能與仿刺參濾食性和腸道構(gòu)造簡(jiǎn)單有關(guān)，且用于尼羅羅非魚的為載銅蒙脫石。添加0.80%的高劑量蒙脫石仿刺參特定生長(zhǎng)率有所降低，添加量過(guò)高不利于仿刺參生長(zhǎng)，可能因蒙脫石遇水會(huì)形成團(tuán)樣的黏稠結(jié)構(gòu)，減緩了飼料在腸道內(nèi)的流通速度，導(dǎo)致仿刺參產(chǎn)生物理飽感。

消化率是評(píng)價(jià)飼料效果的重要指標(biāo)。Seo等[23]研究表明，仿刺參對(duì)配合飼料的干物質(zhì)表觀消化率為36%～63.9%，其配合飼料中主要是藻粉、豆粕、面粉等易被消化吸收的原料。Xia等[24]以海藻粉和海泥3∶7(質(zhì)量比)的比例投喂仿刺參，海泥比例較大，飼料干物質(zhì)表觀消化率不高，不同藻粉干物質(zhì)表觀消化率為9.63%～15.84%。本試驗(yàn)中海泥與基礎(chǔ)飼料投喂比為1∶1(質(zhì)量比)，基礎(chǔ)飼料中亦含有藻粉、豆粕、次粉等易消化的原料，仿刺參對(duì)飼料的干物質(zhì)表觀消化率為29.94%～35.09%，介于兩者之間。已有研究表明，在飼料中添加蒙脫石可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化[25]，蒙脫石可延長(zhǎng)食物通過(guò)消化道的時(shí)間，改善腸道菌群和腸黏膜形態(tài)，提高飼料的利用率。本試驗(yàn)中，添加蒙脫石顯著提高了仿刺參飼料干物質(zhì)表觀消化率，添加量過(guò)大會(huì)影響仿刺參對(duì)飼料的消化吸收，可能因蒙脫石中含有氧化鈣等物質(zhì)，影響飼料的適口性，這與過(guò)量的蒙脫石引起奶牛不適的情況[26]相似，也有報(bào)道稱，蒙脫石會(huì)影響動(dòng)物對(duì)賴氨酸、維生素B2的吸收[27]。

3.2 飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參腸道主要消化酶的影響

蒙脫石含有大量礦物質(zhì)元素及銅、鋅、硒等多種微量元素，一方面可補(bǔ)充動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所需的礦物質(zhì)，另一方面是酶、激素等生物活性物質(zhì)的組成成分，具有促酶和催酶作用，易被動(dòng)物吸收利用，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。郭彤等[11]報(bào)道，飼料中添加載銅蒙脫石能顯著提高斷奶仔豬十二指腸內(nèi)容物中總蛋白水解酶、脂肪酶、淀粉酶的活性；胡彩虹等[13]認(rèn)為，在飼料中添加0.15%～0.20%的載銅蒙脫石可提高羅非魚腸組織蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。通常仿刺參生長(zhǎng)速率越快，其腸道消化酶的活性越高[28]，而蛋白酶和淀粉酶是仿刺參腸道的主要消化酶[20]。飼料中添加的蒙脫石吸水膨脹除降低了飼料經(jīng)過(guò)腸道的速度外，還可吸附腸道內(nèi)的病原菌，保護(hù)腸道黏膜，益于消化酶的分泌，添加0.20%～0.60%的蒙脫石顯著提高了仿刺參腸道蛋白酶和淀粉酶活性，添加比例較羅非魚的高，可能因兩者的飼料形態(tài)不同，仿刺參飼料為粉狀，潑灑于水中蒙脫石會(huì)有部分損失。

適量的蒙脫石可提高動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的消化吸收，高劑量的蒙脫石吸水后膨脹數(shù)十倍，更不易排出體外，飼料滯留時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，長(zhǎng)期高劑量飼喂會(huì)對(duì)動(dòng)物腸道造成一定損傷，加重腸道負(fù)擔(dān)[29]。劉國(guó)棟等[14]認(rèn)為，在雜交鱘(Acipenserruthenus♂×A.baeri♀)飼料中添加5.0%的蒙脫石生長(zhǎng)指標(biāo)仍有所上升，但組織切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒙脫石添加水平≥2.5%時(shí)，對(duì)雜交鱘肝臟組織有較嚴(yán)重的損傷，添加5.0%的蒙脫石對(duì)腸道組織有嚴(yán)重的損傷。本試驗(yàn)中，高劑量的蒙脫石(0.80%)在仿刺參腸道內(nèi)吸水膨脹，滯留時(shí)間延長(zhǎng)，長(zhǎng)期過(guò)量使用，易造成仿刺參腸道負(fù)擔(dān)，影響腸道消化酶的分泌，其損傷機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

3.3 飼料中添加蒙脫石對(duì)仿刺參部分免疫因子的影響

仿刺參的防御機(jī)制主要是通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫，還可產(chǎn)生一些抗氧化酶類來(lái)提高自身免疫力及維持免疫平衡。而蒙脫石起作用取決于它的吸附性能和膠凝特性：蒙脫石吸附于消化道黏膜并吸附固定病原微生物，使其破裂、脫水以至滅活，平衡正常菌群，提高消化道的免疫功能；同時(shí)在腸道中吸附其所產(chǎn)生的毒素，隨糞便排出體外，消除病源，使機(jī)體處于有利環(huán)境中；另外，蒙脫石可與消化道黏液蛋白靜電結(jié)合，增加消化道黏液量并改善黏液質(zhì)量，提高黏液的內(nèi)聚力和彈性，從而對(duì)消化道黏膜起保護(hù)和修復(fù)作用，抵抗外來(lái)致病因子的侵入[30]。唐小懿等[22]在斷奶仔豬飼料中添加蒙脫石和酵母培養(yǎng)復(fù)合物，其顯著提高了仔豬血清超氧化物歧化酶活性，提高了仔豬的免疫功能和抗氧化能力。雜交鱘飼料中添加1.0%的蒙脫石，血液呼吸爆發(fā)水平和血漿丙二醛含量達(dá)到最高，超過(guò)1.0%時(shí)，呼吸爆發(fā)水平不升反降，當(dāng)達(dá)到5%時(shí)，高劑量的蒙脫石造成肝臟和腸道組織損傷及部分細(xì)胞破裂，導(dǎo)致血漿丙二醛含量上升[14]。本試驗(yàn)中，添加0.40%的蒙脫石仿刺參體腔液超氧化物歧化酶和堿性磷酸酶活性達(dá)到最高，仿刺參體腔液溶菌酶活性則在添加量達(dá)到0.60%時(shí)出現(xiàn)高值；仿刺參免疫水平達(dá)到較高水平后，隨著蒙脫石添加量的增加逐漸下降，增加至0.80%時(shí)，仿刺參體腔液超氧化物歧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶活性下降，未出現(xiàn)上升情況。這與雜交鱘[14]的情況不同，可能0.80%蒙脫石的添加量仍未超出機(jī)體的承受范圍，僅加重了仿刺參腸道負(fù)擔(dān)，未出現(xiàn)組織損傷和體腔液免疫細(xì)胞破裂情況，僅影響了機(jī)體免疫水平的表達(dá)，表現(xiàn)為免疫力下降，仿刺參抗病能力減弱。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼料中添加適量的蒙脫石可顯著提高仿刺參對(duì)飼料的干物質(zhì)表觀消化率，提高仿刺參腸道消化酶活性，增強(qiáng)仿刺參免疫力，促進(jìn)仿刺參生長(zhǎng)，飼料中蒙脫石適宜量為0.20%～0.60%，若考慮使用蒙脫石的長(zhǎng)久性，仿刺參飼料中蒙脫石的最適添加量為0.40%。