P-HPLC法同時測定不同產(chǎn)地不同采收期墨旱蓮中6種成分的含量

南敏倫，尹 涵，司學(xué)玲，司英奇，張瀚水，龔本義，趙昱瑋，赫玉芳*

（1. 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 130012；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118；3. 修正藥業(yè)集團(tuán)長春高新制藥有限公司，長春 130012；4. 吉林省奧普金鉆技術(shù)檢測服務(wù)有限公司，長春 130507；5. 長春工業(yè)大學(xué)，長春 130021；6.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

墨旱蓮為菊科植物鱧腸（Eclipta prostrataL.）的干燥地上部分[1]，又名旱蓮草、水旱蓮、豬牙草、蓮子草、黑墨草。具有滋補(bǔ)肝腎、烏須固齒、涼血止血的功效[1]，廣泛分布于廣東、廣西、江蘇、河南、福建等地。墨旱蓮化學(xué)成分包含黃酮、香豆素、三萜皂苷、有機(jī)酸類、噻吩及揮發(fā)油[2]，目前《中國藥典》2020年版僅以蟛蜞菊內(nèi)酯單一成分的含量墨旱蓮藥材的質(zhì)量進(jìn)行控制[1，3]，不能全面整體反映墨旱蓮藥材的質(zhì)量，并且對產(chǎn)地及采收期的研究相對較少。本研究針對以上情況，采集6個產(chǎn)地18批不同采收期的墨旱蓮藥材進(jìn)行系統(tǒng)研究，采用HPLC法對墨旱蓮中含有的主要成分咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯進(jìn)行含量測定[4-8]，初步揭示了不同產(chǎn)地、不同采收期墨旱蓮藥材中各成分含量有差異，為嚴(yán)格把控墨旱蓮藥材的質(zhì)量，資源合理應(yīng)用，以及該藥材更深入的開發(fā)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260（美國安捷倫公司）；BS 124S電子天平（賽得利斯）；MD-400KDE型臺式高功率數(shù)控超聲波清洗器（蘇州美達(dá)超聲儀器廠）。

1.2 試藥

咖啡酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110885-201703， 純度：99.7%）； 木犀草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111720-201609，純度：94.9%）；異綠原酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111782-201807，純度：94.3%）；異綠原酸C對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111894-202103，純度：95.2%）；木犀草素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111520-202005，純度：99.6%）；蟛蜞菊內(nèi)酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111885-202105，純度：97.2%）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)所用墨旱蓮藥材于2020年4-6月采自不同產(chǎn)地，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院趙全成研究員鑒定均為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent C18（250 mm × 4.6 mm，5 um）；流動相A相為0.3%甲酸水，B相為乙腈溶液，梯度洗脫：0～10 min A由90%降至85%；10～35 min A由85%降至75%；35～50 min A由75%降至65%；50～70 min A由60%降至30%；70～80 min A由30%降至20%；流速為0.9 mL·min-1；檢測波長為340 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。對照品及供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 六種對照品（A）及樣品（B）高效液相色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品咖啡酸10.07 mg、木犀草苷10.76 mg、異綠原酸B 10.85 mg、異綠原酸C 10.46 mg、木犀草素10.17 mg和蟛蜞菊內(nèi)酯10.36 mg，分別置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別得到6種對照品儲備液；分別精密量取咖啡酸儲備液0.25 mL，木犀草苷儲備液0.5 mL，異綠原酸B儲備液1.0 mL，異綠原酸C儲備液1.0 mL，木犀草素儲備液1.0 mL，蟛蜞菊內(nèi)酯儲備液5 mL置同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備得到每毫升含咖啡酸0.010 04 mg、木犀草苷0.020 42 mg、異綠原酸B 0.040 93 mg、異綠原酸C 0.039 83 mg、木犀草素0.040 52 mg、蟛蜞菊內(nèi)酯0.201 40 mg的對照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取墨旱蓮藥材粉末（過60目篩）1.0 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入約80%甲醇20 mL，超聲處理60 min，冷卻，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過（0.45 mm），即得。

2.4 線性關(guān)系考察

上述對照品混合溶液分別按照2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL 進(jìn)樣測定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程（見表1）。說明咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯在線性范圍內(nèi)線性良好。

表1 6個對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線 μg

2.5 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液（1號樣），連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積；咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.85%、0.64%、0.38%、0.72%、0.66%、0.76%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品（1號樣）6份，按制備方法，制備得到供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。計(jì)算結(jié)果表明，咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯含量的RSD分別為0.82%、0.64%、0.59%、1.01%、1.12%、0.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（1號樣），分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯含量的RSD分別為0.48%、0.55%、0.67%、0.84%、0.91%、0.64%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品（1號樣）6份，各0.5 g，精密稱定，分別加入適量的對照品，按供試品制備方法制備，按照色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率（見表2）?；厥章式Y(jié)果表明，6種化合物的加樣回收率良好。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地和不同采收期的墨旱蓮樣品，制備供試品溶液，測定并計(jì)算咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯的含量（見表3）。

表3 不同產(chǎn)地不同采收期墨旱蓮中6種成分的含量測定（n= 3） mg·g-1

3 討論

由于墨旱蓮藥材中化學(xué)成分含有黃酮類、有機(jī)酸類、噻吩類等[2]，化學(xué)成分具有多樣性，只采用甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)不能將有效成分進(jìn)行有效分離。經(jīng)過多次試驗(yàn)，以乙腈-0.3%甲酸水溶液為流動相，采用梯度洗脫，待測樣中咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯達(dá)到基線分離；采用340 nm為檢測波長，目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰可以達(dá)到完全分離；由于咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯等6種化合物劑型差別較大，為了能使各化合物均能完全提取出來，選用不同濃度乙醇及不同濃度甲醇對提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果表明80%甲醇提取效果更好；同時考察了超聲和回流兩種提取方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種提取方法各成分提取效率基本一致，由于超聲提取方法操作簡單，故此選擇超聲提?。惶崛r間考察結(jié)果顯示，在60 min內(nèi)各目標(biāo)化合物均可以完全提取。故本實(shí)驗(yàn)以80%甲醇為提取溶劑，提取時間為60 min。

本實(shí)驗(yàn)對不同產(chǎn)地和不同采收期的墨旱蓮藥材中的咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯進(jìn)行含量測定研究，通過實(shí)驗(yàn)看出，不同產(chǎn)地的咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯含量具有明顯的不同，同一采收期藥材江蘇宿遷含量最高。不同采收期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一產(chǎn)地5月份采收的墨旱蓮6種成分的含量最高。由于這幾個地區(qū)，墨旱蓮開花日期基本均在5月份，墨旱蓮在花開始開放還未完全開放時有效成分的含量最高，為墨旱蓮的采收期的確定奠定基礎(chǔ)。

本研究采用建立的含量測定方法對含墨旱蓮藥材中的6種成分進(jìn)行含量測定研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法適合于墨旱蓮藥材的含量測定，其分離度、耐用性等均符合規(guī)定，可以為墨旱蓮藥材的質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。