2種抗雌激素藥物對(duì)雄性中華鱉脂代謝的影響

汪桂宇，王璐明，巫旗生，岑雙雙，馬 曉，李學(xué)軍

( 1.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361000 )

雌激素功能廣泛，是非哺乳脊椎動(dòng)物性別分化的關(guān)鍵，也參與動(dòng)物機(jī)體脂代謝。雌激素促進(jìn)肝臟中甘油三酯、膽甾醇酯、游離脂肪酸的合成，并組裝成極低密度脂蛋白[1-2]。雌激素失調(diào)會(huì)影響脂肪細(xì)胞分化、脂解作用和脂質(zhì)合成[3]。由芳香化酶基因(Cyp19a1基因)編碼的芳香化酶，是雄烯二酮、睪酮轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇的關(guān)鍵酶[4-5]。Cyp19a1基因敲除的小鼠會(huì)產(chǎn)生性逆轉(zhuǎn)，同時(shí)腹部和肝臟部位的脂肪含量明顯增加[6]。此外，高脂飲食也會(huì)導(dǎo)致雄性小鼠脂肪組織芳香化酶的表達(dá)量增加，引起機(jī)體雌激素水平升高[7]。以上結(jié)果表明，芳香化酶在雌激素脂代謝中扮演著重要角色[8]。

雌激素受體拮抗劑是一種甾體類選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雌激素受體的特異性拮抗劑[9]。有研究報(bào)道，雌二醇通過激活腦內(nèi)雌激素受體抑制女性的進(jìn)食行為。去卵巢的雌性大鼠后腦灌注雌激素受體拮抗劑，可明顯減弱雌二醇對(duì)食物攝取的抑制作用[10]。來曲唑作為人工合成的第3代非甾體類選擇性芳香化酶抑制劑被廣泛應(yīng)用于性別分化相關(guān)研究[11]。芳香化酶抑制劑和激素受體拮抗劑處理試驗(yàn)結(jié)果一致，均可改變大鼠性別[12]。來曲唑通過結(jié)合芳香化酶中亞鐵血紅素的鐵原子，抑制芳香化酶活性，進(jìn)而抑制雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，使雌激素水平下降。雌激素功能發(fā)揮需要與其受體結(jié)合，肝臟中的脂代謝基因受雌激素受體的調(diào)控[13]。因此，降低雌激素水平或干擾其作用途徑均會(huì)影響到機(jī)體脂代謝水平。

中華鱉(Pelodiscussinensis)屬爬行綱龜鱉目鱉科鱉屬[14]，俗稱水魚、甲魚、團(tuán)魚等，是我國重要的特種經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)物之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[15]。雄性中華鱉具有生長速度快、抗逆性強(qiáng)、裙邊寬厚等優(yōu)點(diǎn)[16]，因此性腺分化與發(fā)育是中華鱉相關(guān)研究的重要內(nèi)容[17]。通過抑制雌激素合成培育出全雄個(gè)體，是魚類單性育種的主要手段[18]。芳香化酶在暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)雌性性腺分化功能維持上發(fā)揮重要作用[19]。利用芳香化酶抑制劑來曲唑，降低暗紋東方鲀稚魚性腺型芳香化酶的基因表達(dá)，導(dǎo)致雌性稚魚的性逆轉(zhuǎn)[20]。中華鱉性別分化過程中，雌激素合成關(guān)鍵基因芳香化酶表達(dá)降低，也可以培育性逆轉(zhuǎn)的雄性個(gè)體[16]。然而，雌激素分布于動(dòng)物多個(gè)器官，具有多重功能。有研究表明，雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致雌性斑馬魚(Daniorerio)體內(nèi)脂代謝失調(diào)[21-23]，但其他水產(chǎn)動(dòng)物脂代謝的相關(guān)研究尚少。

脂肪在中華鱉生長發(fā)育和生殖發(fā)育過程中必不可少。據(jù)報(bào)道，性成熟的關(guān)鍵時(shí)期，2齡中華鱉，生殖性腺增長增大，雄鱉睪酮和雌二醇合成量達(dá)到峰值[8]。其中，雌二醇是雄性性腺發(fā)育過程中的重要雌激素。雌激素受體拮抗劑與芳香化酶抑制劑2種藥物能分別阻斷雌激素與受體結(jié)合及雌激素合成，通過影響雌激素的功能影響性腺發(fā)育，改變性腺對(duì)脂類物質(zhì)的需求，從而影響中華鱉的脂肪代謝。

為探究中華鱉雌激素和脂代謝的關(guān)系，筆者在雄性中華鱉腹腔中注射芳香化酶抑制劑和雌激素受體拮抗劑，分析肝臟組織形態(tài)和Cyp19a1基因、脂代謝基因(Fas、Scd、Pparγ、Bmp4、Stat3基因)表達(dá)變化，討論中華鱉體內(nèi)雌激素缺乏后對(duì)脂代謝的影響，為后續(xù)采用性激素誘導(dǎo)、基因編輯等技術(shù)培育全雄個(gè)體提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 雌激素受體拮抗劑和芳香化酶抑制劑處理

試驗(yàn)用健康2齡雄性中華鱉(300～350 g)取自固始縣晨源水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，飼養(yǎng)在河南師范大學(xué)水產(chǎn)基地。設(shè)置對(duì)照組、高劑量組和低劑量組3組，每組5只中華鱉。分別使用7、14 mg/(kg·d)的雌激素受體拮抗劑(索萊寶，中國)和5、10 mg/(kg·d)來曲唑試劑(索萊寶，中國)對(duì)中華鱉進(jìn)行腹腔注射。處理組以二甲基亞砜作為溶劑[24]，對(duì)照組注射等體積的二甲基亞砜。每周對(duì)中華鱉進(jìn)行腹腔注射1次，雌激素受體拮抗劑注射6周，芳香化酶抑制劑注射7周；采樣前禁食12 h，于雌激素受體拮抗劑處理后1、4、42 d和芳香化酶抑制劑處理后1、2、3、49 d收集肝臟組織，對(duì)照組分別在處理后1、2、3、4、42、49 d收集樣品。冰上進(jìn)行取樣，樣品經(jīng)液氮快速冷凍，-80 ℃儲(chǔ)存。取雌激素受體拮抗劑處理后的肝臟組織，保存在多聚甲醛溶液中備用。

1.2 油紅O染色

肝臟組織在多聚甲醛溶液中固定24 h，冰凍切片包埋劑包埋后，進(jìn)行冷凍切片，切片厚15 μm。切片復(fù)溫干燥，用體積分?jǐn)?shù)10%的福爾馬林固定15 min，蒸餾水沖洗，用體積分?jǐn)?shù)60%的異丙醇內(nèi)浸洗20～30 s晾干。再將切片組織放入新鮮過濾的油紅O工作液中浸染8～10 min(加蓋避光)，60%異丙醇清洗，去除染液。Mayer蘇木精染色液復(fù)染1～2 min，純水浸洗后，用體積分?jǐn)?shù)1%的鹽酸溶液分化，蒸餾水清洗。稀碳酸鋰溶液促藍(lán)，沖洗后鏡檢。甘油明膠或阿拉伯糖膠封固后，使用Leica DM 60008顯微鏡觀察并拍照。

1.3 總RNA提取

Trizol法提取肝臟組織總RNA，1%體積分?jǐn)?shù)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，紫外分光光度法測定濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)獲得第一鏈cDNA，以1 μg 總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量分析

相關(guān)基因引物根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中華鱉基因組序列設(shè)計(jì)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物(表1)。Gapdh基因作內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，試驗(yàn)流程參照Bio-Rad SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定試劑盒的操作說明。熒光定量PCR反應(yīng)體系(10 μL)：2×SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，大連)5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

用2-ΔΔCt法計(jì)算熒光定量相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。運(yùn)用SPSS 20.0軟件對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)通過后進(jìn)行雙因素方差分析，顯著性差異水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量的雌激素受體拮抗劑處理后油紅O染色結(jié)果

經(jīng)雌激素受體拮抗劑處理的肝臟組織，冷凍切片油紅O染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察。肝臟組織內(nèi)脂滴被親脂的油紅O著色而呈鮮紅色，細(xì)胞核因蘇木精著色而呈藍(lán)色(圖1)。由圖1a、b可見，經(jīng)染色后，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)無色。雌激素受體拮抗劑處理后，脂滴呈深紅色。低劑量雌激素受體拮抗劑處理組的脂滴在胞質(zhì)內(nèi)的積累量明顯增加(圖1c、d)。高劑量雌激素受體拮抗劑處理組的脂肪細(xì)胞體積顯著增大(圖1e、f)。

圖1 不同劑量雌激素受體拮抗劑處理肝臟組織

2.2 芳香化酶抑制劑與雌激素受體拮抗劑處理對(duì)肝臟內(nèi)雌激素代謝基因表達(dá)的影響

不同劑量的雌激素受體拮抗劑處理后1 d，隨劑量增加Cyp19a1基因表達(dá)量降低，處理后4、42 d，隨劑量增加Cyp19a1基因表達(dá)量顯著升高(P<0.05，圖2a)。芳香化酶抑制劑處理后1 d，低劑量組表達(dá)量降低，高劑量組表達(dá)量升高；處理后2 d，低劑量組顯著升高，高劑量組降低(P<0.05)；處理后3 d，處理組的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；處理后49 d，低劑量組表達(dá)量升高，高劑量組表達(dá)量降低(P<0.05，圖2b)。

圖2 芳香化酶抑制劑和雌激素受體拮抗劑注射雄鱉后Cyp19a1基因表達(dá)

2.3 芳香化酶抑制劑與雌激素受體拮抗劑處理對(duì)脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

雌激素受體拮抗劑處理后1、4 d，處理組Fas基因表達(dá)量降低，42 d后處理組表達(dá)量顯著升高(P<0.05，圖3a)。同樣，在雌激素受體拮抗劑處理42 d后處理組Pparγ基因表達(dá)量顯著升高(P<0.05，圖3b)。雌激素受體拮抗劑處理后1 d，隨劑量增加Scd基因表達(dá)量降低，4 d后，低劑量組Scd基因表達(dá)量升高，高劑量組表達(dá)量降低，42 d后處理組表達(dá)量均顯著升高(P<0.05，圖3c)。雌激素受體拮抗劑處理后42 d，隨劑量增加，Stat3基因表達(dá)量顯著升高，處理組Bmp4基因的表達(dá)量也顯著升高(P<0.05，圖3d、e)。

圖3 雌激素受體拮抗劑處理后脂代謝基因表達(dá)

芳香化酶抑制劑處理后1、2、3 d，隨劑量增加Fas基因表達(dá)量顯著升高，49 d后低劑量組Fas基因表達(dá)量升高，高劑量組表達(dá)量無顯著差異(P<0.05，圖4a)。芳香化酶抑制劑處理后2、3 d，高劑量組Pparγ基因表達(dá)量顯著升高(P<0.05，圖4b)。經(jīng)過芳香化酶抑制劑處理后1、2 d，處理組Scd基因表達(dá)量顯著升高(P<0.05，圖4c)。芳香化酶抑制劑處理后2 d，隨劑量增加Stat3基因表達(dá)量顯著升高(P<0.05，圖4d)。芳香化酶抑制劑處理后3 d，處理組Bmp4基因表達(dá)量顯著升高(P<0.05，圖4e)。

圖4 芳香化酶抑制劑處理后脂代謝基因表達(dá)

3 討 論

3.1 雌激素缺乏對(duì)雄性中華鱉脂代謝的作用

雌激素在動(dòng)物體內(nèi)有廣泛的生理功能，也是非哺乳動(dòng)物性別分化的關(guān)鍵影響因素。雌激素及其編碼基因(Cyp19a1基因)是水產(chǎn)動(dòng)物育種研究中的關(guān)鍵基因，通過抑制雌激素功能發(fā)揮或降低Cyp19a1基因表達(dá)，均會(huì)導(dǎo)致遺傳雌性個(gè)體性腺分化過程發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。因此，可以通過降低激素水平或編輯Cyp19a1基因培育全雄群體，但雌激素缺乏對(duì)雄性個(gè)體的影響研究尚少。筆者通過腹腔注射芳香化酶抑制劑和雌激素受體拮抗劑，研究雌激素缺乏后雄性中華鱉脂代謝的變化，為后續(xù)中華鱉全雄群體的培育和養(yǎng)殖提供參考。

3.2 雌激素受體拮抗劑處理后中華鱉肝臟組織脂滴形態(tài)變化

雌激素對(duì)動(dòng)物脂代謝有重要的調(diào)控作用。在裸鼠中，高雌激素環(huán)境脂肪細(xì)胞體積顯著減小，低雌激素環(huán)境脂肪細(xì)胞肥大[25]。雌激素受體拮抗劑處理后雄性體內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生脂肪堆積[26]。本試驗(yàn)中，雌激素受體拮抗劑處理后，中華鱉肝臟組織中形成明顯的脂滴，脂肪含量增加，脂肪細(xì)胞體積增大，且高劑量組的脂滴含量明顯高于低劑量組。這一結(jié)果表明，雌激素受體拮抗劑處理后中華鱉體內(nèi)出現(xiàn)了脂肪積聚，且呈劑量效應(yīng)。

3.3 雌激素受體拮抗劑處理后Cyp19a1基因和脂代謝相關(guān)基因表達(dá)模式

為研究雌激素受體拮抗劑處理對(duì)脂肪合成和分解代謝的影響，筆者通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析相關(guān)基因表達(dá)。Fas、Pparγ、Scd和Stat3基因是脂代謝過程中脂肪沉積的相關(guān)基因，分別調(diào)控甘油三酯的合成、肌內(nèi)脂肪的含量、單不飽和脂肪酸的合成及脂肪的合成，Bmp4基因參與脂肪的分解過程[27-31]。不同劑量雌激素受體拮抗劑處理1 d后，隨劑量增加Cyp19a1基因表達(dá)量降低，可能是由于雄鱉體內(nèi)雌激素合成減少所致，這與姚亞運(yùn)等[23]在斑馬魚中的相關(guān)研究結(jié)果一致。處理4、42 d后，隨劑量增加Cyp19a1基因表達(dá)量反而顯著上升(P<0.05)，可能是藥物處理導(dǎo)致雄鱉體內(nèi)雌激素缺乏，動(dòng)物機(jī)體出現(xiàn)的反饋機(jī)制。兩種劑量的雌激素受體拮抗劑均引起Fas基因表達(dá)量的顯著升高，促進(jìn)體內(nèi)甘油三酯合成，增加脂肪沉積。1、4 d處理組Fas基因表達(dá)量降低，可能是Cyp19a1基因表達(dá)降低所引起的反饋調(diào)節(jié)。1、4 d處理組基因Pparγ基因和Stat3基因在高劑量組中表達(dá)量顯著升高，Scd基因和Bmp4基因在處理42 d后的低劑量組中表達(dá)量顯著升高，高劑量表達(dá)量低于劑量組，表明不同劑量的芳香化酶抑制劑處理對(duì)脂肪調(diào)節(jié)代謝有顯著性差異。42 d后處理組Fas基因表達(dá)量增加，肝組織脂肪沉積，這與肝臟組織油紅O染色后觀察結(jié)果一致。處理后42 d，脂肪分解相關(guān)的Bmp4基因表達(dá)量升高，脂肪沉積相關(guān)的Scd、Pparγ和Stat3基因表達(dá)量增加。這與Phrakonkham等[32]研究結(jié)果一致，雌激素干擾后，F(xiàn)as基因和Pparγ基因的表達(dá)量均上調(diào)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，雌激素受體拮抗劑處理后中華鱉肝臟脂肪分解和合成代謝增強(qiáng)，脂肪含量增加。

3.4 芳香化酶抑制劑處理后Cyp19a1基因和脂代謝相關(guān)基因表達(dá)模式

來曲唑芳香化酶抑制劑處理雄性中華鱉后，其芳香化酶活性降低，導(dǎo)致成熟精子數(shù)目減少[33]。本試驗(yàn)中，芳香化酶抑制劑處理后49 d，低劑量組Cyp19a1基因表達(dá)量升高，高劑量組Cyp19al基因表達(dá)量降低，表明雌激素的合成途徑受到影響，且呈劑量效應(yīng)。Fas、Scd和Pparγ基因在芳香化酶抑制劑處理1、2、3 d后表達(dá)量呈上升趨勢，表明甘油三酯和單不飽和脂肪酸合成增加，肌內(nèi)脂肪含量增加。Stat3基因在芳香化酶抑制劑處理2 d后隨劑量增加表達(dá)量顯著升高，Bmp4基因在處理2 d后表達(dá)量升高，3 d后表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。芳香化酶抑制劑處理后1、2、3 d脂代謝相關(guān)基因的高表達(dá)，說明芳香化酶抑制劑處理前期引起脂肪積累。芳香化酶抑制劑處理后49 d，Pparγ、Stat3和Bmp4基因表達(dá)量降低，表明芳香化酶抑制劑處理后期脂代謝積累調(diào)控途徑受到抑制。Fas基因在低劑量組和Scd基因在高劑量組中的表達(dá)量升高，表明芳香化酶抑制劑的劑量干擾脂肪代謝情況，低劑量組和高劑量組均有脂肪積累。芳香化酶抑制劑和雌激素受體拮抗劑在脂代謝調(diào)控中的差異，說明雌激素介導(dǎo)的脂肪代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與體內(nèi)的雌激素濃度或受抑制程度顯著相關(guān)，但具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

使用抗雌激素藥物會(huì)使雄性中華鱉脂代謝紊亂，導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂肪的積聚。雌激素受體拮抗劑處理后中華鱉肝臟脂肪分解和合成代謝增強(qiáng)，脂肪含量增加。芳香化酶抑制劑的劑量干擾脂肪代謝情況，低劑量組和高劑量組均有脂肪積累，說明這種代謝紊亂受抗雌激素藥物濃度的影響。筆者探究了中華鱉脂肪代謝調(diào)控的途徑過程，雌激素及其受體與脂肪代謝的相關(guān)調(diào)節(jié)過程，結(jié)果可為培育高質(zhì)量“全雄鱉”提供理論依據(jù)。