異齒裂腹魚(yú)Clock基因cDNA的克隆與組織表達(dá)特征

周建設(shè)，扎西拉姆，王萬(wàn)良，孫帥杰，張 馳

( 1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850032； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450002 )

季節(jié)性繁殖周期包括性腺組織的年再生，主要由激素調(diào)節(jié)途徑介導(dǎo)[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，節(jié)律性和繁殖行為是互相關(guān)聯(lián)的，生物鐘定時(shí)系統(tǒng)通過(guò)激素和神經(jīng)途徑影響多種生理系統(tǒng)，生物鐘基因表達(dá)的中斷會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物模型的繁殖行為和代謝變化，生物鐘還影響著多種生殖激素的血清濃度[2]。魚(yú)類(lèi)同其他脊椎動(dòng)物一樣，生殖腺的發(fā)育是周期性的，特定地區(qū)每年的繁殖季節(jié)固定，這便是魚(yú)類(lèi)季節(jié)性的繁殖行為[3]。異齒裂腹魚(yú)(Schizothoraxo′connori)屬裂腹魚(yú)亞科，廣布于雅魯藏布江[4]，在中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄中被評(píng)估為“無(wú)危種”，但其近緣物種如巨須裂腹魚(yú)(S.macropogon)、拉薩裂腹魚(yú)(S.waltoni)等被評(píng)估為“易危種”[5]。異齒裂腹魚(yú)集群產(chǎn)卵期為每年的3—5月[6]，表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性繁殖行為。已有大量的研究證實(shí)，魚(yú)類(lèi)繁殖行為存在節(jié)律的變化[7-8]。

Clock基因是生物鐘基因的核心基因，被認(rèn)為是自然選擇塑造日節(jié)律以及與動(dòng)物繁殖等生活史特性有關(guān)的潛在目標(biāo)基因[9]。Clock基因?yàn)楣?jié)律振蕩器編碼出Clock蛋白，在Clock蛋白的氨基酸序列中存在多個(gè)保守序列，包括C端富含谷氨酰胺(Q)的結(jié)構(gòu)域(Poly-Q)[10]，這個(gè)谷氨酰胺富集區(qū)起著轉(zhuǎn)錄激活的作用，同時(shí)C端谷氨酰胺重復(fù)區(qū)域的長(zhǎng)度決定了Clock蛋白的轉(zhuǎn)錄激活潛能[11]，因此，它可以影響與動(dòng)物晝夜節(jié)律相關(guān)的行為和生理功能[12- 13]。

研究表明，在各種有機(jī)體中，一切生理和行為都是由生物鐘控制的節(jié)律性活動(dòng)[14]，大腦以外廣泛組織生物鐘基因轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)，表明細(xì)胞節(jié)律性可能具有更廣泛的生物學(xué)意義[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Clock基因在小鼠妊娠后期的子宮胎膜和胎盤(pán)中表達(dá)，可以調(diào)控小鼠的發(fā)情周期和妊娠情況[15-16]，在家禽中Clock等節(jié)律基因能夠通過(guò)促黃體生成素調(diào)控雞的排卵時(shí)期，同時(shí)在雞胚胎發(fā)育過(guò)程也發(fā)揮作用[17-18]。也有研究表明，馬崗鵝產(chǎn)蛋高峰期Clock基因表達(dá)水平在“下丘腦-垂體-性腺”軸組織中均高于休產(chǎn)期和就巢期[19]。魚(yú)類(lèi)的生殖系統(tǒng)發(fā)育和繁殖性能跟禽類(lèi)一樣，主要受性腺軸調(diào)控[20-21]，表明Clock基因可能在調(diào)控魚(yú)類(lèi)的繁殖周期節(jié)律變化方面發(fā)揮重要作用。異齒裂腹魚(yú)在繁殖行為上表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性，Clock基因在其季節(jié)性繁殖中的調(diào)控作用有待于進(jìn)一步研究。

筆者以雅魯藏布江中的異齒裂腹魚(yú)為研究載體，克隆異齒裂腹魚(yú)Clock基因全長(zhǎng)cDNA，分析其組織表達(dá)特征，旨在探明Clock基因的組織表達(dá)模式，為從理論上揭示青藏高原裂腹魚(yú)Clock基因在季節(jié)性繁殖生理上的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用異齒裂腹魚(yú)于2019年2—3月采自雅魯藏布江拉薩流域，這個(gè)季節(jié)雅魯藏布江拉薩流域異齒裂腹魚(yú)即將進(jìn)入繁殖季節(jié)，性腺大多處于Ⅳ期[6]。該階段被認(rèn)為是人工激素誘導(dǎo)排卵的最佳階段，這個(gè)階段伴隨著卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的幾個(gè)成熟過(guò)程，直到Ⅴ期卵母細(xì)胞成熟，包括生發(fā)囊泡的破裂、染色體凝聚、減數(shù)分裂紡錘體的組裝和第一極體的形成，并受到促性腺激素(促黃體生成激素、促卵泡成熟激素)、成熟誘導(dǎo)激素和成熟促進(jìn)因子的調(diào)控，也是性腺發(fā)育過(guò)程中變化最大的一個(gè)階段[22]。

試驗(yàn)魚(yú)用魚(yú)苗袋充氧運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，放入經(jīng)過(guò)清洗消毒處理的水泥池暫養(yǎng)過(guò)夜后，用三卡因間氨苯酸乙脂甲磺酸鹽(魚(yú)安定)麻醉后解剖判定性腺發(fā)育情況，為避免性別和年齡對(duì)試驗(yàn)的影響[23]，挑選體質(zhì)量(1.42±0.23) kg、體長(zhǎng)(36.34±0.34) cm的雌性個(gè)體3尾和體質(zhì)量(0.93±0.56) kg、體長(zhǎng)(28.44±0.31) cm雄性個(gè)體3尾，性腺發(fā)育均處于Ⅳ期健康的異齒裂腹魚(yú)，采集心臟、脾臟、性腺、肝臟、肌肉和腦組織保存在液氮中，用于Clock基因全長(zhǎng)克隆和組織分布研究。

1.2 RNA提取及cDNA合成

按Trizol提取試劑盒(上海生物工程)說(shuō)明提取樣本總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，每個(gè)樣本取1 μL RNA用U-3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，要求1.82。用RevertAid Premium Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher)合成cDNA。

1.3 異齒裂腹魚(yú)Clock基因cDNA的克隆

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

以異齒裂腹魚(yú)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(PRJ NA527715)調(diào)取Clock基因編碼序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物名稱(chēng)及序列

1.3.2 Clock基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

以3′adaptor為反轉(zhuǎn)錄引物的cDNA為模版，進(jìn)行巢式PCR，反應(yīng)體系見(jiàn)表2，反應(yīng)程序見(jiàn)表3。以特異性引物RC595-RT1/RC595-RT2反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，經(jīng)RNase H和TdT處理后，進(jìn)行巢氏PCR，反應(yīng)體系見(jiàn)表2，反應(yīng)程序見(jiàn)表3。

表2 3′RACE和5′RACE反應(yīng)體系 μL

表3 PCR反應(yīng)程序

巢式PCR結(jié)果以1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。目的片段連接轉(zhuǎn)化后，將克隆送上海生物工程測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用軟件DNAMAN 8.0拼接。

1.4 異齒裂腹魚(yú)Clock基因組織分布特征

雌、雄異齒裂腹魚(yú)各3尾采集的心臟、脾臟、性腺、肝臟、肌肉和腦組織，按1.2所述合成cDNA，使用Oligo軟件設(shè)計(jì)特異性引物(clock-qPCR-f：5′-GCCACCTTCGCACAAGACC-3′；clock-qPCR-r：5′-ATAACTGCACCACACGCCAT-3′)，并以異齒裂腹魚(yú)β-actin序列設(shè)計(jì)內(nèi)參引物(β-actin-f：5′-CCCAGAGGAGCACCCCGTC-3′;β-actin-r：5′-AC GACCAGAGGCATACAGGGACA-3′)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系為20 μL，其中：2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，引物(樣本引物：clock-qPCR-f和clock-qPCR-r；內(nèi)參引物：β-actin-f和β-actin-r)各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以縮小系統(tǒng)誤差。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析，Clock基因各組織相對(duì)表達(dá)量的定量結(jié)果通過(guò)SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

使用MEGA 6.0，鄰接法構(gòu)建異齒裂腹魚(yú)Clock蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，檢驗(yàn)各分支的置信度用自舉法重復(fù)1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 異齒裂腹魚(yú)Clock基因cDNA的克隆

通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得異齒裂腹魚(yú)Clock基因cDNA 5′端和3′端(圖1)。拼接后Clock基因cDNA全長(zhǎng)為4291 bp，5′非編碼區(qū)為539 bp、3′非編碼區(qū)為1046 bp、編碼區(qū)為2706 bp，異齒裂腹魚(yú)clock基因cDNA全長(zhǎng)已上傳至Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)(MT774361)。異齒裂腹魚(yú)Clock基因cDNA序列含有起始密碼子ATG及3′端Poly(A)結(jié)構(gòu)，表明克隆到的異齒裂腹魚(yú)Clock基因核苷酸信息完整。

圖1 巢式PCR電泳結(jié)果

2.2 異齒裂腹魚(yú)Clock基因及蛋白序列分析

異齒裂腹魚(yú)Clock基因共編碼901個(gè)氨基酸(圖2)，所編碼的氨基酸與其他脊椎動(dòng)物Clock蛋白一樣，在末端具有典型的Poly-Q結(jié)構(gòu)。與其他魚(yú)類(lèi)相比，異齒裂腹魚(yú)和尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewarti)的Clock蛋白存在大片段的插入，尤以尖裸鯉為典型。通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的BLAST分析，選取白甲魚(yú)(Onychostomamacrolepis)、金魚(yú)(Carassiusauratus)、撫仙金線鲃(Sinocyclocheilusgrahami)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)等18種魚(yú)Clock蛋白的氨基酸序列構(gòu)建鄰接樹(shù)(圖3)，與物種進(jìn)化程度一致，異齒裂腹魚(yú)Clock蛋白與白甲魚(yú)Clock蛋白具有較高的同源性。

圖2 異齒裂腹魚(yú)Clock基因推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 異齒裂腹魚(yú)Clock基因推導(dǎo)的蛋白序列與近源種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 異齒裂腹魚(yú)Clock基因在不同組織中的表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)Clock基因在異齒裂腹魚(yú)心臟、脾臟、性腺、肝臟、肌肉和腦中的表達(dá)分布情況，結(jié)果見(jiàn)圖4，其中，性腺組織的Clock基因表達(dá)量在雌魚(yú)和雄魚(yú)間差異顯著(P<0.05)，肌肉、全腦、肝臟、心臟和脾臟組織的Clock基因在雌、雄個(gè)體間差異不顯著(P>0.05)，除心臟組織的Clock基因相對(duì)表達(dá)量雄魚(yú)高于雄魚(yú)外，其他組織的相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)為雌魚(yú)高于雄魚(yú)。在雌魚(yú)中，性腺和肌肉、全腦和肝臟、心臟和脾臟組織中Clock基因的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，其余組織之間表達(dá)量差異極顯著或顯著(P<0.01，P<0.05)。以性腺中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他組織的相對(duì)表達(dá)量；其次為肌肉組織，其相對(duì)表達(dá)量顯著低于性腺組織，顯著高于其他組織；全腦中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于性腺和肌肉，顯著高于脾臟和心臟。在雄魚(yú)中，肝臟和心臟、肝臟和全腦、心臟和全腦、性腺和肌肉中Clock基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，其余組織之間表達(dá)量差異極顯著或顯著(P<0.01；P<0.05)；以性腺中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于除肌肉外的其他組織；脾臟組織相對(duì)表達(dá)量最低，顯著低于其他組織。

圖4 異齒裂腹魚(yú)Clock基因在不同組織中的表達(dá)情況

3 討 論

3.1 異齒裂腹魚(yú)Clock基因結(jié)構(gòu)特征

Clock基因是產(chǎn)生生物節(jié)律的核心基因[24-25]，異齒裂腹魚(yú)Clock基因編碼的Clock蛋白分子式為C4389H6978N1278O1405S37，為疏水性蛋白，與多個(gè)時(shí)鐘相關(guān)的蛋白互作，在物種進(jìn)化上與撫仙金線鲃Clock蛋白具有較高的同源性[26]，筆者通過(guò)構(gòu)建鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，異齒裂腹魚(yú)Clock蛋白與白甲魚(yú)Clock蛋白在進(jìn)化上有較近的關(guān)系，其次為金線鲃屬魚(yú)類(lèi)。武云飛[27]通過(guò)對(duì)裂腹魚(yú)類(lèi)和鲃亞科魚(yú)類(lèi)的外部形態(tài)、主要骨骼結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)比較后，認(rèn)為裂腹魚(yú)類(lèi)與鲃亞科魚(yú)類(lèi)有著極近的親緣關(guān)系。本研究中，克隆到的Clock基因cDNA全長(zhǎng)4291 bp，編碼區(qū)為2706 bp，編碼901個(gè)氨基酸；金線鲃魚(yú)類(lèi)Clock基因編碼區(qū)全長(zhǎng)2676 bp，編碼892個(gè)氨基酸，與其他物種Clock蛋白相似。異齒裂腹魚(yú)Clock蛋白在C端富含谷氨酰胺(Q)的結(jié)構(gòu)域(Poly-Q)，共有44個(gè)谷氨酰胺；金線鲃Clock蛋白C端共有45個(gè)谷氨酰胺。有些物種的Ploy-Q長(zhǎng)度隨緯度梯度的變化而變化，重要的是Poly-Q長(zhǎng)度和緯度梯度變化與繁殖啟動(dòng)的時(shí)間相關(guān)，緯度越高，Poly-Q長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)[28]。有研究表明：Clock蛋白Poly-Q片段越短，亞洲短趾百靈(Calandrellaoheleensis)產(chǎn)卵開(kāi)始的時(shí)間越早；而Poly-Q片段越長(zhǎng)，產(chǎn)卵開(kāi)始時(shí)間越晚[29]。O′Malley等[30]研究指出，Clock基因的變異拷貝數(shù)在秋季和春季產(chǎn)卵的大鱗大麻哈魚(yú)(Oncorhynchustshawytscha)之間頻率顯著不同。異齒裂腹魚(yú)集中產(chǎn)卵時(shí)間集中在每年的3—5月，即使同一棲息地的異齒裂腹魚(yú)產(chǎn)卵時(shí)間也不盡相同，在個(gè)體水平上，魚(yú)類(lèi)同一種群內(nèi)的不同個(gè)體繁殖時(shí)間也有差異，這便是表型多態(tài)性[29]。表型的多態(tài)范圍可能是物種應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)[31]。從異齒裂腹魚(yú)分布范圍來(lái)看，雅魯藏布江下游群體產(chǎn)卵開(kāi)始時(shí)間早于中游和上游，這是由不同江段的水溫決定的，水溫越高產(chǎn)卵開(kāi)始時(shí)間就越早[6]。而實(shí)際上，在同一江段群體中，雖然具有比較一致的溫度環(huán)境，但個(gè)體的產(chǎn)卵時(shí)間也有差異。因此，探討魚(yú)類(lèi)生殖節(jié)律表現(xiàn)出來(lái)的個(gè)體差異是否與內(nèi)在的遺傳機(jī)制有關(guān)，對(duì)于了解魚(yú)類(lèi)季節(jié)性繁殖行為能否通過(guò)微進(jìn)化的方式應(yīng)對(duì)環(huán)境變化具有現(xiàn)實(shí)意義[29]。異齒裂腹魚(yú)個(gè)體之間繁殖啟動(dòng)時(shí)間的差異可能與Clock基因所編碼的蛋白C末端Poly-Q長(zhǎng)度的變異有關(guān)，Poly-Q在許多轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活中起作用[32]。同時(shí)，值得注意的是，通過(guò)比較幾種魚(yú)類(lèi)Clock基因所編碼的蛋白序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，與其他魚(yú)類(lèi)相比，異齒裂腹魚(yú)和尖裸鯉的Clock蛋白存在大片段的插入，尤以尖裸鯉為典型。曹文宣等[33]將裂腹魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)劃分成適應(yīng)于高原環(huán)境的3個(gè)特化等級(jí)，其中裂腹魚(yú)屬為原始等級(jí)，尖裸鯉屬為高度特化等級(jí)。不同等級(jí)的3個(gè)類(lèi)群分布的海拔與每次高原隆起后達(dá)到的高度大體一致。從資源調(diào)查的結(jié)果看[34]，尖裸鯉的分布范圍最窄，僅在雅魯藏布江的仁布江段以上采集到，而異齒裂腹魚(yú)在整個(gè)雅魯藏布江中游均有分布。提示Clock蛋白在尖裸鯉和異齒裂腹魚(yú)中大片段的插入可能是為了適應(yīng)高海拔某些條件而特化的。

3.2 異齒裂腹魚(yú)Clock基因組織表達(dá)特征

Clock基因廣泛分布于動(dòng)物的各個(gè)器官組織中。筆者通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了Clock基因在異齒裂腹魚(yú)雌、雄個(gè)體肝臟、脾臟、心臟、腦、性腺和肌肉中的表達(dá)情況。Clock基因在雌、雄異齒裂腹魚(yú)以上組織中都有表達(dá)，這一結(jié)果與其他物種(小鼠[35]、果蠅[36]、斑馬魚(yú)[37]和人[38])的研究結(jié)果一致。在果蠅中，自主的生理節(jié)律振蕩器存于全身[39]，說(shuō)明異齒裂腹魚(yú)中心生物鐘和外周生物鐘也是同時(shí)存在的。本研究中，Clock基因在雌、雄個(gè)體性腺中的表達(dá)量均顯著高于其他組織，表明相對(duì)其他組織而言，Clock基因可能在調(diào)節(jié)異齒裂腹魚(yú)的繁殖方面發(fā)揮作用。也有研究證實(shí)，Clock基因的突變會(huì)打亂小鼠的發(fā)情周期[40]；Clock基因的突變可影響雌性果蠅的生殖健康和減少雄性果蠅精子輸出量[41]；Clock基因的突變可能會(huì)通過(guò)改變生物體對(duì)日節(jié)律的感知而對(duì)發(fā)情周期產(chǎn)生多重效應(yīng)，進(jìn)而影響交配時(shí)間[42]；通過(guò)候選基因定位方法，對(duì)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)產(chǎn)卵時(shí)間的QTL數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Clock基因明顯定位于虹鱒產(chǎn)卵時(shí)間的QTL區(qū)域內(nèi)[43]。Clock基因在異齒裂腹魚(yú)性腺中的高表達(dá)進(jìn)一步提示，異齒裂腹魚(yú)繁殖時(shí)間在性腺?zèng)Q定的基礎(chǔ)上，還受Clock基因的微調(diào)影響。這種調(diào)控可能與其產(chǎn)卵開(kāi)始時(shí)間關(guān)聯(lián)，而異齒裂腹魚(yú)Clock基因Poly-Q長(zhǎng)度的變異與其繁殖啟動(dòng)時(shí)間是否存在特定關(guān)系，及異齒裂腹魚(yú)Clock基因在不同季節(jié)各組織中的表達(dá)特征等，還有待進(jìn)一步開(kāi)展的工作。本研究中，異齒裂腹魚(yú)雌魚(yú)和雄魚(yú)肌肉組織中Clock基因的表達(dá)量?jī)H次于性腺組織且差異不顯著，但極顯著高于其他組織，這一結(jié)果與同樣重要的內(nèi)源性生物鐘基因之一的Timeless基因在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[44]成蟹時(shí)期的表達(dá)情況一致，Timeless基因在成蟹時(shí)期的脂類(lèi)儲(chǔ)存和脂類(lèi)加工的重要器官中大量表達(dá)，以有效調(diào)控中華絨螯蟹在生殖洄游過(guò)程中的能量分配。魚(yú)類(lèi)的繁殖是一個(gè)耗能過(guò)程，而肌肉組織是機(jī)體貯存能量的重要場(chǎng)所，在功能上主要承擔(dān)機(jī)體能量代謝、運(yùn)動(dòng)、有氧呼吸等[45]，在魚(yú)類(lèi)繁殖過(guò)程中尤其是雌性個(gè)體，肌肉和性腺組織生物過(guò)程上的某些同步性是繁殖過(guò)程中能量供給的保障。Clock基因在雌魚(yú)性腺中的表達(dá)量顯著高于雄魚(yú)性腺，也進(jìn)一步說(shuō)明Clock基因在魚(yú)類(lèi)的繁殖過(guò)程中對(duì)雌魚(yú)的調(diào)控作用更加顯著。在生物鐘環(huán)路中，Clock基因編碼的蛋白與Bmal1基因編碼的蛋白形成異源二聚體，在時(shí)鐘基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到正向調(diào)控作用[46-48]，謝偉等[49]關(guān)于克氏原螯蝦Cyc基因(Bmal1基因在脊椎動(dòng)物中的同源基因)的研究結(jié)果表明，Clock基因與Bmal1基因具有相似的mRNA表達(dá)水平，并受腦組織的支配，這與本研究中Clock基因在雌、雄魚(yú)全腦組織中相對(duì)表達(dá)量雖然差異不顯著，但雌魚(yú)高于雄魚(yú)的趨勢(shì)明顯這一結(jié)果基本符合，說(shuō)明Clock基因在調(diào)控魚(yú)類(lèi)繁殖節(jié)律的過(guò)程中受腦組織的支配。

4 結(jié) 論

筆者克隆了異齒裂腹魚(yú)Clock基因cDNA全長(zhǎng)，其所編碼的氨基酸在末端具有典型的Poly-Q結(jié)構(gòu)；Clock基因在異齒裂腹魚(yú)雌、雄個(gè)體的肝臟、脾臟、心臟、腦、性腺和肌肉中均有表達(dá)，雌、雄魚(yú)均是以性腺中的相對(duì)表達(dá)量最高，進(jìn)一步提示Clock基因可能在異齒裂腹魚(yú)的繁殖過(guò)程中發(fā)揮更大的作用；推測(cè)異齒裂腹魚(yú)Clock蛋白C末端Poly-Q的長(zhǎng)度的變異可能與其產(chǎn)卵開(kāi)始時(shí)間關(guān)聯(lián)；Clock蛋白大片段的插入可能是為了適應(yīng)高海拔某些條件而特化的。研究結(jié)果可為揭示青藏高原裂腹魚(yú)Clock基因在季節(jié)性繁殖生理上的作用提供科學(xué)依據(jù)。